張修正,梁振魯,裴繼偉,曹燕峰,陳娜,劉海梅,趙芹

(魯東大學 食品工程學院,山東 煙臺,264025)

魷魚屬頭足綱,槍烏賊科軟體動物,是一種重要的海洋漁業(yè)資源。2020年,我國的魷魚遠洋捕獲量已高達43.28萬t,成為全球最大的魷魚捕撈國和生產國[1]。目前,國內魷魚加工程度普遍不高,加工過程中會產生大量魷魚內臟、魷魚墨、魷魚皮、魷魚軟骨等副產物,這些副產物大部分直接進行掩埋處理,只有少部分被加工制成飼料或者加工制成魚粉,產品利用率和附加值低,不僅造成資源浪費,甚至造成環(huán)境污染。魷魚加工副產物約占魷魚體重的20%,其富含蛋白質和呈味核苷酸、氨基酸等,是制備海鮮調味料的良好原料[2]。

蛋白酶水解反應條件溫和、安全高效、易于控制,不會產生有毒有害的物質,已成為開發(fā)海鮮調味料的關鍵技術[3-4]。張慶春等[5]通過復配不同蛋白酶的方式制備出呈鮮甜味的南極磷蝦酶解液;宿小杰等[6]通過比較不同蛋白酶的酶解效果,以風味蛋白酶制備出鮮味濃郁的紅鰭笛鯛魚排酶解液。但是,酶解工藝也存在2方面問題:一是由于酶解效率不高導致的原料利用不足[7];二是由于蛋白酶酶切導致蛋白質內部肽鏈中的疏水性基團暴露,使酶解液產生苦味,不僅影響酶解液的整體滋味,也限制了酶解技術在產品開發(fā)中的應用[8]。因此,如何選擇恰當的酶組合使用,提高水解效率并減少酶解液的苦味是亟需解決的問題。

研究發(fā)現(xiàn),內切酶和外切酶順序水解可以提高水解效率,降低酶解產物的苦味,提升鮮味[9-10]。堿性蛋白酶屬于內切酶,有較多的酶切位點,水解效率高,對芳香族氨基酸、疏水性氨基酸、堿性氨基酸都有較好的水解效果[11]。風味蛋白酶含有內切酶和外切酶2種活性,能較大程度地將暴露在外部的疏水基團降解,同時使一些風味前體物質發(fā)生水解,有助于酶解產物形成良好風味[12]?；诖?本研究采用AP200-A堿性蛋白酶和FF106風味蛋白酶對魷魚加工副產物進行兩步酶解,提升水解度,制備風味良好的魷魚鮮味酶解液,以期為魷魚加工副產物的高值化利用和海鮮調味料開發(fā)提供良好路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:魷魚加工副產物,龍口佳寶水產食品有限公司,實驗室勻漿處理后分存于-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

試劑:AP-200A堿性蛋白酶、FF106風味蛋白酶(均為食品級),安琪酵母股份有限公司;細胞色素C(標準品),上海甄準生物科技有限公司;抑肽酶(標準品),上海穎心實驗室設備有限公司;桿菌肽(標準品),壇墨質檢標準物質中心;氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、L-色氨酸(標準品),北京索萊寶科技有限公司;乙腈、甲醇(色譜純),科密歐化學試劑有限公司;鄰苯二甲酸氫鉀、NaOH、無水Na2CO3、K2SO4、硼酸(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SS250-A型組織搗碎勻漿機,佛山市沃爾姆斯電器有限公司;JRX-20L型曲線升溫消化爐,濟南精銳分析儀器有限公司;KjeltecTM 8400型全自動凱氏定氮儀,福斯華北京科貿有限公司;L-8900高速氨基酸分析儀,日立(中國)公司;LGJ-18真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;Agilent 1260(四元泵)高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魷魚加工副產物酶解工藝流程

稱取一定量的副產物勻漿→加蒸餾水至料液比1∶5→沸水浴加熱15 min→冷卻至室溫→調整適宜pH和溫度→加入AP-200A堿性蛋白酶酶解→沸水浴滅酶15 min→冷卻至室溫→調整適宜pH和溫度→加入FF106風味蛋白酶酶解→沸水浴滅酶15 min→冷卻至室溫→8 000 r/min低溫離心15 min→取上清液待測。

1.3.2 AP-200A堿性蛋白酶工藝優(yōu)化研究

單因素試驗設計:改變某一個因素參數,固定其余因素參數,研究酶添加量、酶解時間、pH、酶解溫度4個主要因素對酶解工藝的影響。具體單因素試驗如下:固定pH為10.0,在55 ℃條件下酶解4 h,研究不同酶添加量(800、1 200、1 600、2 000、2 400 U/g)對水解度的影響;固定酶添加量為2 000 U/g,在pH為8.0,溫度55 ℃條件下進行酶解,研究不同酶解時間(4、5、6、7、8、9 h)對水解度的影響;固定酶添加量為2 000 U/g,在50 ℃條件下酶解4 h,研究不同pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)對水解度的影響;固定酶添加量為2 000 U/g,在pH為8.0條件下酶解4 h,研究不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對水解度的影響。

正交試驗設計:在AP-200A堿性蛋白酶單因素試驗的基礎上,以酶添加量、酶解時間、pH、酶解溫度4個因素為自變量,設計四因素三水平正交優(yōu)化試驗,正交試驗水平設計見表1。

表1 AP-200A堿性蛋白酶酶解條件正交因素水平表

1.3.3 FF106風味蛋白酶工藝優(yōu)化研究

單因素試驗設計:改變某一個因素參數,固定其余因素參數,在AP-200A堿性蛋白酶最佳酶解條件的基礎上,對FF106風味蛋白酶進行單因素試驗。具體單因素試驗如下:固定pH為7.0,在55 ℃條件下酶解6 h,研究不同酶添加量(0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%)對水解度的影響;固定酶添加量為1.00%,在pH為7.0,溫度55 ℃條件下,研究不同酶解時間(4、5、6、7、8、9 h)對水解度的影響;固定酶添加量為1.00%,在溫度55 ℃下酶解6 h,研究不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對水解度的影響;固定酶添加量為1.00%,在pH值為7.0條件下酶解6 h,研究不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對水解度的影響。

正交試驗設計:在FF106風味蛋白酶單因素試驗的基礎上,以酶添加量、酶解時間、pH值、酶解溫度4個因素為自變量,設計四因素三水平正交優(yōu)化試驗,正交試驗水平設計見表2。

表2 FF106風味蛋白酶酶解條件正交因素水平表

1.3.4 水解度測定

采用凱氏定氮法對魷魚加工副產物總氮含量進行測定,采用甲醛滴定法對酶解液中游離氨基態(tài)氮含量進行測定[13]。具體水解度的計算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:V,酶解液總體積,mL;V1,滴定樣品所消耗NaOH體積,mL;V2,滴定空白所消耗NaOH體積,mL;V3,酶解液甲醛滴定取用量的體積,mL;C,NaOH標準溶液濃度,mol/L;m,酶解魷魚加工副產物的質量,g;0.014,與1.00 mL NaOH標準滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當的氮的質量,g;AN,酶解液中氨基態(tài)氮質量,g;TN,原料中總氮質量,g。

1.3.5 感官評定

選擇10名有感官評定經驗的評定員(5男5女)進行感官評定,要求評定人員在實驗前2 h未進食、吸煙,且單獨進行評定。酶解液感官評價標準參考劉麗娜等[14]進行制定,采用9分制對魷魚加工副產物酶解液從鮮味、苦味、魷魚特征風味3個方面進行感官評定,滿分為27分,分數越高則代表酶解液風味越好,具體評價標準如表3所示。

表3 酶解液感官評分標準

1.3.6 游離氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》方法進行測定,并分析酶解液中游離氨基酸的滋味活性值(taste active value,TAV),即樣品體系中游離氨基酸的濃度與其呈味閾值的比值。根據TAV的大小,可以判斷不同游離氨基酸對整體滋味貢獻的大小,TAV<1表示游離氨基酸對呈味無貢獻,TAV≥1表示游離氨基酸對呈味有貢獻,且數值越大,對呈味的貢獻越大[15]。

1.3.7 酶解液分子質量分布測定

參考董彩虹等[16]的方法,并略作修改。以細胞色素C(相對分子質量12 365 Da)、抑肽酶(相對分子質量6 511 Da)、桿菌肽(相對分子質量1 450 Da)、氧化型谷胱甘肽(相對分子質量612 Da)、還原型谷胱甘肽(相對分子質量307 Da)、L-色氨酸(相對分子質量204 Da)標準品為標準物質,高效液相色譜法檢測不同標準物質的洗脫時間,作相對分子質量對數與洗脫時間的標準曲線。通過比較酶解液中不同組分的洗脫時間計算酶解液的分子質量分布。高效液相色譜條件如下:樣品過0.22 μm微孔濾膜,采用TSK-GELG 2 000 SWxl(7.8 mm×300 mm)色譜柱,進樣量10 μL,檢測溫度25 ℃,檢測波長220 nm,流速0.5 mL/min,流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸=20∶80∶0.1(體積比)。

1.4 數據處理

采用Excel進行曲線繪制與標準偏差分析,采用Origin 9.0繪圖,采用SPSS進行方差分析,采用Duncan檢驗法進行不同水平顯著性差異分析,P<0.05為顯著,P<0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 AP-200A堿性蛋白酶工藝優(yōu)化

根據單因素試驗,初步確定AP-200A堿性蛋白酶最適酶添加量為2 000 U/g,最適酶解時間為7 h,最適pH為8.0,最適酶解溫度為50 ℃。在此基礎上,進行正交優(yōu)化組合試驗,具體結果如表4所示。影響酶解液水解度的不同因素主次順序為:酶解溫度>酶添加量>pH>酶解時間。綜合經濟節(jié)約原則以及水解情況分析,得到AP-200A堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量2 000 U/g、酶解時間7 h、pH 8.5、酶解溫度55 ℃。

表4 AP-200A堿性蛋白酶正交試驗結果

2.2 FF106風味蛋白酶工藝優(yōu)化

根據單因素試驗,初步確定FF106風味蛋白酶最適酶添加量為1.25%,最適酶解時間為8 h,最適pH為6.5,最適酶解溫度為55 ℃。在此基礎上,進行正交優(yōu)化組合試驗,具體結果如表5所示。影響酶解液水解度的不同因素主次順序為:酶添加量>酶解溫度>酶解時間>pH。綜合經濟節(jié)約原則以及水解情況分析,得到FF106風味蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量為1.25%、酶解時間為9 h、pH為6.5、酶解溫度為55 ℃。

表5 FF106風味蛋白酶正交試驗結果

2.3 雙步酶法酶解魷魚加工副產物驗證試驗

對所得最佳酶解工藝條件進行驗證試驗,驗證結果如表6所示。在上述最佳酶解工藝條件下所測得水解度分別為23.20%和33.90%,均略高于正交試驗中水解度的最大值。高志中等[17]采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對魷魚蛋白進行復合酶解,最終得到酶解液水解度為30.40%。劉振鋒等[18]使用堿性蛋白酶以及木瓜蛋白酶復配風味蛋白酶對魷魚蛋白進行分步酶解,最終得到酶解液的水解度為28.89%。本實驗采用雙步酶法所得酶解液水解度均優(yōu)于上述研究,表明AP-200A堿性蛋白酶和FF106風味蛋白酶分步酶解工藝可以提高酶解液的水解度,提升原料的利用率。

表6 雙步酶法驗證試驗結果

2.4 感官評價

在最優(yōu)條件下,經兩步酶解制得的魷魚加工副產物鮮味酶解液顏色呈黃褐色,質地澄清透明,有少量懸浮物,魷魚特征香氣明顯,有類似于蝦油的香味,有少量腥味,魷魚特征鮮味明顯,味道鮮美,有少量苦澀味,具有典型的海鮮風味。與一步酶解液相比,兩步酶解液鮮味更加明顯,魷魚特征風味更加突出,具體感官評分如表7所示。

表7 魷魚加工副產物酶解液感官評價結果

2.5 游離氨基酸組成分析

游離氨基酸是水產品重要的滋味物質,它們本身可以呈現(xiàn)鮮味、甜味、苦味等味道,還能與其他風味物質產生協(xié)同效應,影響酶解液的整體風味[19]。由表8可見,一步和兩步酶解液中氨基酸種類沒有差別,但是氨基酸的含量顯著不同。兩步酶解液中的總游離氨基酸和必需氨基酸含量分別為806.9 mg/100 mL和429.2 mg/100 mL,是一步酶解液的1.35倍和1.33倍,表明兩步酶解可以將副產物中更多的蛋白質酶解成游離氨基酸,提高了蛋白質的利用率和酶解液的營養(yǎng)價值。兩步酶解液中的鮮味氨基酸和甜味氨基酸含量為414.6 mg/100 mL,是一步酶解液的1.72倍,表明風味蛋白酶可以在堿性蛋白酶酶解的基礎上游離出更多的鮮甜氨基酸。研究發(fā)現(xiàn),當酶解產物中多肽的末端為疏水性氨基酸殘基或多肽中含有較多的疏水性氨基酸時,易與苦味受體相結合,產生高強度苦味,而以單體形式存在的疏水性氨基酸的苦味則要弱得多[20]。由表8中數據可得,在酪氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸的含量上面,二步酶解液中含量為339.30 mg/100 mL,高于一步酶解液(265.10 mg/100 mL)。由此可見,風味蛋白酶含有內切和外切酶的特性,可以通過減少疏水性氨基酸在多肽中間和兩端的占比,降低蛋白酶解產物的苦味。

表8 酶解液中游離氨基酸組成、呈味特性及TAV

此外,不同游離氨基酸含量的相對平衡關系與相互作用,也決定著食品的整體滋味感受與層次,呈味游離氨基酸的TAV越大,則對酶解液的整體滋味貢獻越大[21]。因此,本研究進一步比較了酶解液中不同游離氨基酸的TAV。由表8可知,無論是一步酶解液還是兩步酶解液,在所有游離氨基酸中TAV最大的氨基酸均為谷氨酸,TAV分別是2.50和3.22,而谷氨酸作為一種鮮味氨基酸,其鮮味最強,這也是魷魚加工副產物酶解液呈現(xiàn)鮮味的主要原因。另外,LIOE等[22]研究證明,在樣品整體體系中,如若苦味氨基酸的含量低于其呈味閾值,則苦味氨基酸可以協(xié)助增強其他氨基酸的甜味和鮮味,因此,低于其呈味閾值的苦味氨基酸的存在,也可能是魷魚加工副產物酶解液呈現(xiàn)鮮味的一個重要原因。此外,從鮮甜氨基酸占總游離氨基酸比例來看,一步酶解液中鮮味氨基酸和甜味氨基酸占總游離氨基酸比例為40.49%,而兩步酶解液中鮮味氨基酸和甜味氨基酸占總游離氨基酸比例為51.38%,鮮甜味氨基酸含量明顯提高。綜上所述,兩步酶解工藝可以通過提升酶解液中谷氨酸等鮮味氨基酸的味覺作用,降低末端為疏水性氨基酸的苦味肽含量,提升酶解液的鮮味,使酶解液整體風味更佳。

2.6 酶解液分子質量分布

肽分子質量分布能夠反映多肽分子質量的相對集中程度,是反映酶解程度的重要指標。采用高效液相色譜法得到標準物質的擬合直線方程為Y=-0.206 8X+6.65,其R2=0.996 3,說明線性良好。一步酶解液和二步酶解液的液相色譜洗脫圖見圖1、圖2。根據標準方程對魷魚加工副產物酶解產物進行分子質量分析,計算各分子質量段(Mw<200 Da,200～1 000 Da,1 000～3 000 Da及3 000～5 000 Da)百分比,具體見表9。

圖1 魷魚加工副產物一步酶解產物色譜圖

圖2 魷魚加工副產物兩步酶解產物色譜圖

表9 酶解產物多肽分子質量分布

由表9可知,經堿性蛋白酶酶解處理后,酶解產物的分子質量主要集中在3 000 Da以下,表明堿性蛋白酶的酶解效果較好,可以將副產物中的蛋白質高效地切割成分子質量3 000 Da以下的小肽。而經過兩步酶解以后,1 000～3 000 Da分子段的小肽被繼續(xù)分解,酶解液中游離氨基酸所占比例顯著提高,最終酶解液中分子質量小于1 000 Da的小肽和游離氨基酸占比達91.98%。根據文獻報道,分子質量小于3 000 Da的小肽對食品滋味的呈現(xiàn)有重要影響,是食品滋味的重要貢獻者[23]。鮮味肽作為一種新型鮮味劑,分子質量大多小于3 000 Da,具有鮮味醇厚圓潤、后味綿長的呈味特點,是對風味特別是鮮味貢獻最大的成分之一,具有顯著的鮮味呈現(xiàn)效果[24-25]。

研究發(fā)現(xiàn),在目前已知鮮味肽中,鮮味二肽和三肽總量占鮮味肽總量的一半以上,其分子質量大多集中在1 000 Da以下[26]。因此,本實驗采用雙步酶法制備的魷魚加工副產物鮮味酶解液,其鮮味的提升一方面是通過分步酶解的方式實現(xiàn)了高效的酶切,促進鮮味氨基酸的釋放,減少了疏水性氨基酸的釋放和苦味的生成;另一方面也提示經分步酶解后產生的1 000 Da組分中可能含有豐富的鮮味肽相關成分。本實驗也為后續(xù)深入研究魷魚加工副產物鮮味肽奠定了基礎。

3 結論

本實驗采用AP-200A堿性蛋白酶和FF106風味蛋白酶分步酶解魷魚加工副產物,以水解度為考察指標,探討了酶添加量、酶解時間、pH值以及酶解溫度對酶解效果的影響,得到雙步酶法最佳酶解工藝條件。在此條件下,酶解液水解度最終可達33.90%,鮮甜氨基酸占比達51.37%,酶解液中相對分子質量小于1 000 Da的小分子肽和游離氨基酸可達91.98%。綜上所述,雙步酶法制備的魷魚加工副產物鮮味酶解液的整體分子質量較小,鮮味特征明顯,研究結果希望為魷魚加工副產物的高值化利用以及制備呈味肽與魷魚特征風味調味品等提供理論基礎。