鄭清瑤,曹文紅,2*,韓昱梁,張峰寧,陳忠琴,2,林海生,2,鄭惠娜,2

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,廣東省海洋生物制品工程實驗室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,廣東 湛江,524088)2(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

膠原蛋白由3條相互纏繞的多肽α鏈組成,形成三螺旋結(jié)構(gòu),分子質(zhì)量為105 kDa[1]。因其具備良好的低抗原性、生物降解性和生物相容性等特性,在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[2]。牛、豬等陸生動物是膠原蛋白的主要來源,但由于牛海綿狀腦病和口蹄疫等人畜共患疾病及宗教約束,限制了陸生動物膠原蛋白的使用[3],因此迫切需要尋找膠原蛋白替代來源。水產(chǎn)來源的膠原蛋白因其不存在傳染性疾病和宗教倫理問題而備受關(guān)注,目前已開發(fā)應(yīng)用且研究較多的水產(chǎn)源膠原蛋白主要是魚皮、魚鱗和魚骨膠原蛋白,如云南鯛魚骨膠原蛋白[4]、大眼金槍魚皮和魚骨膠原蛋白[5]。

海參屬于棘皮動物門、海參綱,是重要的海洋生物資源,主要分布于印度洋、西太平洋海區(qū),全球有900多種,我國約140種[6]。我國海參分布在溫帶區(qū)和熱帶區(qū),其中西沙群島、南沙群島和海南島是我國熱帶海參的主要產(chǎn)地。海參在各類山珍海味中位尊“八珍”,具有補益養(yǎng)生功效,藥用價值較高;此外海參具有“吐臟、再生”等特性,再生和創(chuàng)傷修復(fù)能力強,可能與其體壁富含膠原蛋白有關(guān)[7]。糙刺參(Stichopushorrens),俗稱黃肉、方參,是一種廣泛分布于我國南海海域的野生熱帶海參,資源量大,但目前對其加工利用甚少。關(guān)于糙刺參食品化學(xué)特性特別是膠原蛋白組成及其特性分析方面尚未見報道。

膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法有酸法、酶法、熱水提取等。近年來,超聲波輔助提取技術(shù)因高效節(jié)能、經(jīng)濟可行、綠色環(huán)保等特點應(yīng)用廣泛[8]。熱水提取時的高溫會破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),此法不具備應(yīng)用價值;酸法提取的優(yōu)點是純度高,缺點是提取時間長、污染環(huán)境;酶法提取雖具備提取過程無污染、產(chǎn)率高等優(yōu)點,但成本較高是限制其發(fā)展的一個因素;而超聲波輔助提取作為一種新興的膠原蛋白提取方法,具有產(chǎn)率高、提取時間短、不破壞結(jié)構(gòu)等諸多優(yōu)點,但使用時應(yīng)控制超聲波時間和頻率。本研究以糙刺參為原料,采用酸法、酶法、超聲波輔助酸法、超聲波輔助酶法等提取糙刺參體壁膠原蛋白,比較分析不同方法提取的膠原蛋白提取率、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì),以期為后續(xù)糙刺參體壁膠原蛋白的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

糙刺參購于海南省瓊海市潭門海鮮市場,去除內(nèi)臟和內(nèi)壁肌肉后于-20 ℃凍藏。

胃蛋白酶(豬胃黏膜)(高純,1∶10 000),上海源葉生物科技有限公司;EDTA、NaOH、NaCl、乙酸等均為國產(chǎn)分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、羥脯氨酸含量檢測試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、考馬斯亮藍超快染色液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HJ-6AS六聯(lián)恒速恒溫磁力攪拌器,常州金壇良友儀器有限公司;Thermo Lynx 6000高速落地離心機,賽默飛世爾科技有限公司;FS-1200N超聲波處理器,上海生析超聲儀器有限公司;Cary 60紫外可見分光光度計,上海精科實業(yè)有限公司;TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀,德國Bruker公司;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國伯樂公司;Chirascan V100圓二色光譜儀,英國應(yīng)用光物理公司;DSC-300C差示掃描量熱儀,南京大展檢測儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 糙刺參體壁預(yù)處理

解凍后的糙刺參體壁切成碎塊,稱取40 g碎塊,以1∶10(g∶mL)的料液比加入蒸餾水磁力攪拌30 min,清洗糙刺參,紗布過濾,取糙刺參碎塊,按料液比1∶10(g∶mL)加入0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0,4 mmol/L EDTA),攪拌24 h。紗布過濾,糙刺參碎塊清洗2遍后于蒸餾水中攪拌24 h,糙刺參溶解于溶液中,13 000 r/min離心30 min,所得膠原沉淀按料液比1∶20(g∶mL)加入0.1 mol/L NaOH,去除色素和非膠原蛋白,攪拌72 h,沉淀反復(fù)水洗至中性備用。所有操作步驟均在4 ℃下進行。

2.2 糙刺參體壁膠原蛋白的提取

2.2.1 酸法提取

參考AHMED等[9]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶25(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,攪拌48 h。13 000 r/min離心45 min,取上清液,加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L,攪拌2 h,靜置過夜。離心收集沉淀,加入少量0.5 mol/L乙酸復(fù)溶后裝入透析袋,用0.1 mol/L乙酸透析1 d、蒸餾水透析2 d,直至1% AgNO3檢驗不出現(xiàn)白色沉淀即表示透析結(jié)束,冷凍干燥后制得酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen, ASC)。

2.2.2 酶法提取

參考ABEDIN等[10]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶20(g∶mL)加入含有2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液,攪拌48 h。13 000 r/min離心45 min,取上清液,加入NaCl至終濃度為0.9 mol/L,攪拌2 h,靜置過夜。離心取沉淀復(fù)溶于少量0.5 mol/L乙酸,裝入透析袋內(nèi)于0.02 mol/L Na2HPO4(pH 8.0)中透析2 d使胃蛋白酶失活,再分別用0.1 mol/L乙酸和蒸餾水透析1 d和2 d,透析檢驗方法同2.2.1節(jié),冷凍干燥后制得酶溶性膠原蛋白(pepsin-solubilized collagen, PSC)。

2.2.3 超聲波輔助酸法提取

參考ALI等[11]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶15(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,360 W超聲波處理20 min。超聲波處理過程中利用低溫恒溫槽將樣品的溫度保持在4 ℃,使用溫度傳感器實時監(jiān)測溫度。為避免過熱,采取脈沖模式,即超聲波10 s,暫停5 s。處理結(jié)束后,連續(xù)攪拌48 h進行提取。鹽析、透析操作過程同2.2.1節(jié),冷凍干燥后制得超聲波輔助酸溶性膠原蛋白(ultrasound-assisted extraction of acid-soluble collagen, UASC)。

2.2.4 超聲波輔助酶法提取

參考ALI等[11]的方法,稍作修改。預(yù)處理后的膠原沉淀按料液比1∶15(g∶mL)加入0.5 mol/L乙酸溶液,480 W超聲波處理20 min,并使用如2.2.3節(jié)所述的脈沖模式。超聲波處理結(jié)束后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶,攪拌48 h進一步提取。鹽析、透析操作過程同2.2.2節(jié),冷凍干燥后制得超聲波輔助酶溶性膠原蛋白(ultrasound-assisted extraction of pepsin-solubilized collagen, UPSC)。

2.3 膠原蛋白提取率的測定

參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》測定樣品中羥脯氨酸含量。糙刺參膠原蛋白提取率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:X,膠原蛋白提取率,%;ω,樣品的羥脯氨酸質(zhì)量濃度,μg/mL;V,樣品體積,mL;D,稀釋倍數(shù);11.1,羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數(shù);m,糙刺參體壁的膠原蛋白含量,g。

2.4 SDS-PAGE分析

參考SONG等[12]的方法,稍作修改。采用8%分離膠和5%濃縮膠,并用6.5～270 kDa的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品計算蛋白質(zhì)條帶分子質(zhì)量。取膠原蛋白凍干品2 mg溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液,與2×上樣緩沖液以1∶1的體積比例混勻,100 ℃加熱8 min,5 000 r/min離心5 min,取15 μL上清液上樣。采用直流恒壓電源進行電泳,電流40 mA,電壓100 V。電泳結(jié)束后進行染色和脫色,直至背景顏色為無色后進行凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.5 紫外光譜分析

參考LI等[13]的方法,稍作修改。稱取10 mg膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液,12 000 r/min離心15 min,取上清液進行掃描分析。掃描波段為200～400 nm,速度為2 nm/s,波長間隔1 nm。以0.5 mol/L乙酸溶液作為空白對照。

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

取1 mg膠原蛋白凍干品與100 mg干燥的KBr混合,置于瑪瑙研缽中研磨均勻,使用壓片機壓片。掃描區(qū)間400～4 000 cm-1,掃描次數(shù)32次,速度0.2 cm/s,分辨率4 cm-1。以KBr作為測量時的背景光譜。

采用PeakFit v4.12軟件對紅外光譜的酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)進行基線校正,Gaussian去卷積,利用二階導(dǎo)數(shù)進行多次擬合將最小殘差重疊的不同譜帶分開,并根據(jù)各子峰與二級結(jié)構(gòu)之間的對應(yīng)關(guān)系,計算各子峰面積占比,從而得到各二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

2.7 熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白凍干品以料液比1∶40(g∶mL)溶于0.5 mol/L乙酸溶液,在4 ℃下靜置2 d后測定熱變性溫度(Td)和熔融溫度(Tm)。稱取10 mg膠原蛋白溶液置于鋁坩堝中,以空坩堝為參比,掃描溫度范圍為20～150 ℃,升溫速率3 ℃/min,所有測定均在N2氣氛下進行。

2.8 圓二色光譜分析

取適量膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸溶液,配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的膠原蛋白溶液,10 000 r/min離心15 min,取200 μL上清液于光程為0.5 mm的比色皿中進行掃描測定。N2壓力為0.4 MPa,掃描波長范圍為190～260 nm,寬帶1 nm,響應(yīng)時間0.5 s。以0.5 mol/L乙酸溶液作為空白對照。

2.9 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次,結(jié)果使用JMP 14.0軟件進行差異顯著性分析(P<0.05),應(yīng)用Origin 9.8軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 糙刺參膠原蛋白提取率

如圖1所示,與膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取方法的提取率更高,即UASC和UPSC的提取率顯著高于ASC和PSC(P<0.05)(以濕重計),推測是由于超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)在一定程度上增大了膠原蛋白的孔隙度,促進了膠原蛋白的溶出。

圖1 不同提取方法下糙刺參體壁膠原蛋白的提取率

由圖1可知,ASC的提取率僅為0.15%,其原因可能是膠原蛋白端肽區(qū)域的交聯(lián)導(dǎo)致膠原蛋白在酸性條件下較難溶解,PSC的提取率為2.14%,加入胃蛋白酶后,裂解了端肽區(qū)域的交聯(lián)分子,促使膠原蛋白在酸性條件下的溶解度提高,進而導(dǎo)致PSC的提取率高于ASC[10]。該結(jié)果與大紅海參皮ASC(3.4%)和PSC(20.8%)(以干重計)[14]、黃鰭金槍魚魚囊ASC(1.07%)和PSC(12.10%)(以干重計)[15]的結(jié)果類似。以上結(jié)果表明,胃蛋白酶通過裂解膠原的端肽區(qū)域促進膠原蛋白的提取,超聲波的空化效應(yīng)也促進了溶液的分子運動。這2種作用綜合在一起同時促進了胃蛋白酶的滲透和基質(zhì)的傳遞,因此超聲波與胃蛋白酶的結(jié)合有效提高了膠原蛋白的提取率,與RAN等[16]的研究結(jié)果一致。由于糙刺參ASC提取率極低,未作為后續(xù)研究對象。

3.2 膠原蛋白的SDS-PAGE分析

如圖2所示,3種方法提取的膠原蛋白的亞基組成及分子質(zhì)量分布趨勢基本一致,均由α1、α2、β、γ等4條鏈組成,與海蜇膠原蛋白[2]、斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白[17]的電泳結(jié)果一致。α1鏈的分子質(zhì)量為135 kDa,α2鏈的分子質(zhì)量為116 kDa,并且α1的條帶光密度是α2的2倍,因此3種膠原蛋白亞基組成可能為(α1)2α2,符合I型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征[18]。β鏈的出現(xiàn)說明膠原蛋白存在分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)作用[19]。圖2顯示PSC和UPSC存在一些低分子條帶,推測是因為提取過程中胃蛋白酶使部分膠原蛋白降解成小分子組分所致[19],UASC的低分子條帶則可能是由于超聲波產(chǎn)生的剪切力使一部分膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生降解。綜上,3種膠原蛋白的基本組成類似,說明超聲波不會破壞膠原蛋白的亞基組成[20]。

1-PSC;2-UPSC;3-UASC

3.3 膠原蛋白的紫外光譜分析

圖3 糙刺參體壁膠原蛋白的紫外吸收光譜圖

3.4 膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 糙刺參體壁膠原蛋白的紅外吸收光譜圖

通過對酰胺Ⅰ帶進行去卷積處理,可以反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化趨勢。1 600～1 640、1 640～1 650、1 650～1 660、1 660～1 670 cm-1分別表示β折疊、無規(guī)則卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角。圖5為糙刺參膠原蛋白酰胺I帶的高斯曲線擬合圖,結(jié)合圖6可發(fā)現(xiàn),3種膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)相對含量有所不同。與PSC相比,UPSC、UASC的α螺旋含量降低,β折疊和β轉(zhuǎn)角含量增加,并且經(jīng)過超聲波處理后,膠原蛋白不存在無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),這與黃丹丹等[26]的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果說明超聲波處理破壞了維持膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的分子間作用力,使氫鍵斷裂,促使α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B和β轉(zhuǎn)角,超聲波處理的過程中暴露了更多的三螺旋區(qū)位點,促進了膠原蛋白的溶出。

a-PSC;b-UPSC;c-UASC

圖6 糙刺參體壁膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的相對含量

3.5 膠原蛋白的熱穩(wěn)定性分析

膠原蛋白的熱穩(wěn)定性通常由熱變性溫度(Td)和熔融溫度(Tm)描述。熱變性溫度指的是膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,分解成無規(guī)則卷曲的溫度。熔融溫度定義為膠原蛋白的物理形態(tài)由固體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w的溫度。膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量、棲息地環(huán)境溫度和生物體體溫有關(guān)[9]。

糙刺參PSC、UPSC、UASC的熱穩(wěn)定性如圖7和表1所示,3種膠原蛋白均有2個吸熱峰,第1個吸熱峰為膠原蛋白的熱變性溫度,分別為21.3、25.9、27.0 ℃,與刺參(22.3 ℃)[6]相近,低于尖吻鱸魚鱗(37.54 ℃)和魚皮膠原蛋白(36.74 ℃)[27]、小牛皮膠原蛋白(40.07 ℃)[28],但高于大紅海參皮(18.5 ℃)和結(jié)締組織膠原蛋白(17.9 ℃)[14]。第2個吸熱峰為膠原蛋白的熔融溫度,與多肽鏈的斷裂有關(guān)[18],分別為92.4、91.3、90.1 ℃,低于鱘魚皮Ⅰ型(116.01 ℃)和Ⅴ型膠原蛋白(122.86 ℃)[18]、中華鱉酸溶性膠原蛋白(111.0 ℃)和UASC(120.66 ℃)[29]。綜上所述,與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取顯示出更高的熱變性溫度,說明經(jīng)過超聲波處理后,膠原蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,熱穩(wěn)定性更好[8]。

表1 糙刺參體壁膠原蛋白的熱穩(wěn)定性

圖7 糙刺參體壁膠原蛋白的DSC曲線

3.6 膠原蛋白的圓二色光譜分析

蛋白質(zhì)的圓二色性可較直觀的反映蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息,因此常用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析。如圖8所示,橢圓度略有偏差,表明3種膠原蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小的變化。PSC、UPSC、UASC分別在223、222、223 nm存在較弱的正吸收峰,主要表現(xiàn)為β折疊及無規(guī)則卷曲的疊加吸收,是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的圓二色譜典型特征[30]。PSC、UPSC、UASC分別在199、198、198 nm出現(xiàn)明顯的負(fù)吸收峰。正吸收峰與負(fù)吸收峰的比值(Rpn)是表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整性的參數(shù),其比值越大,說明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)越完整。圖8結(jié)果顯示,UPSC的Rpn大于PSC和UASC,表明UPSC具有更完整的三螺旋結(jié)構(gòu),再次說明超聲波不會破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu),與鯉魚皮膠原蛋白[11]的結(jié)果相似。

圖8 糙刺參體壁膠原蛋白的圓二色光譜圖

4 結(jié)論

本研究以糙刺參體壁為對象,采用酸法、酶法、超聲波輔助酸法和超聲波輔助酶法提取膠原蛋白,對比分析了不同方法提取的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。結(jié)果表明,UASC和UPSC的提取率顯著高于ASC和PSC(P<0.05);SDS-PAGE圖譜顯示PSC、UPSC、UASC亞基組成均為(α1)2α2;紫外光譜表明,PSC、UPSC、UASC在280 nm處均無吸收峰;紅外光譜顯示,PSC、UPSC、UASC均含有典型的膠原蛋白特征吸收峰,酰胺Ⅰ帶去卷積結(jié)果顯示超聲波處理使膠原蛋白α螺旋含量降低,β折疊和β轉(zhuǎn)角含量增加;DSC曲線顯示,與傳統(tǒng)提取方法相比,超聲波輔助提取顯示出更好的熱穩(wěn)定性;圓二色光譜表明UPSC具有更完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

綜上,糙刺參體壁膠原蛋白為I型膠原蛋白,3種提取方法均保持了膠原蛋白完整的三螺旋結(jié)構(gòu),且在不影響膠原蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的前提下,超聲波處理能有效提高膠原蛋白的提取率。本研究不僅為糙刺參體壁的精深加工提供基礎(chǔ)依據(jù),還為糙刺參體壁膠原蛋白在食品、化妝品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)。