李秀,陳昱瑤,管玲娟,宋潔,成向榮

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

阿膠是馬科動物驢(EquusasinusL.)的皮通過煎煮加工后濃縮制成的固體膠[1],主要成分為蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、多糖、硫酸軟骨素以及透明質(zhì)酸等[2]。蛋白質(zhì)是阿膠的主要生物活性物質(zhì),其口服后經(jīng)胃腸道消化、降解為小肽,發(fā)揮對血液的滋補與機體調(diào)節(jié)作用[3]。微量元素鐵是紅細胞合成血紅素必不可少的成分[4],人體缺鐵會造成血紅素合成減少從而發(fā)生缺鐵性貧血(iron-deficiency anemia, IDA),同時引起體內(nèi)含鐵酶活性降低,影響能量代謝,引起精神不振、疲倦[5]。全球疾病負擔研究顯示IDA是2013年全球健康壽命減損的前5位病因,鐵的缺乏已經(jīng)成為一個世界性的營養(yǎng)問題。補鐵劑前后經(jīng)歷四代發(fā)展,第一代為以FeSO4為代表的無機亞鐵鹽補鐵劑,第二代為以乳酸亞鐵為代表的有機酸鹽補鐵劑,第三代以甘氨酸亞鐵為代表,目前以多肽鐵為代表的第四代補鐵劑因穩(wěn)定性好、生物利用率高、成本低廉已被廣泛應用[6-8]。前期研究表明,阿膠肽鐵螯合物(Ejiao peptide-iron chelate,EPI)可以通過提高鐵的生物利用度,改善膳食缺鐵小鼠貧血癥狀,是阿膠補血的功效成分[9-10]。微膠囊化技術是用天然或者合成的高分子成膜材料作為壁材,把分散的固態(tài)物質(zhì)、液體甚至氣體作為芯材完全包埋起來,形成具有密封或半透性囊膜的微型顆粒的技術[11-12]。為了提高穩(wěn)定性、增強緩釋作用以及遮蔽不良風味(鐵銹味),本文對EPI進行微膠囊化包埋。通過對EPI微膠囊制備工藝優(yōu)化,并對制得的微膠囊進行理化性質(zhì)表征、穩(wěn)定性分析及腸道緩釋行為分析,為新型阿膠補血產(chǎn)品的開發(fā)提供科學依據(jù),為新型補鐵劑的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠粉,山東東阿阿膠股份有限公司;102型果膠、D-150型大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI),蘇州賽邁爾生物科技有限公司。

無水乙醇、FeSO4·7H2O、NaOH、濃鹽酸、Na2CO3、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸鉀鈉、抗壞血酸、1,10-鄰菲啰啉、一水合乙酸鈉、三水合乙酸鈉、冰醋酸、一水合檸檬酸、KH2PO4,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;堿性蛋白酶(≥200 U/mg),北京索萊寶科技有限公司;木瓜蛋白酶(BR,800 U/mg)、胃蛋白酶(豬胃黏膜,USP級,1∶30 000)、胰蛋白酶(豬胰,BR,1∶250),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機、Centrifuge 5430R臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;HH-3A恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機,寧波新芝生物股份有限公司;納米粒度及Zeta電位儀,英國馬爾文公司;冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術公司;AR224CN電子天平,奧豪斯儀器有限公司;THZ-C-L臺式冷凍恒溫振蕩器,金壇榮華公司;電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;XH-C旋渦混合器,無錫沃信儀器制造有限公司;AMM系列多點磁力攪拌器9T(加熱),天津奧特賽恩斯儀器有限公司;XH-800B智能溫壓雙控微波消解儀,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 EPI的制備

根據(jù)實驗室前期研究所建立的方法制備EPI[9-10]。以阿膠為原料,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對阿膠進行酶解,按一定質(zhì)量比與膳食鐵溶液混合,37 ℃恒溫振蕩酶解120 min。采用固定化金屬親和層析方法分離鐵螯合肽,向溶液中加入FeSO4溶液37 ℃振蕩30 min,同時加入抗壞血酸防止Fe2+氧化,螯合完畢經(jīng)冷凍干燥得EPI。

1.3.2 EPI微膠囊的制備

選用大豆分離蛋白與果膠制備EPI微膠囊,根據(jù)MENDANHA等[13]、李穎杰等[14]的方法稍作改動,制備流程如下:

EPI→大豆油-螯合物乳液(油∶螯合物=3∶1)→加大豆分離蛋白溶液(pH 8.0)→均質(zhì)得到O/W乳液→加果膠溶液→磁力攪拌→預冷(-20 ℃,36 h)→冷凍干燥(-65 ℃,24 h)→EPI微膠囊粉末

1.3.3 EPI微膠囊制備單因素試驗

以包埋率為指標,考察壁芯質(zhì)量比、大豆分離蛋白與果膠質(zhì)量比、包埋時間對EPI微膠囊工藝的影響,確定最佳微膠囊制備工藝參數(shù)。

壁芯比對微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。設計壁芯質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3,保持壁材中m(SPI)∶m(果膠)=5∶5。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的SPI溶液12.0、8.0、4.0、2.0、1.3 g,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的果膠溶液12.0、8.0、4.0、2.0、1.3 g,以900 r/min攪拌20 min。將所得產(chǎn)物進行冷凍干燥,測定包埋率。

m(SPI)∶m(果膠)對微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。設計壁材中m(SPI)∶m(果膠)為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3,保持壁芯質(zhì)量比為2∶1。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的SPI溶液4.8、6.4、8.0、9.6、11.0 g,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%的果膠溶液11.2、9.6、8.0、6.4、4.8 g,以900 r/min的轉(zhuǎn)速包埋20 min。將所得產(chǎn)物進行冷凍干燥,測定包埋率。

包埋時間對微膠囊工藝的影響:取0.2 g EPI粉末,加入0.6 g大豆油,二檔均質(zhì)5 min。保持壁芯質(zhì)量比為2∶1,壁材中m(SPI)∶m(果膠)為5∶5。向大豆油-螯合物乳液體系中分別加入8.0 g質(zhì)量分數(shù)為10%的SPI溶液,采用二檔均質(zhì)10 min后得到O/W乳液,轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器,分別加入8.0 g質(zhì)量分數(shù)為10%的果膠溶液,以900 r/min的轉(zhuǎn)速分別攪拌10、20、30、40、50 min。將所得產(chǎn)物進行冷凍干燥,測定包埋率。

1.3.4 EPI微膠囊制備正交試驗

根據(jù)EPI微膠囊單因素試驗結果,考慮適應生產(chǎn)需求,以壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠質(zhì)量比例、包埋時間為考察因素(表1),并考慮交互作用,以包埋率作為參考指標設計三因素三水平正交表L27(313),探究最佳微膠囊化配方。

表1 EPI微膠囊的正交試驗因素水平

1.3.5 EPI微膠囊的理化性質(zhì)表征

1.3.5.1 包埋率的測定與計算

以Fe2+的含量為指標,按公式(1)計算包埋率。

(1)

式中:X,包埋率;x1,1.0 mg EPI總鐵質(zhì)量,μg;x2,1.0 mg EPI微膠囊中鐵質(zhì)量,μg。

鐵含量測定:取適量樣品與5 mL濃HNO3混合,按照表2的消解程序參數(shù)進行消解,將消解后的溶液用10%(體積分數(shù))稀HNO3溶液定容,并根據(jù)Fe2+含量稀釋至合適濃度,采用原子吸收法測定樣品中的鐵含量[15]。

表2 樣品微波消解參數(shù)

1.3.5.2 EPI與微膠囊的形態(tài)與顯微結構對比

實物形態(tài)對比:取在陰涼、密閉條件下儲存的EPI和微膠囊,拍照進行形態(tài)對比分析。

粒徑對比:參考李穎杰等[14]的方法,使用激光粒度儀分別測定螯合物與微膠囊的粒徑分布。

顯微結構對比:采用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy,FESEM)掃描,分別放大1 000倍、5 000倍對比觀察螯合物與微膠囊的結構。

1.3.6 EPI微膠囊的穩(wěn)定性分析

消化穩(wěn)定性的測定方法參考王俊強[16]與胡喬遷[17]的方法并加以改動,具體方法如下。

分別制備2.0 mg/mL EPI溶液和EPI微膠囊分散體,各取5.0 mL置于50 mL離心管,37 ℃預熱10 min后加入5.0 mL模擬胃液,模擬胃液、腸液的配制參考《中華人民共和國藥典》[18],振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋避光保溫2 h,于消化開始0、15、30、60、90、120 min時分別取1.0 mL反應液,采用鄰菲羅啉比色法立即對所取樣品進行Fe2+含量測定。

在上述胃消化2 h后剩余的4.0 mL體系中,加入2.0 mL模擬腸液,振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋避光保溫3 h,每隔30 min分別取0.5 mL反應液,采用鄰菲羅啉比色法立即對所取樣品Fe2+含量進行測定。

熱穩(wěn)定性分析:稱取一定質(zhì)量的EPI加入適量去離子水溶解,分別置于20、30、40、50、60、70和80 ℃水浴2 h,采用鄰菲羅啉法測量不同溫度條件下EPI的鐵螯合率。

1.3.7 腸道緩釋行為測定

購買SPF級C57BL/6 J小鼠50只,40只飼喂低鐵飼料建立IDA小鼠模型,10只飼喂正常飼料,從第2周開始,每周定期對小鼠進行尾靜脈采血,測定正常組和模型組小鼠血液中血紅蛋白(hemoglobin,HGB)含量,直至小鼠HGB 含量低于標準濃度(90 g/L)即造模成功。收集小鼠各個時段的糞便,并進行鐵含量測定,將小鼠糞便冷凍干燥后分別取50～100 mg轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯消解罐中,加入5 mL濃HNO3按照表2的消解程序進行微波消解,得到澄清溶液,轉(zhuǎn)移消解液超純水定容至25 mL,用原子吸收分光光度法測定小鼠糞便中的鐵合量。分別對模型組動物以中劑量2.0 mg Fe/kg BW對小鼠灌胃EPI和微膠囊溶液,灌胃后2 h開始,每間隔1 h收集小鼠糞便進行低溫冷凍干燥,稱量各時段糞便樣品質(zhì)量并測定鐵含量。

2 結果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 壁芯比對包埋率的影響

壁材與芯材的比例是決定芯材包埋率的一個重要因素。本實驗中的壁材為SPI和果膠,芯材為EPI和大豆油。SPI具有較高的電荷性和較多的親水、疏水基團,在體系中具有強乳化性,能較好地起到穩(wěn)定芯材的作用[19];果膠具有較高的穩(wěn)定性、膠凝性,可以作為乳化穩(wěn)定劑穩(wěn)定水油乳濁液[20]。如圖1-a所示,隨著壁芯比的逐漸增大,芯材的包埋率先增加后減小。當壁芯質(zhì)量比為1∶3和1∶2時,芯材的包埋率較低,此時體系中的SPI與果膠含量過少,難以形成凝膠網(wǎng)絡狀體系,因此對芯材的包覆能力不足。當壁芯質(zhì)量比為2∶1時,芯材的包埋率達最大值74.30%。當壁芯比為3∶1時,芯材的包埋率開始出現(xiàn)下降,可能因為此時SPI與果膠過多,造成兩者在溶液中凝集,不利于對芯材的包埋。因此,最適宜的壁芯質(zhì)量比為2∶1。

a-壁芯質(zhì)量比;b-m(SPI)∶m(果膠);c-包埋時間

壁芯比的變化反映了體系中大豆油的含量變化,隨著壁芯比的增加,大豆油含量也隨之減少。在大豆油含量減少的過程中,包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在大豆油占乳液總含量1/4時達到最高包埋率。在包埋過程中,大豆分離蛋白可以自發(fā)地結合到油-水界面,通過非共價相互作用在油滴周圍形成凝膠狀膜,可抵抗油滴的聚結,使乳液具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性[21]。隨著大豆油相對含量的適度減少與壁材的增多,降低了在乳化過程中油滴分布不均勻的幾率,避免了油滴聚集,形成了更穩(wěn)定的O/W體系。當大豆油含量過少時,油水比例失衡,包埋率反而下降。

此外,隨著大豆油的增加,經(jīng)冷凍干燥后得到的微膠囊粉末也呈現(xiàn)出表面更濕潤的特點,可能是大豆油過多時油-水比例失衡,導致形成的O/W體系不穩(wěn)定,使部分油滴聚結、外泄,導致包埋率下降的同時,微膠囊的外觀也受到了較大的影響,表現(xiàn)出不良感官體驗。

2.1.2 SPI與果膠比例對包埋率的影響

如圖1-b所示。當m(SPI)∶m(果膠)為3∶7至5∶5之間時,即SPI含量小于果膠時,隨著比例的增大,包埋率上升。當m(SPI)∶m(果膠)為5∶5時,芯材包埋率達最大值73.61%。當m(SPI)∶m(果膠)比例繼續(xù)增大時,即SPI含量大于果膠時,隨著比例的增大,包埋率先下降后保持平穩(wěn)。因為在包埋的體系中,SPI具有強乳化性;而果膠具有較高的穩(wěn)定性、膠凝性。當SPI含量過高時,果膠含量過低時,體系缺乏穩(wěn)定性,無法形成足夠穩(wěn)定的凝膠結構將芯材完全包覆,使包埋率下降;當SPI含量過低時,果膠含量過高時,由于果膠過于黏稠,無法使壁材與芯材充分接觸,從而影響包埋率。因此,最適宜的SPI與果膠質(zhì)量比例為5∶5。

2.1.3 包埋時間對包埋率的影響

如圖1-c所示,在不改變其他工藝條件時,包埋時間越長,包埋率逐漸升高后降低,在40 min處達到最大值78.72%。當攪拌時間<40 min時,隨著攪拌時間的延長,包埋率逐漸增大。充分的攪拌可以促使體系變得均一穩(wěn)定,讓果膠能夠更好地包覆在芯材和SPI表面,因此包埋率逐漸增大。當攪拌時間足夠充分后,繼續(xù)攪拌,對包埋率的影響并不明顯,故攪拌時間50 min處的包埋率與40 min時未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。因此,最適宜的攪拌時間在40 min左右。

2.2 正交試驗分析

根據(jù)單因素試驗結果得到制備EPI微膠囊適宜的壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠的質(zhì)量比例以及包埋時間。為了進一步考察各因素對EPI微膠囊芯材包埋率影響的主次關系和交互作用,并得到最優(yōu)的制備工藝條件,以上述指標為3個因素,并選取適當水平,進行正交試驗。對實驗結果進行極差和方差分析,如表3和表4所示。

表3 正交試驗結果和極差分析

表4 正交試驗結果的方差分析

由表3可知,正交試驗極差的順序比較依次為:A(壁芯比)>B(SPI:果膠)>C(包埋時間),表明壁芯比為排名第一位的影響因素,第二重要的影響因素是SPI與果膠的比例,最后的影響因素是攪拌時間。對正交試驗數(shù)據(jù)進行方差分析(表4),當各變異來源的平均偏差平方和大于誤差e△的平均偏差平方和時即具備F值,當F值大于相應自由度下的Fα時表明該因素差異顯著。方差分析結果顯示,因素A、B具有顯著性(P<0.05),表明壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠的質(zhì)量比例對實驗結果有重要影響,且A與B條件存在交互作用,而C(攪拌時間)對包埋率的影響不顯著(P>0.05)。制備EPI微膠囊的最優(yōu)參數(shù)組合為A3B2C1,即:壁芯質(zhì)量比為3∶1、m(SPI)∶m(果膠)為6∶4、攪拌時間為30 min,為序號22的實驗。該組合能使包埋率最高,包埋率達86.69%,驗證后發(fā)現(xiàn)大于表3中各組包埋率,可確定該組合是最優(yōu)工藝參數(shù)。

2.3 理化性質(zhì)表征

2.3.1 EPI微膠囊實物形態(tài)

對最優(yōu)工藝參數(shù)制備得到的EPI微膠囊進行感官評價,評估其色澤、氣味和組織狀態(tài)。品質(zhì)較好的微膠囊具備以下特征:光滑、顆粒均勻、無異味、呈圓球形且結構緊密[22]。如圖2所示,EPI粉末呈棕褐色,顆粒小,存在輕微鐵銹味,EPI微膠囊呈淺褐色,顆粒變大,外觀蓬松,略帶乳粉香氣。大豆分離蛋白和果膠的包覆使得微膠囊顏色變淺,且包埋掩蓋了EPI的鐵銹味,使其具備更加優(yōu)良的氣味特征。

a-EPI;b-EPI微膠囊

2.3.2 EPI微膠囊粒徑分布

EPI微膠囊的粒度測定結果如圖3所示,EPI粒度呈偏態(tài)分布,分布較為分散,推測可能是樣品在進行粒徑測定時發(fā)生了聚集,導致粒度分布范圍廣,不均一,平均粒度為89.48 μm。而經(jīng)過包埋處理后制得的EPI微膠囊粒徑分布范圍變窄,呈正態(tài)分布,平均粒徑為119.50 μm?？梢娢⒛z囊化包埋處理改善了EPI粒徑分布過于分散的問題。

a-EPI;b-EPI微膠囊

2.3.3 EPI微膠囊顯微結構

如圖4所示, EPI呈大小不一的片狀結構,表面光滑平整,呈折疊聚集狀,并形成了部分斷裂聚集的團狀顆粒。這是由于Fe2+與多肽鏈中的羧基氧和氨基氮結合,導致多肽鏈發(fā)生折疊造成的[11]。經(jīng)過包埋制得的EPI微膠囊形態(tài)上發(fā)生了較明顯的變化,呈凝聚黏連的球狀結構,表面致密,無棱角,表明壁材對EPI進行了完整包覆。但EPI微膠囊并未呈完美的球狀或橢球狀微膠囊形態(tài),推測這是由于EPI本身的不規(guī)則片狀結構,且果膠包埋后相互之間出現(xiàn)了黏連所導致的。

a-EPI 1 000×;b-EPI微膠囊1 000×;c-EPI 5 000×;d-EPI微膠囊5 000×

2.3.4 含水量和吸水性

MENDANHA等[13]的研究顯示含水量和吸水性是顯著評價微膠囊效果的參考指標,也是評價微膠囊穩(wěn)定性的指標。EPI與EPI微膠囊的含水量和吸水性的測定結果表明(表5),兩者含水量相差不大,但EPI的吸水性約為微膠囊產(chǎn)品的2倍,即EPI微膠囊自由狀態(tài)下的吸水性較芯材EPI顯著降低,更便于儲藏。

表5 EPI和EPI微膠囊的含水量和吸水性

2.4 穩(wěn)定性分析

2.4.1 消化穩(wěn)定性

以大豆分離蛋白和果膠包埋EPI的目的在于保護EPI在胃部免受胃酸破壞,能更穩(wěn)定地到達腸道吸收部位,并在消化過程中盡量減少Fe2+的產(chǎn)生。因此對EPI和EPI微膠囊的胃腸道消化穩(wěn)定性進行考察。如圖5-a所示,在胃消化過程中(0～120 min),EPI及其微膠囊均釋放出Fe2+,但初始狀態(tài)下EPI即釋放出更多Fe2+。在胃消化前60 min,兩者Fe2+含量均顯著升高,胃消化60～120 min,Fe2+升高幅度明顯減緩?？傮w而言,EPI在胃消化過程中游離Fe2+的濃度均高于EPI微膠囊,表明EPI微膠囊具備更高的胃消化穩(wěn)定性。

a-模擬胃消化;b-模擬腸消化

如圖5-b所示,在腸消化過程中,EPI與EPI微膠囊消化性能差異顯著。胃消化后進入腸消化的過程中,由于pH的快速改變,EPI及其微膠囊的Fe2+濃度發(fā)生了較大的改變。腸消化初期,EPI溶液中Fe2+依然逐步上升,而EPI微膠囊Fe2+含量發(fā)生了下降。推測可能是由于本實驗所采用的大豆分離蛋白(等電點pI=8.0)在酸性環(huán)境下更容易溶解釋放出部分EPI,且實驗所采用的低酯果膠在較高pH值條件下更為穩(wěn)定,因此在腸消化段,果膠再次發(fā)生聚集。在腸消化開始30 min之后,EPI和EPI微膠囊的Fe2+釋放趨勢相同,均呈現(xiàn)緩慢增長,但微膠囊釋放的Fe2+顯著低于EPI,表明在腸道消化環(huán)境下,微膠囊比EPI更穩(wěn)定。其原因可能是微膠囊以大豆分離蛋白和果膠作為壁材,對EPI起到了保護的作用,從而使Fe2+在消化道中保持結合形態(tài),便于EPI直接以肽鐵螯合物分子的形式被人體吸收,能夠提高其利用率[23-24]。

有研究表明,果膠的膠鏈之間可通過作用力形成三維網(wǎng)狀凝膠結構包覆益生菌,其中高酯果膠靠氫鍵連接,低酯果膠靠靜電相互作用連接,包覆后形成的微膠囊可幫助益生菌抵抗胃腸道的強酸性環(huán)境[25]。ZHANG等[26]利用Ca2+交聯(lián)甜菜果膠法提高了唾液乳桿菌在胃腸道模擬消化條件下的存活率。因此包埋有利于保持EPI的螯合率及活性。在腸消化60～90 min過程中,EPI和EPI微膠囊所釋放的Fe2+濃度均有所下降。氨基酸殘基與金屬相互作用的有效性與pH有關,肽的凈電荷也是如此,它可能變成中性、負性或正電荷,從而阻礙或促進靜電相互作用[27],因此推測此時游離Fe2+與肽重新發(fā)生了螯合。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

EPI和EPI微膠囊的熱穩(wěn)定性測定結果如圖6所示,EPI的鐵螯合率隨著溫度的升高逐漸下降,50 ℃時螯合率達到最低值,50 ℃以上趨于穩(wěn)定。EPI微膠囊在所測定的各個溫度下,螯合率均高于EPI。表明EPI微膠囊具有更高的熱穩(wěn)定性。陳忠寶[28]利用離子交聯(lián)法,以果膠與殼聚糖作為壁材包埋制備得到的藍靛果多酚微膠囊,其在 100 ℃下的穩(wěn)定性較芯材多酚提升了27.3%,與本文得出的結果類似。

圖6 EPI和EPI微膠囊的熱穩(wěn)定性

2.5 腸道緩釋行為分析

灌胃前小鼠各個時段的糞便鐵含量測定結果如圖7-a所示。由于期間仍攝食低鐵飼料,故IDA小鼠糞便中仍含有微量鐵,鐵含量呈小范圍波動,總體保持平穩(wěn)。如圖7-b所示,灌胃EPI后4 h,糞便中鐵含量快速上升,在接近6 h時達到最高值9.66 μg/h,隨后逐漸下降,8 h處略微升高,之后下降并趨于平緩。灌胃EPI微膠囊后6 h,糞便鐵含量快速上升,在接近8 h時達到最高值6.80 μg/h,隨后鐵含量降低,在9～10 h略有上升后趨于平緩。從結果中可以發(fā)現(xiàn),補充EPI及EPI微膠囊后糞便中的鐵含量都出現(xiàn)了快速上升的高峰,這是由于灌胃補鐵劑引起瞬時鐵濃度上升,機體消化吸收后排出的剩余鐵所引起的糞便鐵含量升高。但EPI微膠囊的鐵含量的達峰時間較EPI延遲2 h,分析原因可能是微膠囊有壁材包裹,胃腸道中的酶先對果膠和大豆分離蛋白進行酶解消化,故延緩了EPI釋放的時間,表明EPI微膠囊達到了緩釋的效果。

a-灌胃前;b-灌胃后

分別計算EPI鐵含量曲線4～7 h和EPI微膠囊鐵含量曲線6～9 h下的面積(最高峰出現(xiàn)時段),其面積大致可以反映糞便排出的最大鐵量,結果表明,攝入EPI曲線面積為37.67 μg,EPI微膠囊的曲線面積為26.92 μg,未被吸收的鐵越多,表明機體吸收利用越少。以上結果顯示EPI微膠囊可以降低糞便中殘余鐵的含量,并降低鐵排出瞬時濃度,提高鐵的吸收利用度,達到緩釋效果。徐軍等[29]研究表明,口服琥珀酸亞鐵緩釋片可以降低鐵的釋放速率和鐵吸收進入機體的速率,避免胃腸道Fe2+峰濃度過大,與本研究結果相似。此外,相較于緩釋處理前的藥物,該緩釋片減小了對妊娠期IDA女性的胃腸道刺激性,極大減少惡心嘔吐、胃疼、腹瀉等不良反應。故EPI微膠囊有望更好地調(diào)控IDA小鼠的腸道健康,但其功效仍需進一步研究。

3 結論

本研究采用單因素試驗和正交試驗方法探究EPI微膠囊化最優(yōu)工藝,通過單因素試驗分別考察壁芯質(zhì)量比、SPI與果膠質(zhì)量比例、攪拌時間對包埋率的影響,得到最適宜的壁芯質(zhì)量比為2∶1,SPI與果膠質(zhì)量比為5∶5,攪拌時間為40 min。通過正交試驗進一步考察各因素影響EPI微膠囊芯材包埋率的主次關系,并得到最優(yōu)參數(shù)組合:壁芯質(zhì)量比3∶1、SPI與果膠質(zhì)量比6∶4、攪拌時間30 min,包埋率達86.69%。對最優(yōu)條件下制得的EPI微膠囊進行理化性質(zhì)的表征,結果表明EPI微膠囊的粒徑分布更窄,平均粒徑為119.50 μm;吸水性顯著降低至(25.64±0.97)%。EPI微膠囊在胃腸道模擬消化過程中釋放的Fe2+含量顯著低于EPI(P<0.05),在20～80 ℃下的鐵螯合量顯著高于EPI(P<0.05),表明其消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性提高。此外,EPI微膠囊還可以降低糞便中殘余鐵的含量,將腸道鐵含量達峰時間延遲2 h。研究結果為阿膠產(chǎn)品開發(fā)的多樣化提供了科學基礎。