李煥敏 高峰濤 李偉忠 王金慶 封佳麗

（濰坊學院生物與海洋學院，濰坊 261061）

隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展及國民生活水平提高，人們對食品安全、環(huán)境安全等要求越來越高，以微生物及其代謝產(chǎn)物替代化學物質用于畜牧養(yǎng)殖、農(nóng)作物培育、食品加工及環(huán)境工程、新能源生產(chǎn)等領域［1-5］受到的重視程度也越來越高。常用的微生物及其代謝產(chǎn)物主要包括細菌、真菌以及有生物活性的酶，它們作為生物催化劑參與不同的化學反應以達到應用目的，具有環(huán)境友好性、條件溫和性、生物相容性優(yōu)的優(yōu)勢，但也易受到外界因素的作用導致效率低、成本高，溫度、pH、氧氣、光照、金屬離子、原位生態(tài)系統(tǒng)等［6］都會影響微生物生長及發(fā)揮代謝作用的能力。因此，微生物/酶在用于工業(yè)化生產(chǎn)之前需要進行改進，提高穩(wěn)定性、活性、選擇性。固定化技術是一種傳統(tǒng)的微生物/酶改性技術，在合適載體的輔助下不僅可以提高生物催化作用，還能增加微生物/酶的可回收性，大幅度降低工業(yè)成本。本文就天然生物質材料作為固定化載體的應用及優(yōu)化進行綜述。

1 微生物固定化載體概述

微生物固定化是一項將特定對象固定在某些載體表面或內(nèi)部，使其在一定的空間區(qū)域內(nèi)高度密集并保持生物活性的技術。酶的固定化則是將酶束縛在一定區(qū)域并保持其特定生物催化活性并可回收的技術。相較于游離態(tài)，固定化生物技術能夠通過增加生物密度提高反應速率、避免細胞/酶受到環(huán)境因素的不利影響、減少有效生物體/酶流失，且該技術可以提高細胞/酶的可回收性［7-8］，增加細胞/酶利用率，降低生物反應成本，目前已在環(huán)境、食品、醫(yī)藥、化學等多領域得到廣泛應用。

對于微生物/酶，經(jīng)典的固定化方法包括吸附、包埋、交聯(lián)及復合固定化法，各方法的優(yōu)缺點如表1所示。吸附法是通過載體與微生物/酶之間的物理吸附、靜電引力、離子吸附等使微生物/酶附著在載體表面及其孔隙中。包埋法是將細胞/酶限定于高分子凝膠聚合物的空隙中。交聯(lián)是通過試劑與細胞/酶表面反應基團形成共價鍵而達到固定目的。3種固定化方法的結構示意圖如圖1所示。復合固定化常以吸附法為基礎，將吸附法與其他固定方法結合可以得到系統(tǒng)結構更強、處理效果更好的固定化反應體系，增強應用潛力［9-11］。吸附固定的作用效率受到吸附量及吸附強度的顯著影響，選擇合適的固定化載體非常重要。生物固定化所選的載體應滿足以下基本要求［12］：（1）良好的內(nèi)部結構和大的比表面積，即高孔隙率；（2）對細胞具有較高親和力；（3）合適的化學結構，以滿足微生物-底物接觸進行反應；（4）生物安全性及環(huán)境友好性；（5）熱穩(wěn)定性、化學耐用性、耐污染并且成本低廉等。

圖1 三種常用固定化方法的結構示意圖Fig.1 Structure diagrams of three typical immobilization methods

表1 常見固定化方法的優(yōu)缺點及載體材料Table 1 Advantages, disadvantages and carriers of common immobilization methods

目前，固定化生物技術采用的載體材料主要有3大類：有機載體、無機載體和新型復合載體。海藻酸鈉、殼聚糖、瓊脂以及天然多糖和甘蔗纖維、玉米芯等植物纖維類物質對微生物/酶無毒性，是常見的天然高分子材料，但此類材料機械性能差且可被微生物分解；聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、羧甲基纖維素等人工合成有機高分子聚合體則在機械性能、環(huán)境穩(wěn)定性方面得到提升，但制備工藝易造成環(huán)境污染及載體本身的生物毒性在一定程度上限制了其應用。常見無機載體如活性炭、硅藻土、陶珠等具有機械性能強、傳質性能好、環(huán)境穩(wěn)定性高、制備工藝簡單的優(yōu)點，但這類載體主要是通過吸附法固定微生物/酶，由于吸附力及吸附位點有限，構建的固定化體系中微生物/酶易流失。上述3類材料各有利弊，通過改良載體表面基團或物理結構可以得到特定性能的新型載體，也可以將有機載體與無機載體組合以構建多功能的復合載體［13-15］。

然而，開發(fā)高效、耐用、廉價、無污染的載體材料是固定化技術得以推廣應用的關鍵，以天然生物質材料吸附固定微生物的相關研究吸引了眾多學者的注意力。同時，作為一個農(nóng)業(yè)大國，我國每年會產(chǎn)生大量的農(nóng)林植物廢棄物，秸稈類生物質含有多種糖類、蛋白質及無機鹽等營養(yǎng)成分，并且具有多孔的天然結構，既能為微生物提供少量營養(yǎng)，又能為微生物提供吸附點，開發(fā)基于生物質的吸附固定化材料具有廣闊的應用前景。

2 生物質原料作為固定化載體的應用

2.1 去除環(huán)境污染物

作為一種重要生物質資源，農(nóng)林廢棄物的合理開發(fā)利用可以同時緩解環(huán)境與資源的雙重問題。植物纖維類生物質天然的多孔結構可以為微生物吸附提供大量著力位點而成為良好固定化載體，提高微生物對環(huán)境污染物的處理效能。當采用絲瓜絡固定Phanerochaete chrysosporium去除水中的Cr（VI）時，由于具有較大的比表面積及較小的密度，固定化真菌體系的Cr（VI）吸附能力顯著提高，在最優(yōu)條件下，Cr（VI）的去除率達到92%，剩余部分也被還原成毒性較低的Cr（III）［13］。同樣，Maleki等［16］采用絲瓜絡固定化Ralstonia eutropha降解苯酚和對硝基苯酚，對硝基苯酚的降解濃度可以提高到30 mg/L，遠高于游離細胞的15 mg/L，分析發(fā)現(xiàn)該降解效果也是物理吸附與生物降解的協(xié)同作用。植物秸稈也被直接用作固定化載體用于環(huán)境污染物處理。李巖等［17］采用番茄秸稈固定芽孢桿菌用于煤礦區(qū)3環(huán)芳烴的降解，研究結果表明固定化菌球對土壤中單體芴的去除率高達95.25%，較游離態(tài)芽孢桿菌的單體芴去除率顯著提高，并且番茄秸稈本身對污染物也有一定的吸附能力，載體與微生物發(fā)揮了協(xié)同作用。

2.2 合成生物活性物質

天然纖維素材料成本低、來源廣，簡單處理后即可成為一種理想的固定化載體，且生物安全性得以保證。在生物發(fā)酵工業(yè)中，以甘蔗纖維固定靈芝菌絲進行發(fā)酵，固定態(tài)靈芝菌的生物量、胞外多糖和三萜含量分別較游離態(tài)提高了78%、84%和60%［18］，甘蔗渣固定酵母在發(fā)酵葡萄酒、桑葚果酒、雪蓮果-西番蓮果酒、百香果酒等［19］方面也已得到應用。陳輝等［20］以菠蘿皮渣纖維素固定菠蘿蛋白酶，有效提高了酶的溫度穩(wěn)定性和酸環(huán)境穩(wěn)定性。王巖等［21］以香芋和普洱茶為主要原料采用固定化酵母菌技術生產(chǎn)香芋普洱茶醋，得到質量更優(yōu)的色澤棕黃、具有香芋和普洱茶特有風味的食醋。甘蔗和菠蘿主產(chǎn)于南方，作為加工廢料，渣料被因地制宜地用作固定化載體，大幅度提高產(chǎn)品質量，并降低生產(chǎn)成本，一舉多得。

2.3 養(yǎng)殖水體凈化

養(yǎng)殖水體中氨氮、磷濃度增加易引起富營養(yǎng)化，固定光合細菌用以修復養(yǎng)殖環(huán)境，可以使NH4+-N濃度下降80%，溶解氧大幅提高。硝化細菌和反硝化細菌也是常用菌種，但硝化細菌生長速度較為遲緩，容易被外界環(huán)境所干擾，在低溫條件下非常敏感，利用木屑顆粒作為載體材料固定化能顯著提升硝化細菌抗逆能力，提高其去除NH4+-N的效果［22］。Deng等［23］以海藻酸鈉-高嶺土載體固定假單胞菌DM02進行反硝化作用去除水產(chǎn)養(yǎng)殖中的硝酸鹽氮，NO3--N在多循環(huán)處理中的去除率均達到88.2%以上。相比其他環(huán)境污染物處理，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的固定化材料對生物安全性要求更高，既不能污染環(huán)境，又不能對養(yǎng)殖動物有害，且在動物體內(nèi)不易富集，故而天然生物材料更具有開發(fā)潛力。

秸稈及含纖維素的果實、秸稈殘余等生物質作為載體，其木質纖維素類成分的含量影響了材料的多孔性及孔隙體積，從而造成微生物/酶的吸附量差異；天然生物質材料中的纖維素及半纖維在高溫、堿/酸環(huán)境中可能發(fā)生溶解現(xiàn)象，甚至難降解的木質素也可能會被某些具有木質素降解酶系的真菌破壞，從而影響固定化系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對固定化生物體系的應用效率造成阻礙。為此，學者們一方面對天然生物質材料的粒徑、預處理等進行優(yōu)化以提高其固定化系統(tǒng)的穩(wěn)定性及應用效率；另一方面“師法自然”，從自然界中開發(fā)新的生物固定化載體。

3 生物質載體的改性及優(yōu)化

微生物/酶通過可逆附著及不可逆附著固定在載體表面，可逆附著的主要作用力是微生物/酶、載體、環(huán)境中的各種引力及斥力，包括氫鍵、酯化反應等范德華力、離子對形成的引力等，不可逆附著過程通常是因為微生物分泌部分黏性代謝物質造成的，這些體外多聚糖等物質起到了“生物膠水”的作用。影響微生物/酶在載體表面吸附力及吸附量的原因可歸納為三大類，即微生物/酶自身性質、載體表面性質以及環(huán)境特征。學者們通過不同的手段對載體進行改性，以提高微生物/酶的吸附固定作用。

3.1 制備生物炭及改性

載體表面粗糙度有利于細菌在其表面附著、固定，與光滑表面相比，粗糙載體表面增加了與細菌間有效接觸面積，載體表面粗糙部分，如孔洞、裂縫等對已附著細菌起到屏蔽保護，使它們免受環(huán)境力學作用。農(nóng)林業(yè)廢棄物在低氧或無氧條件下經(jīng)高溫裂解生成多孔的生物炭顆粒，生物炭具有孔隙發(fā)達、比表面積大、吸附力強等特性，但原材料種類及制備條件的差異對生物炭的結構、形態(tài)特征具有顯著影響［24］。通過物理、化學方法對生物炭改性，使表面碳元素與二氧化碳、氨氣等活化氣體發(fā)生反應，可以增大活性炭的比表面積及孔隙量、增加并強化吸附位點，以生物炭作為吸附載體固定化微生物在進行環(huán)境處理時可以協(xié)同發(fā)揮生物炭對污染物的吸附及微生物對污染物的降解作用［25］。

韓本勇等［26］采用磷酸活化法制備炭化核桃殼，并對其進行表面氧化和硅烷化等連接疏水官能團的改性處理和固定工藝優(yōu)化后，該生物炭固定的脂肪酸酶最大活力達到166 U/g，而且反復使用10次后仍可保留60%以上的酶活。劉宇程等［27］采用乙酸、氫氧化鈉、過氧化氫對秸稈進行改性制備固定化微生物，改性后的秸稈比表面積增大了36.27%，微生物吸附量則增加了200.77%，固定化微生物對鉆井泥漿的COD及石油烴去除率分別達到了84.9%和90.1%。Lou等［28］為研究生物炭固定化微生物系統(tǒng)在廢水處理中的作用，分別對竹炭和木炭固定化細菌對水中壬基酚的去除率和降解率進行了短期和長期的研究。結果表明，不同生物炭固定化細胞對壬基酚的去除效果不同，竹炭固定化細胞經(jīng)8輪長期重復利用后，對水中壬基酚的累積去除率和降解率最高分別達到93.95%和41.86%。進一步通過掃描電鏡、定量PCR和16S rRNA研究發(fā)現(xiàn)，生物炭的添加有效地延緩了系統(tǒng)微生物群落結構變化，這可能也是固定化體系優(yōu)于游離細胞作用效果的原因。玉米秸稈生物炭、蘆葦生物炭、竹炭、松針生物炭、杉木生物炭、鳳眼蓮等［29-32］植物纖維類材料，通過吸附細菌用于環(huán)境治理也得到廣泛的實驗研究。

生物炭由于儲存了大量穩(wěn)定的碳元素而有利于環(huán)境?；谥参锢w維生物質廢棄物制備生物炭的過程，受顆粒大小、含水量、熱解溫度等因素的影響，而生物炭用作固定化載體的評價指標主要為吸附動力學參數(shù)及等溫吸附特性，生物炭固定微生物用于重金屬及難降解物的處理得到了眾多研究團隊的認可，但該系統(tǒng)對污染處理的主要作用原理，是通過吸附作用將污染物集中于某處而不是將其降解為無污染的形態(tài)，因此生物炭固定化地回收、遷移及對自身對環(huán)境的長期影響需要進行評估。

3.2 菌絲球固定法

與此同時，學者們發(fā)現(xiàn)絲狀真菌在液體培養(yǎng)過程中會形成大小均勻的球狀體，與包埋法形成的菌球相似，并且真菌菌絲球自身可作為吸附劑處理環(huán)境污染物。隨著固定化優(yōu)勢的凸顯，學者們基于絲狀真菌的這一特征將其作為固定化載體形成混合菌絲球，在某些條件下代替植物生物質載體固定細菌（無載體固定）進行生物處理［33］。與傳統(tǒng)無機和有機化學材料相比，菌絲球作為生物質載體材料具有諸多優(yōu)點：（1）菌絲球由菌絲體纏繞以包裹特定功能性細菌，生物兼容性好，介質傳熱性優(yōu)；（2）菌絲本身能夠蔓延伸展，可以為功能菌提供足夠多的吸附點；（3）菌絲球作為一種天然生物體，對環(huán)境無污染，且生產(chǎn)成本低，因此是一種前景可觀的固定化載體材料，對于菌絲球形成條件進行優(yōu)化可以充分發(fā)揮真菌與細菌的協(xié)同作用，增強菌絲球的應用效率。

近年來，一些研究學者開始利用菌絲球作為生物質載體固定各種功能菌和納米顆粒，以提高菌絲球對污染物的去除效率和功能菌分離回收能力。董怡華等［34］利用絲狀真菌能夠形成菌絲球的特征，以黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）DH-1包埋固定化光合細菌PSB-1D形成混合菌絲球用于降解2-氯酚，研究發(fā)現(xiàn)混合菌絲球在7 d內(nèi)對初始濃度為50 mg/L的2-氯酚降解率可達89%以上，遠高于游離光合細菌的65.92%及單一Phanerochaete chrysosporium菌絲球的32.77%。為優(yōu)化菌絲球固定，董怡華系統(tǒng)研究比較了菌絲球吸附法及共培養(yǎng)法兩種方法固定光合細菌去除2-氯酚的效果，結果表明，成型的真菌菌絲球吸附的光合細菌主要分布在菌絲球淺表或菌絲交叉處，而真菌孢子與光合細菌共培養(yǎng)可以將光合細菌包裹在菌絲球內(nèi)，并且光合細菌會附著在菌絲上，隨著菌絲的生長交聯(lián)而逐步擴散過渡（圖2），所以共培養(yǎng)法固定化體系對2-氯酚的降解效果要優(yōu)于菌絲球吸附法。而共培養(yǎng)菌絲球的質量和密度與細菌的接種量密切相關，靜電引力和細胞表面的黏附力是混合菌絲球形成的主要原因。浙江大學陳慧英［35］以兩株具有木質纖維素降解能力的海洋真菌為基礎，構建了一種新型的菌微紫青霉菌P1與內(nèi)生擬盤多毛孢菌J63的雙菌種固定化體系應用于造紙廢水的處理，處理10 h后造紙廢水的生物降解率達到99%以上，而且經(jīng)過6批次的循環(huán)處理使用，其對造紙廢水的生物降解率仍高達96.4%。

圖2 兩種菌絲球固定細菌培養(yǎng)方法Fig.2 Two culture methods to immobile microorganism by mycelium pellet

菌絲球主要是絲狀真菌發(fā)酵過程中形成的一種天然微生物顆粒，由于其本身即為一種生物體，所以具有生物活性好、環(huán)境污染小的優(yōu)勢，固定特定功能性細菌形成的混合菌絲球沉降速度快、固液相易分離，且可以使不同微生物發(fā)揮協(xié)同作用，在廢水處理過程中作用明顯而成為研究重點。然而，廢水是一個十分復雜的混合體系，如果將真菌孢子與功能菌直接在廢水中共培養(yǎng)，廢水中的復雜成分會影響混合菌絲球的形成，甚至可能對微生物產(chǎn)生誘變作用；在實驗室條件下培養(yǎng)混合菌絲球再投用于環(huán)境廢水處理，雖然解決了菌絲球的形成及突變問題，但菌絲球的儲存問題及混合菌在環(huán)境因素影響下的相互作用仍需進一步地探討。

3.3 生物膜固定化

細菌通過細胞表面的黏附力附著在真菌菌絲上而形成混合菌絲球，但人們觀察到在沒有絲狀真菌的自然環(huán)境中，細菌也會通過分泌一些胞外物質而產(chǎn)生集群效應以形成生物膜發(fā)生“沉降”，與此同時分泌大量的多糖、蛋白質等胞外聚合物將細胞包裹其中，起到類似于固定化的作用，從而提高微生物的抗逆性及生存能力。

Feng等［5］研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌NY3生物膜對高含鹽量、偏酸性采油廢水的平均降解率達89.1%，恢復實驗表明該菌生物膜在中試運行后5 d內(nèi)即可恢復活性，且恢復的生物膜對原油降解效果不降反增。微生物的生物膜形成受到營養(yǎng)、金屬離子、群感信號系統(tǒng)等因素的調控［36］，基于迅速發(fā)展的生物技術，探究微生物形成生物膜的遺傳機制，通過基因調控強化細菌的成膜性及環(huán)境耐受性，可以有效改善細菌的固定化，如掃描電鏡（SEM）及激光共聚焦顯微鏡（CLSM）顯示，基因luxS、fliC突變的Cronobacter malonaticus喪失了原有的生物膜形成能力，表明fliC在細菌運動及黏附中的重要作用［37］。另外，通過研究細胞與固定化載體界面的作用機制，分析細胞間的信號傳導機制，開發(fā)能夠誘導細胞產(chǎn)生多糖、蛋白質等胞外大分子形成生物膜的載體，并調控環(huán)境因素使生物膜達到最優(yōu)化也是研究方向之一。

4 天然生物質材料的優(yōu)勢

天然生物質材料來源廣泛，成本低：我國是農(nóng)牧業(yè)大國，秸稈、稻草、果殼等生物材料容易獲得，且產(chǎn)量大，價格低廉；另外制備設施易于操作，運行成本低。天然生物質材料污染較?。禾烊簧镔|材料主要有碳、氫、氧3種元素組成，容易被分解成二氧化碳和水，基本不會對環(huán)境造成污染。秸稈類生物質含有多種糖類、蛋白質及無機鹽等營養(yǎng)成分，并且具有多孔的天然結構，既能為微生物提供少量營養(yǎng)，又能為微生物提供吸附點。生物有機高分子化合物的分子結構中活性功能基團多，可以通過化學修飾進行功能基團的改性以實現(xiàn)吸附劑的高選擇性和高吸附性能［38-40］。

5 展望

多年來的研究已經(jīng)證明固定化技術的應用潛力，相關創(chuàng)新研究也不斷涌現(xiàn)，但總體缺乏系統(tǒng)性及普適性。對于固定化載體，基于廉價的生物質廢棄物的新材料開發(fā)依然具有價值：（1）隨著現(xiàn)代生物技術和材料、化工等相關學科的不斷發(fā)展，使載體材料的精細化、定向化修飾成為可能，將生物質材料中的木質素、纖維素、半纖維素等主要成分進行分離，不僅可以更全面地利用農(nóng)林廢棄物，同時以生物降解性差的木質素為固定化載體避免載體自溶等問題，并且由于成分相對單一，載體材料的普適性得以增加。（2）隨著生物信息及基因工程技術的不斷發(fā)展，改善微生物或酶的相關調控基因以提高它們在固定化載體上的吸附力也得到了廣泛研究。如谷氨酸氧化酶作為一種工具酶目前已被廣泛應用于食品、化學和醫(yī)藥等領域，固定化可以提高其作用效率及應用范圍。

吸附固定在實際應用過程中具有較大的局限性，通常要與其他固定化方法相結合，因此在未來基于生物質材料的吸附載體優(yōu)化及微生物/酶改性過程中需要全面考慮，設計具有目的性及預測性，使最終的固定化系統(tǒng)效率最優(yōu)。