劉丹,鄒琳,熊子豪,邵艷紅,劉俊*,涂宗財,2

1(江西師范大學 生命科學學院和國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,江西 南昌,330022)2(南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌,330047)

雞蛋是食品工業(yè)中非常重要的原料,也是人類日常食物來源,具有很高的營養(yǎng)價值,但其誘發(fā)的過敏反應,對健康不利,對嬰幼兒來說更為嚴重[1]。卵清蛋白(ovalbumin, OVA)是主要的雞蛋過敏原,分子質(zhì)量為45 kDa,PI 4.5,有385個氨基酸殘基[2],其致敏表位分布在整個氨基酸序列和空間構(gòu)象中,由其引發(fā)的過敏反應極大地限制了蛋類制品的應用和發(fā)展[3]。

微波[2]、熱處理[4]、輻照[5]、高壓[6]以及糖基化修飾[7]等被用來消減過敏蛋白的致敏性,其中糖基化修飾是一種行之有效的蛋白質(zhì)脫敏技術(shù)。糖基化反應不僅能夠提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì),還能顯著影響蛋白質(zhì)的致敏性[1-2]:課題組研究發(fā)現(xiàn),糖基化修飾能夠破壞α-乳白蛋白的過敏表位,使其IgE結(jié)合能力顯著降低[8];胥偉等[9]報道,糖基化修飾可提高OVA的凝膠硬度、彈性、凝聚性與持水性等功能特性;楊逸鵬[10]采用單糖對OVA進行糖基化修飾,發(fā)現(xiàn)不同單糖顯著增加OVA中的β-折疊含量和分子動力學穩(wěn)定性,同時降低其致敏性。糖基化修飾能改變蛋白的結(jié)構(gòu),提高其功能活性,但以葡萄糖為單體的不同糖鏈如麥芽糖、麥芽三糖和麥芽五糖對OVA的結(jié)構(gòu)、抗氧化能力和致敏性的影響鮮有報道。

本文以O(shè)VA為原料,選用葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖分別對OVA進行糖基化修飾,通過電泳、光譜等技術(shù)分析其結(jié)構(gòu)和抗氧化能力變化,并采用酶聯(lián)免疫吸附實驗,KU812細胞模型研究糖基化修飾前后OVA致敏性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖,北京索萊寶科技有限公司;麥芽糖、OVA、山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶、山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶,美國Sigma公司;麥芽三糖,上海源葉生物科技有限公司;麥芽五糖、鄰苯二甲醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;雞蛋過敏血清,美國Plasma Lab International公司;兔血清,實驗室自制;其他試劑均為分析純。受試人員信息見表1。

表1 雞蛋過敏患者信息

1.2 儀器與設(shè)備

Spectrum-one型傅里葉變換紅外光譜儀,美國Perkin Elmer公司;超濾離心管(3 kDa),美國Millipore公司;Mini-Protean電泳儀,美國Bio-Rad公司;U-2910型紫外可見分光光度計、F-7000型熒光光譜儀,日本Hitachi公司;Synergy H1型酶標儀,美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考劉俊[11]的實驗方法。分別將1.0 mg/mL葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖溶于等質(zhì)量的OVA溶液中,混勻后凍干,采用干法制備糖基化樣品。葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖共價修飾的OVA分別命名為OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP。

1.3.2 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照LIU等[12]報道的方法,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)法分析OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的分子質(zhì)量變化。

1.3.3 游離氨基含量和反應程度

參照劉俊[11]的方法略作修改。使用鄰苯二甲醛法測定1.0 mg/mL OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP中的游離氨基含量。反應程度按照公式(1)計算:

(1)

式中:ρ,OVA中游離氨基含量,mg/mL;ρ0,OVA與葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽五糖反應生成絡(luò)合物的游離氨基含量,mg/mL。

1.3.4 熒光性晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)的測定

采用熒光光譜儀測定。

1.3.5 紅外吸收強度

將凍干樣品和KBr粉末以1∶10的質(zhì)量比混合研磨,然后將粉末壓薄放入傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi),設(shè)定波段為4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1。

1.3.6 紫外吸收強度

采用紫外可見分光光度計測定1.0 mg/mL OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的紫外吸收強度。

1.3.7 內(nèi)源熒光強度

采用劉俊等[8]的方法,用熒光光譜儀測定。

1.3.8 抗氧化能力測定

1.3.8.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照張露等[13]的方法并略作修改。將樣品分別稀釋至3、2、1.5、1、0.5 mg/mL,并配制相同質(zhì)量濃度的谷胱甘肽溶液作為陽性對照,取50 μL樣品溶液,加入稀釋后的陽離子自由基溶液150 μL,室溫反應30 min后,在734 nm下測其吸光值。其清除率按公式(2)計算:

(2)

式中:As,50 μL樣品溶液+150 μL ABTS陽離子自由基溶液的吸光值;Ab,蒸餾水代替ABTS陽離子自由基溶液的吸光值;Ac,蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力

參照王晗等[14]的方法并略作修改。配制DPPH母液,室溫避光條件下保存,將其稀釋至在517 nm的吸光值為0.7左右。將樣品分別用蒸餾水稀釋至3、2、1.5、1、0.5 mg/mL,谷胱甘肽溶液作為陽性對照,取50 μL樣品溶液,加入150 μL DPPH溶液,反應30 min后,在酶標儀517 nm條件下測其吸光值。其清除率按公式(3)計算:

(3)

式中:A1,50 μL樣品溶液+150 μL DPPH溶液的吸光值;A2,蒸餾水代替DPPH溶液的吸光值;A0,蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

參照李利華[15]的方法略作修改。OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP樣品分別用蒸餾水稀釋至3、2、1.5、1、0.5 mg/mL,將75 μL樣品溶液和75 μL Tris-HCL加入酶標板中,室溫靜置10 min后,加入50 μL的焦性沒食子酸溶液,5 min后,酶標儀320 nm下測定其吸光值,每間隔1 min測定1次,測定10 min。谷胱甘肽代替樣品作為陽性對照,水代替樣品作為空白對照。其清除率按公式(4)計算:

(4)

式中:ΔA0,空白對照組的吸光值曲線斜率;ΔAs,樣品組的吸光值曲線斜率。

1.3.9 IgG/IgE結(jié)合能力測定

參照毛積華等[16]的方法略作修改,采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法測定。IgG所用的一抗稀釋度為1∶1×106,二抗為山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶,稀釋度為1∶5 000;IgE所用的一抗稀釋度為1∶160,二抗為山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶,稀釋度為1∶400。以IC50為指標,IgG/IgE結(jié)合能力的抑制率按照公式(5)計算:

(5)

式中:A,添加樣品的吸光值;A0,用抗體稀釋液代替樣品的陽性對照吸光值。

1.3.10 KU812細胞脫顆粒實驗

參照APPEL等[17]的方法,在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)KU812細胞,當細胞數(shù)量達到1×106個時,將細胞按照1 mL/孔接種于24孔板培養(yǎng)24 h后用10 μL雞蛋過敏患者血清被動激活24 h,加入50 μL/孔(1.0 mg/mL)OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP刺激4 h,用PBS緩沖液處理的細胞作為陰性對照,采用ELISA法測定KU812細胞釋放白介素-6(interleukin-6,IL-6)和β-氨基己糖苷酶(β-animo hexosidase, Hex)的能力。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次,采用SPSS 24.0軟件分析單因素數(shù)據(jù)間的顯著性差異(P<0.05),所有數(shù)據(jù)作圖均采用Origin 2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 SDS-PAGE

由圖1所示,OVA分子質(zhì)量為45 kDa,有385個氨基酸殘基[2]。與OVA的條帶相比,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP蛋白條帶有明顯上移,且未見其他蛋白條帶,說明葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖分別共價交聯(lián)了OVA,生成了高分子質(zhì)量糖基化產(chǎn)物[18]。

圖1 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的SDS-PAGE圖

2.1.2 游離氨基含量和反應程度

如表2所示,與OVA相比,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的游離氨基含量顯著降低(P<0.05),順序依次為OVA-MP、OVA-MT、OVA-M、OVA-G。表明4種還原糖與OVA發(fā)生了糖基化反應,其中OVA-G游離氨基含量最低;與OVA-G的反應程度相比,OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的反應程度逐漸減弱(P<0.05),可能是由于分子質(zhì)量越小的糖越容易與OVA發(fā)生糖基化反應,被糖基化修飾的位點越多,游離氨基含量越少[19],而麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖隨著糖鏈長度的增加,空間位阻變大,導致糖基化反應程度趨弱,糖基化的反應程度由強到弱依次為:OVA-G、OVA-M、OVA-MT、OVA-MP。

表2 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的游離氨基含量和反應程度

2.1.3 熒光AGEs含量

如圖2所示,與OVA相比,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的AGEs含量均顯著升高(P<0.05),順序依次為OVA-G、OVA-M、OVA-MT、OVA-MP。這是因為葡萄糖的空間位阻小,容易與OVA發(fā)生糖基化反應,生成更多的糖基化產(chǎn)物,而麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖隨著糖鏈長度的增加,空間位阻增大,糖基化反應程度趨弱,生成的糖基化產(chǎn)物少[20]。結(jié)果表明糖基化反應程度由強到弱依次為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖,這與游離氨基含量的趨勢相同。

圖2 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的熒光AGEs含量

2.1.4 紅外吸收強度

如圖3所示,在波數(shù)3 500～3 200 cm-1,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的吸收峰值與OVA相比均有不同程度的增大,而此范圍是羥基伸縮振動的區(qū)域,說明不同的糖分子與OVA以共價方式結(jié)合,從而導致羥基含量增加。在波長1 000～1 250 cm-1處OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP吸收峰強度增加,可能是OVA發(fā)生了糖基化反應,從而導致C—O和C—N的伸縮振動[21]。

圖3 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的紅外光譜圖

2.1.5 紫外吸收強度

如圖4所示,OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP在最大吸收峰在278 nm左右,說明發(fā)色基團主要是色氨酸和酪氨酸[22]。與OVA相比,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP紫外吸收強度都有不同程度降低,可能是在反應過程中不同糖分子的接入,使得芳香族氨基酸殘基被遮蔽,降低了紫外吸收強度,結(jié)果說明糖基化修飾能改變OVA的構(gòu)象結(jié)構(gòu),且糖基化反應程度越高,對OVA結(jié)構(gòu)的影響越明顯。

圖4 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的紫外-可見吸收光譜

2.1.6 內(nèi)源熒光強度

如圖5所示,與OVA相比,OVA-MP、OVA-MT、OVA-M、OVA-G的熒光強度逐漸降低,這是由于不同糖分子的接入,會使OVA的色氨酸區(qū)域遮蔽,同時糖基化反應可以使OVA結(jié)構(gòu)展開,使得熒光發(fā)色團與溶劑相互作用,發(fā)生熒光淬滅,改變其三級結(jié)構(gòu),導致OVA熒光強度降低[16,23]。葡萄糖與OVA的反應最劇烈,對OVA構(gòu)象的影響最大,其次為麥芽糖、麥芽三糖和麥芽五糖。

圖5 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的內(nèi)源熒光強度

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 ABTS陽離子自由基清除能力

如圖6所示,OVA的IC50為1.72 mg/mL,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的IC50分別為1.37、1.39、1.49、1.63 mg/mL。這說明糖基化處理能夠增加OVA的ABTS陽離子自由基清除能力,主要是由于糖基化反應過程中產(chǎn)生具有供氫能力的中間產(chǎn)物和具有較強還原性的糖基化產(chǎn)物,從而提高了抗氧化能力[24],其中OVA-G的ABTS陽離子自由基清除能力最強,這是因為葡萄糖分子量小,空間位阻小,越容易與OVA發(fā)生糖基化反應,生成具有抗氧化能力的糖基化產(chǎn)物,而麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖隨著糖鏈長度的增加,糖基化程度趨弱,生成的糖基化產(chǎn)物少,抗氧化能力趨弱。

圖6 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的ABTS陽離子自由基清除能力

2.2.2 DPPH自由基清除能力

如圖7所示,與OVA相比,糖基化修飾的OVA的DPPH自由基清除能力有不同程度提高,由強至弱依次為OVA-G、OVA-M、OVA-MT、OVA-MP,其中OVA-G最高達到了58.75%,說明糖基化反應會提高蛋白質(zhì)的DPPH自由基清除能力,這種現(xiàn)象是由于糖基化反應產(chǎn)生的還原酮提供了H+等抗氧化物質(zhì),并且糖基化反應程度越高,抗氧化能力越強[25],這與ABTS陽離子自由基清除能力的研究結(jié)果一致。

圖7 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的DPPH自由基清除能力

圖8 OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的清除能力

2.3 IgG/IgE結(jié)合能力測定

圖9-a顯示了IgG結(jié)合能力,OVA的IC50值為8.65 μg/mL,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的IC50值分別為15.17、13.38、12.48和9.34 μg/mL,與OVA的IgG結(jié)合能力相比,不同糖均能降低OVA的IgG結(jié)合能力;圖9-b為IgE結(jié)合能力,可以觀察到與IgG結(jié)合能力呈現(xiàn)相同趨勢。IgG/IgE結(jié)合能力趨勢由低至高依次為OVA-MP、OVA-MT、OVA-M、OVA-G,這是由于葡萄糖的糖鏈短,分子活力強,更容易與OVA發(fā)生糖基化反應,破壞其過敏表位,而麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖的糖鏈逐漸增長,分子活力趨弱,對過敏表位影響趨弱[26]。結(jié)果表明,不同糖分子對OVA進行糖基化處理能夠降低其IgG/IgE結(jié)合能力,糖鏈越短,糖基化反應程度越高,對OVA的過敏表位影響越大,導致消減致敏性的能力越強。

a-IgG;b-IgE

2.4 KU812細胞致敏性

如圖10所示,與對照組相比,OVA、OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP的IL-6和Hex含量顯著增加(P<0.05),說明OVA可誘導過敏相關(guān)因子的釋放。與OVA相比,OVA-G、OVA-M、OVA-MT和OVA-MP刺激后的KU812細胞釋放的IL-6和Hex含量均顯著降低(P<0.05),這是由于糖基化修飾的OVA誘導嗜堿性粒細胞脫顆粒的程度較弱,減弱了效應細胞分泌IL-6和Hex的能力[27],其中OVA-G的IL-6和Hex的釋放量最低(P<0.05),然后依次是OVA-M、OVA-MT和OVA-MP,這與IgG/IgE結(jié)合能力的結(jié)果一致。結(jié)果表明,不同糖修飾的OVA能夠降低IL-6和Hex的分泌含量,降低過敏反應。

a-IL-6;b-Hex

3 結(jié)論與討論

本研究表明OVA經(jīng)過葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽五糖修飾后,其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,表現(xiàn)在OVA的分子質(zhì)量、AGEs含量、糖基化程度增強,游離氨基含量、紫外吸收強度和內(nèi)源熒光吸收強度的降低;同時不同糖分子均能增加OVA的抗氧化能力和降低其致敏性。糖鏈的長短與OVA的抗氧化能力密切相關(guān),糖鏈越短,糖基化程度越高,越有利于糖基化產(chǎn)物的生成,導致具有較高的抗氧化活性。此外,糖鏈的長短也會影響OVA的致敏性。葡萄糖的分子量小,糖鏈短,空間位阻小,更易與OVA發(fā)生糖基化反應,顯著破壞其過敏表位,降低其致敏性,而麥芽糖、麥芽三糖、麥芽五糖隨著糖鏈的增加,空間位阻變大,與OVA的反應程度變?nèi)?對OVA的過敏表位破壞能力也減弱。綜上所述,不同長度的糖鏈能不同程度地改變OVA的結(jié)構(gòu),提高其抗氧化能力和降低其致敏性。本研究結(jié)果可為生產(chǎn)高抗氧化能力和低致敏性蛋類制品提供理論基礎(chǔ),但功能活性的評價并不完全,未來將進行動物實驗以及臨床實驗來驗證其效果。