邢苗苗，許園園，盧昱宇，嚴(yán)繼勇，曾愛(ài)松

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得青花菜Ogura CMS恢復(fù)系

邢苗苗，許園園，盧昱宇，嚴(yán)繼勇，曾愛(ài)松

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014

【目的】將來(lái)自蘿卜的胞質(zhì)不育恢復(fù)基因?qū)氲角嗷ú薕gura細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）主栽商業(yè)品種‘耐寒優(yōu)秀’（命名為SFB45）中，獲得Ogura CMS恢復(fù)系，打破Ogura CMS材料在生產(chǎn)上無(wú)法再利用的現(xiàn)狀，為優(yōu)異種質(zhì)的創(chuàng)制和改良提供新途徑。【方法】利用基因合成的方法克隆蘿卜的CDS及其啟動(dòng)子序列，構(gòu)建表達(dá)載體::。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法侵染SFB45的具柄子葉和下胚軸，進(jìn)行再生、抗性苗篩選和PCR鑒定獲得陽(yáng)性植株，開(kāi)花期觀察轉(zhuǎn)基因植株的育性恢復(fù)情況；用亞歷山大染液分析對(duì)照組及陽(yáng)性株的花粉活力；分別提取對(duì)照組及陽(yáng)性株＜3 mm和＞3 mm花蕾的RNA并反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR分析及絨氈層和花粉壁發(fā)育相關(guān)基因在SFB45及對(duì)應(yīng)的育性恢復(fù)材料花蕾中的表達(dá)差異?！窘Y(jié)果】通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化共獲得10個(gè)陽(yáng)性株系，其中8個(gè)株系育性得到不同程度的恢復(fù)，花粉活力為84.2%—90.4%。RT-PCR分析結(jié)果表明，育性恢復(fù)植株花蕾中表達(dá)，絨氈層發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和及花粉壁主要成分孢粉素合成所必需的基因在育性恢復(fù)植株＜3 mm花蕾中上調(diào)表達(dá)。絨氈層降解相關(guān)基因、四分體胼胝質(zhì)壁及花粉外壁發(fā)育所必需的基因和在育性恢復(fù)植株＞3 mm花蕾中上調(diào)表達(dá)。分析陽(yáng)性株系和自交及雜交后代發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的能穩(wěn)定遺傳，符合孟德?tīng)栠z傳?！窘Y(jié)論】通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得了優(yōu)良青花菜Ogura CMS商品種SFB45的育性恢復(fù)系，且的轉(zhuǎn)入使絨氈層及花粉壁發(fā)育相關(guān)基因恢復(fù)正常表達(dá)。

青花菜；遺傳轉(zhuǎn)化；Ogura CMS；；絨氈層和花粉壁發(fā)育相關(guān)基因

0 引言

【研究意義】青花菜（L. var.）又名西蘭花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中的一個(gè)變種，其營(yíng)養(yǎng)成分含量高，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素C等，還含有3-甲基吲哚基硫苷和4-甲基硫氧丁基硫苷等抗癌、防癌活性物質(zhì)，被譽(yù)為“蔬菜皇冠”[1-5]。近年來(lái)我國(guó)青花菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積已超過(guò)8.7萬(wàn)公頃[6]。但是，我國(guó)青花菜種質(zhì)資源匱乏，與國(guó)外進(jìn)口品種相比，我國(guó)自主育成的品種在花球商品性、耐貯性和適應(yīng)性等方面存在較大差距。目前，我國(guó)青花菜栽培面積中，國(guó)外進(jìn)口品種約占85%，且均表現(xiàn)為Ogura類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）。由于CMS為母系遺傳的不育類型，其優(yōu)異性狀無(wú)法被分離出來(lái)，阻礙了優(yōu)異育種材料的創(chuàng)新。因此，恢復(fù)Ogura CMS材料的育性，打破其優(yōu)良性狀無(wú)法利用的壁壘，對(duì)于青花菜種質(zhì)創(chuàng)新具有重要的意義和價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】青花菜起源于歐洲，在我國(guó)的栽培始于20世紀(jì)80年代，栽培時(shí)間短、育種起步晚、優(yōu)異種質(zhì)資源匱乏[7]。目前，市場(chǎng)上優(yōu)良的青花菜多為進(jìn)口品種，在抗逆性、廣適性、花球商品性、耐貯性等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但均為Ogura CMS不育類型，無(wú)法進(jìn)行種質(zhì)資源再利用[8]，亟需創(chuàng)制Ogura CMS的育性恢復(fù)系。Ogura CMS不育源是Ogura在蘿卜群體中發(fā)現(xiàn)的自然突變體[9]，由于其線粒體重排產(chǎn)生的嵌合基因?qū)е禄ㄋ幉荒墚a(chǎn)生正?；ǚ鄱鴶∮齕10]。青花菜Ogura CMS不育系是研究者通過(guò)蘿卜與甘藍(lán)屬間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚挽救以及原生質(zhì)體非對(duì)稱融合并結(jié)合多代回交轉(zhuǎn)育等方法創(chuàng)制[11]。由于Ogura CMS系敗育徹底、不育性穩(wěn)定，成為目前青花菜雜交制種中應(yīng)用最廣泛的不育親本。Ogura CMS類型的恢復(fù)系只存在于蘿卜中，其育性恢復(fù)基因包含18個(gè)pentatricopeptide repeat基序[12-13]。直接或者間接與的mRNA結(jié)合，影響其轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性，降低其蛋白含量，使育性恢復(fù)[14-15]。研究者已通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交等手段將成功轉(zhuǎn)入到了甘藍(lán)型油菜中[16-17]。為了將導(dǎo)入甘藍(lán)類蔬菜，于海龍[11]利用Ogura CMS芥藍(lán)為母本與甘藍(lán)型油菜（含）遠(yuǎn)緣雜交獲得恢復(fù)單株，并通過(guò)連續(xù)回交得到形態(tài)與親本芥藍(lán)相近的恢復(fù)材料。黃靜靜等[18]利用Yu等[19]獲得的遠(yuǎn)緣雜交材料，與Ogura CMS青花菜進(jìn)行雜交、回交，獲得了株型接近青花菜的恢復(fù)系。LI等[20]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因體系將Rfo轉(zhuǎn)入了甘藍(lán)Ogura CMS系CMS2016，獲得了育性恢復(fù)轉(zhuǎn)基因株系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交手段創(chuàng)制Ogura CMS恢復(fù)系的策略存在耗時(shí)長(zhǎng)、供體基因背景難以消除、傳遞率低等問(wèn)題[21]。而通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段將轉(zhuǎn)入甘藍(lán)能快速、穩(wěn)定地獲得Ogura CMS育性恢復(fù)系[20]。但目前并未有報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段直接將轉(zhuǎn)入青花菜Ogura CMS材料，以快速獲得青花菜Ogura CMS的恢復(fù)系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青花菜遺傳轉(zhuǎn)化方法將整合至主栽優(yōu)良青花菜CMS品種SFB45基因組中，并以此為父本創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及栽培條件

青花菜商品種‘耐寒優(yōu)秀’（命名為SFB45）、‘米修斯’（命名為MXS）購(gòu)自青島官明天成種業(yè)有限公司（青島，中國(guó)）。

表達(dá)載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍(lán)青花菜課題組惠贈(zèng)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青花菜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)于2020— 2021年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所進(jìn)行，將野生型和鑒定為陽(yáng)性的植株移栽至營(yíng)養(yǎng)缽（10 cm×10 cm），在光照培養(yǎng)室里生長(zhǎng)（25℃，日照16 h/黑暗8 h），待根成團(tuán)后于2021年10月底移栽至江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)基地大棚，越冬春化后，2022年4月開(kāi)花。

1.2 pRfo::Rfo表達(dá)載體構(gòu)建

在NCBI（National Center for Biotechnology Information）搜索并下載蘿卜的啟動(dòng)子2 000 bp及CDS序列2 064 bp（NCBI序列號(hào)為AJ550021），利用基因合成的方法合成其序列，并連接到PUC57中間載體上，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)（I和B I）的引物，以PUC57載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)B I酶切后，啟動(dòng)子與CDS序列進(jìn)行連接，通過(guò)I酶切位點(diǎn)將載體pBWA (V) BS的目的區(qū)域切開(kāi)，啟動(dòng)子及CDS序列構(gòu)建至載體pBWA(V)BS上，獲得表達(dá)載體::。利用熱激法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取10個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定和一代測(cè)序，利用LB液體培養(yǎng)基（含50 mg?L-1利福平及100 mg?L-1卡那霉素）保存::序列正確的農(nóng)桿菌。所有方法步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法及培養(yǎng)基配方（表1）參照崔慧琳[22]的方法并稍作改變。具體步驟如下：

（1）種子消毒：將200—300粒種子放在干凈的50 mL離心管中，75%酒精消毒2 min、7%—10%次氯酸鈉消毒10 min，滅菌的ddH2O清洗3次（3—5 min/次），將種子放在滅菌的濾紙上吸掉表面水分；

（2）播種：用滅菌后的鑷子將種子移到MS培養(yǎng)基里，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)4—6 d，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，25 ℃；

（3）外植體預(yù)培養(yǎng)：滅菌后用手術(shù)刀或者手術(shù)剪刀將具柄子葉及下胚軸切下（下胚軸長(zhǎng)度約為1 cm），并及時(shí)將外植體放在預(yù)培養(yǎng)基上，正常培養(yǎng)2 d；

（4）農(nóng)桿菌液制備：取4 ℃保存的帶目的載體的農(nóng)桿菌菌液加入LB液體培養(yǎng)基（含50 mg?L-1利福平及100 mg?L-1卡那霉素），在28 ℃搖床上培養(yǎng)10—14 h，至OD600為0.4—0.6，6 000 r/min離心8 min，棄上清，用MS液體培養(yǎng)基重懸清洗一次，再次離心（6 000 r/min，8 min），用等量的MS溶液重懸備用；

（5）侵染：提前在培養(yǎng)皿中放入15 mL的MS溶液，隨后將外植體放入培養(yǎng)皿中，再加入15 mL MS重懸的菌液；輕輕晃動(dòng)10 min；

（6）共培養(yǎng)：倒掉菌液，將外植體在濾紙上晾干，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)36—48 h；

（7）延遲培養(yǎng)：將共培養(yǎng)培養(yǎng)基上的外植體轉(zhuǎn)入延遲培養(yǎng)基上培養(yǎng)4—7 d；

（8）選擇培養(yǎng)：將外植體轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每14 d更換一次培養(yǎng)基，篩選2—3次；

（9）抗性芽培養(yǎng)：將外植體上長(zhǎng)出的抗性芽切下來(lái)放入長(zhǎng)苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同步驟（2）；

（10）生根培養(yǎng)：將PCR鑒定為陽(yáng)性的植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d。

1.4 轉(zhuǎn)基因株系的鑒定及絨氈層、花粉壁相關(guān)基因的表達(dá)

利用改良的CTAB法提取抗性植株的DNA，使用標(biāo)記（-F/R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。利用朱琴等[23]開(kāi)發(fā)的Ogura CMS相關(guān)的標(biāo)記Bo138-FR確認(rèn)轉(zhuǎn)基因株系為Ogura CMS不育。20 μL PCR反應(yīng)體系包含PCR mix 10 μL，10 μmol?L-1上、下游引物各1 μL，Template 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR mix為2×TSINGKE Master Mix（blue）（擎科生物，北京，中國(guó)）。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃，5 min。

使用RNeasy?Plant Mini Kit試劑盒（Qiagen，Hilde，Germany）提取對(duì)照及陽(yáng)性植株花蕾的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟參照使用說(shuō)明。以甘藍(lán)（GenBank號(hào)：XM_013731369.1）為內(nèi)參，利用qRT-PCR分析及絨氈層、花粉壁發(fā)育相關(guān)基因在對(duì)照及陽(yáng)性植株花蕾中的表達(dá)情況（每個(gè)樣本3次生物學(xué)重復(fù)）。使用的DNA Marker為DL2000 DNA marker（擎科生物，北京，中國(guó)），貨號(hào)：TSJ011-100。相關(guān)引物（表2）利用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/）在線設(shè)計(jì)。

1.5 花粉活力檢測(cè)

利用亞歷山大染色液（Leagene，北京佰凱生物科技有限公司）對(duì)育性恢復(fù)植株的花粉進(jìn)行活力檢測(cè)，方法參考說(shuō)明書(shū)：在開(kāi)花盛期取新開(kāi)的5朵花，將花粉彈至載玻片上，用200 μL的槍滴加8滴染色液，蓋上蓋玻片進(jìn)行染色，30 min后在顯微鏡（OLYMPUS BX41，日本）下觀察。

2 結(jié)果

2.1 pRfo::Rfo載體構(gòu)建

經(jīng)I酶切后，載體上的毒性基因被切除，然后與經(jīng)I和B I酶切后的啟動(dòng)子和CDS片段進(jìn)行連接，形成::表達(dá)載體。空載體和構(gòu)建好的載體見(jiàn)圖1。

表2 本研究所使用的引物

2.2 Rfo轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的獲得及鑒定

將構(gòu)建的表達(dá)載體::轉(zhuǎn)入青花菜SFB45的下胚軸及具柄子葉，通過(guò)再生、篩選后獲得了抗性植株（圖2）。提取抗性植株的DNA，擴(kuò)增抗除草劑標(biāo)記基因及胞質(zhì)不育基因片段，鑒定出10個(gè)陽(yáng)性植株，及擴(kuò)增片段大小分別為300和428 bp，表明恢復(fù)基因已整合至Ogura CMS青花菜SFB45的基因組中（圖3）。

A：pBWA (V) BS空載體表達(dá)元件TDNA的結(jié)構(gòu)示意圖；B：表達(dá)載體pRfo::Rfo的TDNA表達(dá)元件結(jié)構(gòu)示意圖

A：MS培養(yǎng)基播種；B：具柄子葉和下胚軸預(yù)培養(yǎng)；C：抗性芽篩選培養(yǎng)；D：抗性苗篩選培養(yǎng)；E：陽(yáng)性植株；F：陽(yáng)性植株開(kāi)花期

2.3 陽(yáng)性植株表型及花粉活力鑒定

盛花期觀察發(fā)現(xiàn)10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有8個(gè)育性得到恢復(fù)，另外2個(gè)仍為完全不育。相比Ogura CMS植株，育性恢復(fù)植株的花絲花藥顯著伸長(zhǎng)（圖3）。8個(gè)恢復(fù)系的育性恢復(fù)程度不同，其中有2個(gè)株系（編號(hào)-1、-2）育性得到了完全恢復(fù)。其他6個(gè)植株僅部分花朵的部分雄蕊產(chǎn)生花粉。根據(jù)雄蕊的育性恢復(fù)情況，可分為5種類型：（1）6個(gè)雄蕊均有花粉；（2）4個(gè)雄蕊有花粉；（3）3個(gè)雄蕊有花粉；（4）2個(gè)雄蕊有花粉；（5）無(wú)花粉（圖4）。

利用亞歷山大染液對(duì)代表不同育性恢復(fù)程度的植株（-1、-3、-6、-8）的花粉進(jìn)行染色，有活力的花粉粒飽滿，顏色染為紅色；無(wú)活力的花粉?；?、顏色淺或者為白色（圖5），花粉活力平均值分別為90.4%（-1）、86.7%（-3）、87.5%（-6）、84.2%（-8）。

2.4 陽(yáng)性植株花蕾中Rfo及絨氈層花粉壁相關(guān)基因的表達(dá)

分析在轉(zhuǎn)基因育性恢復(fù)材料-1中＜3 mm和＞3 mm花蕾的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在＞3 mm花蕾中的表達(dá)明顯升高，是在＜3 mm花蕾中表達(dá)水平的11.26倍（圖6）。由于Ogura CMS胞質(zhì)不育是由絨氈層異常、花粉壁不能正常形成所導(dǎo)致，本研究選取一些調(diào)控絨氈層發(fā)育、凋亡及花粉壁形成的關(guān)鍵基因[24]，利用熒光定量PCR分析其在不育對(duì)照材料SFB45和-1中的表達(dá)情況（圖6）。絨氈層發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（）和（）在不育對(duì)照材料SFB45花蕾（＜3 mm）中表達(dá)極低，而在轉(zhuǎn)基因育性恢復(fù)材料花蕾（＜3 mm）中表達(dá)水平升高了近10倍。（）同源基因在水稻中突變表現(xiàn)為絨氈層延遲降解，該表型與Ogura CMS胞質(zhì)不育敗育特征類似[25]。這兩個(gè)AMS基因在-1花蕾（＞3 mm）中表達(dá)明顯升高，與不育材料SFB45相比，分別升高了近20倍和40倍?；ǚ弁獗诘闹饕煞宙叻鬯睾铣伤匦璧幕颍ǎ26]和（）[27]在-1花蕾（＜3 mm）和（＞3 mm）中的表達(dá)水平均明顯升高。四分體胼胝質(zhì)壁及花粉外壁發(fā)育所必需的基因（）[28]在-1花蕾（＞3 mm）中比SFB45的表達(dá)水平約升高了53倍。表明的轉(zhuǎn)入使絨氈層及花粉壁發(fā)育相關(guān)的基因得以正常表達(dá)。

A：Ogura CMS orf138標(biāo)記檢測(cè)。泳道#1為陰性對(duì)照，模板為甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株e-10（含Bar）；泳道#2為陽(yáng)性對(duì)照，模板為SFB45。B：除草劑抗性基因Bar標(biāo)記檢測(cè)。泳道#1為陰性對(duì)照，模板為SFB45；泳道#2為陽(yáng)性對(duì)照，模板為e-10。A和B中#3—#12泳道為陽(yáng)性植株（R-1—R-10）

圖中比例尺為50 μm Scale bar is 50 μm

圖中R-1s和R-1L分別代表恢復(fù)系R-1的＜3 mm及＞3 mm花蕾；45s和45L分別代表Ogura CMS SFB45的＜3 mm及＞3 mm花蕾

2.5 陽(yáng)性植株自交及雜交后代分析

利用標(biāo)記對(duì)陽(yáng)性植株自交及雜交后代進(jìn)行鑒定，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性植株及檢測(cè)總數(shù)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明χ2均小于3.84，說(shuō)明育性恢復(fù)材料-1、-3和-6的自交后代中含標(biāo)記的植株與不含標(biāo)記的植株符合3﹕1分離比；以-3為父本與青花菜Ogura CMS商品種MXS的雜交后代中含標(biāo)記的植株與不含標(biāo)記的植株符合1﹕1分離比（表3）。結(jié)果表明整合進(jìn)-1、-3和-6基因組的在其T1后代中的分離符合孟德?tīng)栠z傳，能夠穩(wěn)定遺傳。

表3 R-1、R-3和R-6轉(zhuǎn)基因株系后代陽(yáng)性植株遺傳分離統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 不同陽(yáng)性株系育性恢復(fù)程度存在差異

轉(zhuǎn)基因植株中外源基因隨機(jī)插入其基因組內(nèi)，插入的拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)會(huì)影響基因的表達(dá)。所有植物轉(zhuǎn)基因都存在不同株系中基因差異表達(dá)或沉默等導(dǎo)致的表型差異現(xiàn)象[29]。崔慧琳[22]將控制白花的基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)植株中，不同陽(yáng)性株系中該基因表達(dá)量及花色變白的程度不同。Qin等[13]研究Ogura CMS甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因株系發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生有活力花粉的量與轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)以及Ogura CMS相關(guān)蛋白ORF138水平的降低有關(guān)，產(chǎn)生大量有活力花粉的轉(zhuǎn)基因株系中存在2—3個(gè)拷貝而花粉活力低的株系中僅存在1個(gè)拷貝。但針對(duì)拷貝數(shù)不同的研究有不同的結(jié)論。轉(zhuǎn)基因株系中基因表達(dá)量及達(dá)到預(yù)期表型的程度不僅與拷貝數(shù)多少有關(guān)，也與重復(fù)插入或T-DNA重排有關(guān)。研究表明表達(dá)水平和-葡萄糖醛酸酶活性在轉(zhuǎn)入1個(gè)拷貝的煙草株系中比在同一位點(diǎn)插入2個(gè)反向、重復(fù)拷貝的株系中要高[30]。De Buck等[31]研究表明大多數(shù)單拷貝擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的基因表達(dá)量高，并且發(fā)現(xiàn)單拷貝轉(zhuǎn)基因株系中基因表達(dá)與插入位置（如基因間區(qū)、基因內(nèi)、內(nèi)含子、外顯子、正、反向插入等）關(guān)系不大。雖然單拷貝轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量高，但也有研究表明會(huì)存在轉(zhuǎn)錄后或表觀沉默現(xiàn)象，另外插入位點(diǎn)也會(huì)影響表達(dá)及表型[32-34]。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)基因株系中基因表達(dá)量及表型差異是一個(gè)非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)化問(wèn)題。本研究中不同陽(yáng)性植株育性恢復(fù)程度的差異可能與的拷貝數(shù)及其插入位點(diǎn)、是否重復(fù)插入、重排、轉(zhuǎn)化過(guò)程中其他因素等有關(guān)。

3.2 Rfo的轉(zhuǎn)入使絨氈層及花粉壁發(fā)育相關(guān)基因恢復(fù)正常表達(dá)

十字花科的模式植物擬南芥花藥發(fā)育分為14個(gè)時(shí)期[35]。1—5時(shí)期是從花藥原基分化出雄蕊原基開(kāi)始至形成花粉母細(xì)胞；6—8時(shí)期包括花粉母細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間形成胼胝質(zhì)層，減數(shù)分裂完成形成四分體，絨氈層細(xì)胞開(kāi)始降解，包圍四分體的胼胝質(zhì)壁和花粉母細(xì)胞壁降解，小孢子釋放；9—14時(shí)期包括小孢子壁形成，小孢子經(jīng)歷兩次有絲分裂，三核花粉粒形成，花藥開(kāi)裂，花粉釋放[35]?？悼「鵞36]通過(guò)透射顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)蘿卜Ogura CMS的主要敗育特征是從減數(shù)分裂后期開(kāi)始（即花藥發(fā)育的第6—8時(shí)期），絨氈層細(xì)胞進(jìn)行性加厚而不降解，這一異常增生擠壓被釋放的小孢子致其敗育，花粉粒細(xì)胞壁延遲形成。本研究中熒光定量分析結(jié)果與這一敗育特征一致，即調(diào)控絨氈層發(fā)育及凋亡和調(diào)控花粉壁合成相關(guān)的基因在不育材料中均表達(dá)極低甚至不表達(dá)，而在育性恢復(fù)的轉(zhuǎn)材料中表達(dá)明顯升高。是如何調(diào)控這些下游基因的表達(dá)尚待進(jìn)一步研究。前人的研究均關(guān)注到恢復(fù)材料中ORF138蛋白水平與育性恢復(fù)程度成反比，但并未詳細(xì)研究的表達(dá)情況與育性恢復(fù)的關(guān)系，僅Brown等[37]分析了在蘿卜恢復(fù)系材料的子葉、葉片、花中表達(dá)，而在根中不表達(dá)，而Qin等[13]的研究說(shuō)明表達(dá)水平需要達(dá)到一定的閾值才能使育性恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)在育性恢復(fù)材料＞3 mm的花蕾中的表達(dá)水平明顯高于在＜3 mm花蕾中的表達(dá)，表明相較于花藥發(fā)育前期，后期發(fā)育可能需要更多的參與。調(diào)控Ogrua CMS育性恢復(fù)的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將蘿卜Ogura CMS的育性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)入青花菜商業(yè)品種SFB45中，獲得了8個(gè)育性恢復(fù)系，可穩(wěn)定遺傳，為青花菜種質(zhì)改良提供了資源；的轉(zhuǎn)入使絨氈層及花粉壁發(fā)育相關(guān)基因恢復(fù)正常表達(dá)，花粉育性得到恢復(fù)。

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Development of Ogura CMS Restorers of Broccoli via Genetic Transformation of

XING MiaoMiao, XU YuanYuan, LU YuYu, YAN JiYong, ZENG AiSong

Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】The broccoli restorers were developed by transforming the matching fertility restorer gene offrom radish into the leading cultivar Ogura CMS line of Nai Han You Xiu (named as SFB45), so as to efficaciously use Ogura cytoplasmic male sterility (CMS) hybrids in breeding and to provide resources for genetic improvement of germplasm.【Method】The sequence of CDS with its preceding promoter ofwere synthesized and the::plant expression vector was constructed to infect the cotyledon with petiole, and hypocotyl explants of the SFB45 through-mediated transformation method. After regeneration and screening of herbicide resistant seedlings, transgenic plants were identified by detection of theresistant marker. The fertility of transgenic plants were observed at flowering stage. The pollen viability of SFB45 and the transgenic plants were analyzed using the alexander stain. Total RNA of ＜3 mm and ＞3 mm flower buds from SFB45 and the transgenic plants were isolated and transcribed into cDNA. Thespecific primers were designed, and RT-PCR was performed to analyze the expression levels ofand also the genes related to tapetum and pollen wall development in flower buds of SFB45 and its restorer lines.【Result】A total of 10 transgenic plants were obtained by genetic transformation. Among which, the fertilities of 8 were restored to varying degrees with the average pollen viability ranging from 84.2% to 90.4%. RT-PCR analysis showed thatwas expressed in flower buds of fertility restored plants. The key regulators of tapetum development (and) and the essential gene () for the synthesis of sporopollenin, a major component of the pollen wall were up-regulated in ＜3 mm flower buds of Ogura CMS restore lines. The tapetum degradation related gene AMS and tetrad callose wall and pollen outer wall development relatedgenesandwere up-regulated in ＞3 mm flower buds of the restore lines. The analysis of the self- and hybrid-crossing progenies of the positive transgenic lines-1,-3 and-6 showed that the introducedcould be stably inherited, which was consistent with the Mendelian inheritance.【Conclusion】The fertility restorer lines of Ogura CMS SFB45 were obtained by genetic transformation of, and the integration ofinto the genome of SFB45 recovered the expression of genes associated with tapetum and pollen wall development.

broccoli; genetic transformation; Ogura CMS;; tapetum and pollen wall development-related genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.011

2022-12-02；

2023-05-22

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院探索性顛覆性創(chuàng)新計(jì)劃（ZX(21)1204）

邢苗苗，E-mail：20200021@jaas.ac.cn。通信作者曾愛(ài)松，E-mail：20000005@jaas.ac.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）