劉珍銀 段郅臻 彭婷 王童欣 王健

（1.海南大學(xué)林學(xué)院 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室 海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點實驗室，?？?570228；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025）

三角梅（Bougainvilleaspp.）具有花色豐富、花期長、抗逆性強等優(yōu)點，是南方地區(qū)城市園林綠化和家庭觀賞中不可缺少的植物之一［1］。近年來有關(guān)三角梅的研究主要集中在栽培繁殖、種質(zhì)資源、園林應(yīng)用等方面，基因功能相關(guān)研究較少。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，三角梅生長發(fā)育、葉色調(diào)控、花色調(diào)控等方面的相關(guān)基因功能開發(fā)將成為研究趨勢，簡單快速的功能驗證方法的建立變得尤為重要。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）是通過構(gòu)建攜帶目的基因的重組病毒載體侵染植株，使目標(biāo)基因表達(dá)被抑制，從而以表型變化分析基因功能的技術(shù)［2-3］。與其他基因功能研究方法相比，該方法不需要完整的基因序列，不需要遺傳轉(zhuǎn)化，周期短，操作簡單，在非模式植物研究中具有明顯優(yōu)勢［2］。煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV），作為常用的VIGS病毒載體，具有適應(yīng)宿主范圍廣、沉默持續(xù)時間長、病毒癥狀不明顯、沉默效率高等優(yōu)點［4］?；赥RV的VIGS系統(tǒng)已被應(yīng)用于多種觀賞植物的基因功能驗證［5-11］。八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵酶。PDS基因沉默會直接影響類胡蘿卜素的積累，植株會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，以表型變化評價沉默效果［12-14］。由于表型明顯，易于觀察，且適用于植株不同部位，PDS基因成為VIGS技術(shù)最常用的指示基因之一［15］。

本研究以三角梅‘金心雙色’（Bougainvillea peruviana‘Thimma’）品種為試驗材料，以PDS基因為標(biāo)記基因，TRV為病毒載體，構(gòu)建不同長度沉默基因片段的病毒重組載體，采用摩擦注射農(nóng)桿菌侵染法，探索三角梅VIGS沉默體系，旨在為后續(xù)基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗使用材料‘金心雙色’三角梅種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科基地。煙草脆裂病毒載體pTRV1、pTRV2保存于本實驗室，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞采購于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的擬南芥PDS基因序列（GenBank登錄號：NM_117498.4）和煙草PDS基因序列（GenBank登錄號：DQ469932.1），與課題組現(xiàn)有三角梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（NCBI，PRJNA812995）進(jìn)行Blast比對，獲取PDS基因片段，命名為BpPDS。在ORF框內(nèi)選取336 bp和457 bp長度的片段，參考In-fusion引物設(shè)計原則設(shè)計特異性引物，在引物上設(shè)計EcoRI酶切位點，引物由上海生工生物工程公司合成，序列見表1。

表1 本文中使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取嫩葉總RNA。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，大連）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為：2 × Phanta Max Master Mix（諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司，南京）12.5 μL、正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 1 μL，補充ddH2O至25 μL。采用Touch down PCR反應(yīng)程序，94℃ 6 min；94℃30 s，67-64℃ 30 s，72℃ 1 min，-0.5℃/循環(huán)，8個循環(huán)；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用Universal DNA純化回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）回收目的基因片段。

1.2.2 沉默載體構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶EcoRI（賽默飛世爾科技有限公司，上海）對pTRV2載體進(jìn)行單酶切，獲得pTRV2線性片段并分別純化酶切產(chǎn)物。利用In-Fusion? HD Cloning Kit試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，大連）連接目的基因片段及pTRV2線性片段，構(gòu)建pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（上海唯地生物技術(shù)有限公司），在卡那霉素（100 μmol/L）抗性篩選和菌液PCR檢測后，進(jìn)行測序驗證。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與侵染 利用凍融法，將陽性重組質(zhì)粒pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)（上海唯地生物技術(shù)有限公司），在卡那霉素（100 mg/L）和利福平霉素（20 mg/L）抗性條件和菌液PCR檢測下篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

分別培養(yǎng)含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101于YEP液體培養(yǎng)基（含100 mg/L卡那霉素和20 mg/L利福平霉素）中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.8-1.1。取菌液離心棄上清，加入現(xiàn)配侵染液（10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，148 μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌體，OD600調(diào)至約1.0。將含pTRV1的農(nóng)桿菌重懸液分別與含pTRV2（陰性對照）、重組質(zhì)粒pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457農(nóng)桿菌重懸液以1∶1的比例充分混勻，在室溫黑暗條件下靜置處理2-3 h后用于注射侵染。

注射侵染前在植株頂芽莖稈和嫩葉上制造輕微創(chuàng)傷面，將混合菌液注射進(jìn)嫩葉（頂端3-4片葉）及頂芽莖稈，并在接種部位覆蓋無菌紗布，保鮮膜包裹以保持濕潤。侵染后的植株用黑色塑料袋包裹黑暗處理24 h，隨后置于25℃、濕度60%、光周期16 h（光）/8 h（暗）條件下培養(yǎng)。在初次侵染處理一周后，對相同侵染部位進(jìn)行二次處理以保證侵染效果。觀察記錄各處理植株表型變化。

1.2.4 三角梅葉片光合色素含量測定 參考李瑞雪等［13］的方法測定對照組（pTRV2）和兩種沉默組（pTRV2-BpPDS336及pTRV2-BpPDS457）的葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量，各處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 利用快速DNA提取檢測試劑盒和RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取陰性對照組和沉默組的DNA 和RNA，分別用于載體檢測和基因表達(dá)量檢測。利用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。BpActin作為內(nèi)參基因，RT-qPCR引物序列見表1。參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京），在熒光定量PCR檢測儀（LineGene 9600，杭州博日科技股份有限公司）完成檢測，每個處理設(shè)置3個平行試驗。反應(yīng)體系（10 μL）：cDNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。溶解程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，95℃30 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 運用2-ΔΔCT方法計算目的基因相對表達(dá)量。試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計，利用SPSS 25.0對所有數(shù)據(jù)在P＜0.05水平上進(jìn)行差異分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆

由圖1可知，三角梅葉片RNA電泳結(jié)果可觀察到清晰完整的2條帶，且OD260/OD280值在1.8-2.0之間，說明RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗。

圖1 三角梅葉片總RNAFig.1 Total RNA of B.peruviana ‘Thimma’

考慮到引物5'端10 bp TRV2同源序列和6 bpEcoRI酶切位點，與336 bp的BpPDS片段相連后，片段長度為368 bp；與457 bp的BpPDS片段連接后，片段長度為489 bp。如圖2電泳圖所示，BpPDS336基因條帶位于300 bp左右，BpPDS457基因條帶接近500 bp，條帶單一清晰，且片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 目的基因片段擴(kuò)增Fig.2 Amplification of target genes

2.2 沉默載體構(gòu)建

pTRV2載體檢測引物可擴(kuò)增321 bp的條帶，重組沉默載體pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457擴(kuò)增片段分別為657 bp和778 bp。由圖3可知，電泳條帶分別在650 bp和780 bp左右，條帶單一清晰，且片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)測序與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明載體構(gòu)建成功。

圖3 目的基因TRV2載體擴(kuò)增檢測Fig.3 Detection of target genes on constructed TRV2 vector

2.3 農(nóng)桿菌侵染

在初次侵染2-3周后，頂端嫩莖侵染處理，兩種沉默組均未發(fā)現(xiàn)葉片有明顯黃化或白化現(xiàn)象。相反，在葉片侵染部位周圍顏色變淺，形成淺黃色斑塊（圖4）。陰性對照（圖4-B）同空白對照（圖4-A）無明顯顏色差異，兩個沉默處理組的葉片表型存在一定差別，pTRV2-BpPDS457（圖4-C, D）相比pTRV2-BpPDS336（圖4-E, F）侵染處理的葉片黃化效果更加明顯。

圖4 沉默三角梅BpPDS葉片表型Fig.4 Phenotype of BpPDS silenced B.peruviana ‘Thimma’

由圖5所示，利用PCR檢測pTRV1和pTRV2載體發(fā)現(xiàn)空白對照中無pTRV1和pTRV2載體；陰性對照3個樣品均在257 bp和321 bp處有清晰單一條帶，說明葉片中存在pTRV1和pTRV2載體；在pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457沉默處理組中擴(kuò)增條帶單一且與重組載體長度相符，表明pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457重組載體均成功轉(zhuǎn)入三角梅植株。

圖5 pTRV1和pTRV2病毒載體PCR檢測Fig.5 PCR amplification of virus veetor pTRV1 and pTRV2

2.4 光合色素含量檢測

由表2顯示，空白對照和陰性對照之間總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量沒有顯著差異，陰性對照與兩個沉默處理pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457之間存在顯著差異（P＜ 0.05）。兩個沉默處理之間在總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量上沒有顯著差異，但pTRV2-BpPDS457沉默處理葉片葉綠素a和葉綠素b含量相比pTRV2-BpPDS336顯著降低。綜上所述，BpPDS沉默處理會降低類胡蘿卜素和葉綠素含量的合成，與表型觀察相一致。

表2 不同處理三角梅葉片光合色素含量Table 2 Content of photosynthetic pigments in the leaves of B.peruviana ‘Thimma’ under different treatments

2.5 RT-qPCR檢測

如圖6所示，空白對照與陰性對照中BpPDS表達(dá)量之間無顯著差異，pTRV2-BpPDS336和pTRV2-BpPDS457沉默處理的葉片BpPDS基因的表達(dá)量顯著降低，其中pTRV2-BpPDS336處理的葉片中BpPDS表達(dá)量顯著降低。結(jié)果表明，三角梅PDS基因沉默體系可以有效沉默內(nèi)源BpPDS基因，沉默體系初步建立。

圖6 RT-qPCR檢測BpPDS基因相對表達(dá)量Fig.6 RT-qPCR detection of relative expression of BpPDS

3 討論

隨著三角梅測序技術(shù)的開發(fā)，更多的研究逐漸傾向于基因功能驗證［16］。三角梅作為木本植物，其穩(wěn)定遺傳體系尚不成熟，因此快速、簡便的研究方法對基因功能鑒定至關(guān)重要。VIGS作為一種快速基因分析技術(shù)，已經(jīng)成功運用在牡丹、玫瑰、觀賞海棠等木本花卉植物的基因研究中［9,17-18］。目前，三角梅VIGS體系研究尚未見報道。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，構(gòu)建三角梅VIGS體系，為三角梅基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

表型變化是檢測基因沉默效果最直觀的方法。因此，選擇合適的指示基因有助于表型觀察，可以快速建立高效的VIGS體系。PDS作為類胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因，主要在植物葉片、花瓣和果實中表達(dá)，該基因表達(dá)受阻時植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，表型直觀易觀察［13］。其他指示基因也有應(yīng)用，如鎂螯合酶（CHLH）參與葉綠素合成，基因沉默會產(chǎn)生葉片發(fā)黃表型［15］。查爾酮合成酶（CHS）參與花青素合成，基因沉默效果可通過花色變化判斷［19］?！鹦碾p色’三角梅因其特有的雙色葉片，極具觀賞價值，也將是葉色調(diào)控研究的最佳材料。在本研究中，克隆了‘金心雙色’三角梅葉片轉(zhuǎn)錄組中BpPDS基因，構(gòu)建病毒重組載體，研究基因片段大小、不同接種方法等對基因沉默效果的影響，旨在建立一套穩(wěn)定快速的三角梅沉默體系。

高效VIGS體系的建立主要包含載體構(gòu)建、侵染處理、基因沉默評價等［20］。合適的病毒載體是體系構(gòu)建成功的關(guān)鍵。目前應(yīng)用于VIGS技術(shù)的病毒載體主要有煙草花葉病毒（tomato mosaic virus,TMV）［21］、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）［22］、番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus, TGMV）［23］等。不同病毒載體接種效果和沉默效果均不同。其中，TRV病毒載體應(yīng)用較廣泛，且TRV感染引起的癥狀較輕，沉默表型相對集中且均勻［11］。在本研究中，選擇TRV病毒載體，構(gòu)建了pTRV2-BpPDS重組載體，并獲得了較均勻清晰的沉默表型的葉片，光合色素也有顯著的降低，沉默效果比較理想，說明TRV病毒載體可以應(yīng)用于三角梅沉默體系構(gòu)建。載體能否順利進(jìn)入植物并實現(xiàn)基因沉默與農(nóng)桿菌侵染體系密不可分。不同植物對農(nóng)桿菌侵染的敏感性不同［15］。珊瑚櫻VIGS體系構(gòu)建中對LBA4404和GV3101兩種農(nóng)桿菌侵染效果比較發(fā)現(xiàn)，GV3101侵染產(chǎn)生的沉默效率相對高［24］。在水稻中，LBA4404則表現(xiàn)出更強的侵染能力［25］。本試驗選用GV3101作為侵染農(nóng)桿菌，侵染處理的葉片未觀察到明顯的病菌侵染造成的萎縮或壞死情況，說明該農(nóng)桿菌適用于三角梅侵染處理。

選擇正確的目的基因片段也是確保沉默效果的關(guān)鍵因素。病毒載體中插入片段與靶基因同源性越高，基因沉默效果會越好［26］。當(dāng)基因片段不合適，會出現(xiàn)沉默基因脫靶現(xiàn)象，繼而無法獲得預(yù)期沉默表型［27］。研究表明大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus, BSMV）誘導(dǎo)小麥VIGS體系插入片段長度在120-500 bp范圍內(nèi)沉默效率高，更短或更長的片段沉默效果低［28］。TRV病毒載體誘導(dǎo)的煙草PDS基因沉默體系插入片段在192-1 304 bp內(nèi)都會出現(xiàn)葉片光漂白現(xiàn)象，長度達(dá)到1 661 bp時沉默效果明顯降低［22］。由此可知，最適插入片段要依據(jù)不同物種的特性進(jìn)行試驗和選擇以獲得最佳沉默效果。本試驗中，利用本課題組‘金心雙色’三角梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆了兩個不同長度的BpPDS插入片段，分別為336 bp和457 bp。兩個重組病毒載體均實現(xiàn)了一定的沉默效果。其中pTRV2-BpPDS457侵染處理的葉片黃化表型相對pTRV2-BpPDS336更加明顯，色素含量也相對更低，由此可見，457 bp長度的插入片段構(gòu)建的沉默載體更適用于三角梅，也對后期基因驗證中插入片段的選擇提供了一定參考。

侵染處理方法和接種部位的選擇與目的基因表達(dá)部位密切相關(guān)。常用的VIGS接種方法主要有真空滲透法［18,29］、摩擦接種法［15,24］、灌根法［30］等。Liu等［31］在枸杞VIGS體系構(gòu)建時采用的發(fā)芽種子真空滲透法相比幼苗真空深空和農(nóng)桿菌澆灌沉默效率高。Xu等［24］在珊瑚櫻VIGS體系構(gòu)建中采用摩擦加子葉注射法比發(fā)芽種子真空滲透沉默效率要高。不同物種選擇的接種方法不同，接種部位同樣影響VIGS技術(shù)的沉默效率。本試驗選用PDS基因作為沉默目標(biāo)，在綠色葉片中正常表達(dá)。因此，選擇頂端嫩莖和嫩葉作為接種對象，以摩擦注射法接種，對比兩者沉默效果發(fā)現(xiàn)頂端嫩莖接種的頂端新生嫩葉沒有明顯的黃化或白化表型，可能同三角梅植株木質(zhì)化有關(guān)。相反，接種的嫩葉表現(xiàn)出黃化，且葉片無明顯病態(tài)。因此，葉片摩擦接種法可用于三角梅葉色調(diào)控、發(fā)育代謝等基因驗證。

由此可見，建立一個高效的VIGS體系，需要綜合考慮各種因素，合適的病毒載體、農(nóng)桿菌菌系、插入片段大小、接種方法、培養(yǎng)環(huán)境等［20］。本研究綜合考慮各因素，獲得了一定的沉默效果，初步建立了三角梅的VIGS體系，為未來基因功能組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。但是，試驗中并未獲得明顯光漂白葉片，體系條件仍需進(jìn)一步優(yōu)化，期望建立更高侵染效率的VIGS體系。

4 結(jié)論

本研究以三角梅‘金心雙色’作為試驗材料，TRV病毒為載體，BpPDS為指示基因，采用摩擦接種葉片法，結(jié)合表型、光合色素含量測定及基因表達(dá)水平，初步構(gòu)建了三角梅的VIGS基因沉默體系，為后續(xù)基因功能研究提供參考。