于連偉，姜興林，楊靈玲，王賀，張玉陽(yáng)，謝莉娜，夏子豪，李洪連,3,4，楊雪,2，施艷

轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染中的功能

于連偉1，姜興林1，楊靈玲1，王賀1，張玉陽(yáng)1，謝莉娜1，夏子豪5，李洪連1,3,4，楊雪1,2，施艷1

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后流動(dòng)站，鄭州 450002；3河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；4小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；5沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866

【背景】黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我國(guó)重要的檢疫性植物病毒，對(duì)蔬菜和瓜類(lèi)產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植物生物和非生物脅迫，參與植物對(duì)多種病害的防御作用。前期研究顯示CGMMV侵染后可以顯著下調(diào)寄主轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1的表達(dá)?！灸康摹棵鞔_ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在CGMMV侵染過(guò)程中的作用，為CGMMV病害防治提供理論依據(jù)。【方法】運(yùn)用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)基于NbERF RAP2-1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；構(gòu)建的熒光表達(dá)載體，并觀(guān)察其亞細(xì)胞定位；利用qRT-PCR技術(shù)分析在CGMMV侵染不同時(shí)期的表達(dá)量；通過(guò)煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）介導(dǎo)的基因沉默（VIGS）和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)分析其在CGMMV侵染過(guò)程中的作用?！窘Y(jié)果】系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，NbERF RAP2-1與多種煙草的ERF轉(zhuǎn)錄因子同源性極高，與擬南芥的ERF轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示NbERF RAP2-1定位于細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子行駛功能；CGMMV侵染對(duì)本氏煙內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平影響結(jié)果顯示，在CGMMV侵染6、9、12 d時(shí)的表達(dá)量無(wú)明顯變化，在CGMMV侵染15和18 d時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)；TRV介導(dǎo)的VIGS可以將植物內(nèi)源基因有效沉默，在沉默的植株系統(tǒng)葉上接種CGMMV，8 d對(duì)照植株系統(tǒng)葉出現(xiàn)斑駁、卷曲癥狀而沉默植株無(wú)癥狀，同時(shí)CGMMV RNA水平和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果也表明TRV:可以有效抑制CGMMV的積累；同樣，分別在本氏煙葉片瞬時(shí)過(guò)表達(dá)NbERF RAP2-124、48和72 h時(shí)檢測(cè)CGMMV RNA水平和蛋白水平表達(dá)量，結(jié)果顯示在病毒侵染早期，即復(fù)制階段就抑制CGMMV的表達(dá)?！窘Y(jié)論】NbERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒復(fù)制，即病毒RNA復(fù)制階段；隨著CGMMV不斷侵染，在CGMMV細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)和系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)時(shí)期，CGMMV識(shí)別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)缺失后可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，從而抑制病毒侵染后期的積累。由此可見(jiàn)，NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

黃瓜綠斑駁花葉病毒；；致病機(jī)制

0 引言

【研究意義】在植物病毒與宿主長(zhǎng)期互作過(guò)程中，兩者均形成各自的攻防體系。越來(lái)越多的研究表明，病毒利用植物中的組分來(lái)幫助自身侵染，而植物內(nèi)也進(jìn)化出多種防御體系來(lái)抵抗病毒的入侵，兩者都在不斷進(jìn)化從而有利于自身的生存。黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我國(guó)重要的檢疫性病毒，主要危害黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物[1-2]。研究哪些寄主因子參與調(diào)控CGMMV的侵染，可為有效防控病毒病害提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】CGMMV侵染本氏煙（）后，葉片表面出現(xiàn)皺縮、斑駁和花葉等癥狀；黃瓜受害后，新生葉片表面出現(xiàn)黃色小斑點(diǎn)，后逐漸變成濃綠色突起，葉脈間褪色呈綠帶狀，果實(shí)黃化或變白并同時(shí)產(chǎn)生墨綠色水皰狀壞死斑[3]；侵染西瓜會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的褪色或淡黃色花葉、葉片凹凸不平、葉緣上卷、果實(shí)表面有濃綠原斑或不明顯的深綠色瘤皰、病果有彈性、肉質(zhì)纖維化、果梗有壞死條紋，嚴(yán)重時(shí)整株變黃直至死亡[4]。CGMMV自2005年首次傳入我國(guó)東北部，并在遼寧西瓜田流行傳播[5]。近年來(lái)在我國(guó)江蘇、廣東、北京、山東和湖南等?。ㄖ陛犑校┚褭z測(cè)到CGMMV[6-9]。CGMMV屬于煙草花葉病毒屬的正義單鏈RNA病毒[2]。其病毒粒體為桿狀，長(zhǎng)300 nm，直徑18 nm，在形態(tài)上與煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）無(wú)明顯區(qū)別。CGMMV的基因組全長(zhǎng)約為6.4 kb，可編碼4種蛋白，分別為129和186 kDa的復(fù)制相關(guān)蛋白、29 kDa的運(yùn)動(dòng)蛋白以及17 kDa的外殼蛋白[10]。CGMMV病毒粒子穩(wěn)定，常通過(guò)帶毒種子、花粉、受污染工具的機(jī)械損傷以及受污染的砧木嫁接等方式傳播給寄主植物，另外菟絲子等寄生植物也可造成CGMMV的傳播[11]。目前受限于研究的深度與廣度，防治藥劑開(kāi)發(fā)較難，生產(chǎn)上仍然缺乏有效控制CGMMV的方法。前期研究發(fā)現(xiàn)乙烯響應(yīng)因子NbERF RAP2-1（ethylene response factor related AP2-1）可以參與植物對(duì)CGMMV的調(diào)節(jié)作用[12]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的，分為AP2、RAV和ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族[13]。AP2家族蛋白包含兩個(gè)重復(fù)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；RAV家族蛋白包含一個(gè)B3結(jié)構(gòu)域；而ERF轉(zhuǎn)錄因子家族包含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性[14]。ERF轉(zhuǎn)錄因子在許多生物和生理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如植物形態(tài)發(fā)生、對(duì)各種脅迫的響應(yīng)機(jī)制、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)等[15]。值得注意的是，一些ERF轉(zhuǎn)錄因子可以參與多種病原物的侵染過(guò)程。有研究報(bào)道ERF轉(zhuǎn)錄因子有效抑制多種灰霉病侵染寄主，例如葡萄中VaERF16增強(qiáng)對(duì)灰霉病抗性[16]，擬南芥中ERF72增強(qiáng)植物對(duì)灰霉病菌的抗性[17]；番茄中ERF2增強(qiáng)植物對(duì)番茄白斑病的抗性[18]；水稻中OsBIERF3可以正調(diào)控水稻對(duì)真菌和細(xì)菌性病害的抗性[19]等。另外，有些ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員也可以幫助病原物侵染，例如水稻中OsERF922負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性[20]。ERF轉(zhuǎn)錄因子也可以參與調(diào)節(jié)病毒病害的侵染過(guò)程。在抗/感病性番茄品種中SiERF-B3轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與GCC盒結(jié)合能力的強(qiáng)弱來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curly virus，TYLCV）防御反應(yīng)[21]。在煙草中異源表達(dá)大豆GmERF可以增強(qiáng)植物對(duì)青枯雷爾氏菌（）、鏈格孢菌（）和TMV侵染的抵抗力[22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CGMMV侵染后會(huì)特異性下調(diào)本氏煙內(nèi)源基因，該基因?qū)儆贓RF轉(zhuǎn)錄因子家族。NbERF RAP2-1蛋白在植物與病毒互作中的作用還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)NbERF RAP2-1氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析、亞細(xì)胞定位、CGMMV侵染對(duì)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄水平的影響以及沉默和過(guò)表達(dá)對(duì)CGMMV侵染作用的研究，明確NbERF RAP2-1轉(zhuǎn)錄因子在CGMMV侵染中的功能，為黃瓜綠斑駁花葉病毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年5月至2023年4月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 材料

野生型本氏煙以及組蛋白H2B-RFP轉(zhuǎn)基因本氏煙在光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為25 ℃的條件下生長(zhǎng)。大腸桿菌DH5感受態(tài)購(gòu)于擎科生物；GV3101感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室所保存菌液制作。CGMMV農(nóng)桿菌GV3101菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced genetic silencing，VIGS）系列載體TRV-RNA1和TRV-RNA2，亞細(xì)胞定位載體pEG103均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 NbERF RAP2-1同源進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站查找不同植物中ERF的氨基酸序列與NbERF RAP2-1的氨基酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，對(duì)同源性高的氨基酸序列采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 亞細(xì)胞定位

以為模板，使用引物GFP-F/GFP-R（表1），利用RT-PCR方法擴(kuò)增，利用Gateway方法將連接到pEG103載體上，從而構(gòu)建-GFP熒光表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑選單菌落驗(yàn)證正確后搖菌。將含有-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.6）懸浮后OD600值定為0.5，靜置2 h后分別浸潤(rùn)到7—8葉齡的H2B-RFP轉(zhuǎn)基因本氏煙葉片（5—6葉位）下表皮，接種48 h后使用共聚焦顯微鏡（Nikon eclipse Ti2）觀(guān)察本氏煙葉表皮細(xì)胞中GFP熒光，其激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm；RFP熒光，其激發(fā)波長(zhǎng)為593 nm。

1.4 VIGS系統(tǒng)沉默

的系統(tǒng)沉默利用煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）介導(dǎo)的VIGS技術(shù)完成。以為模板，利用SGN VIGS Tool（http://vigs.solgenomics.net）在基因上預(yù)測(cè)一段300 bp的片段進(jìn)行TRV介導(dǎo)的VIGS，并設(shè)計(jì)引物VIGS-F/VIGS-R（表1），通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的片段。利用Gateway方法將構(gòu)建到TRV-RNA2載體上。將構(gòu)建成功的TRV-RNA2-表達(dá)載體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，利用菌液PCR驗(yàn)證，單克隆搖菌。將TRV-RNA2-與TRV-RNA1農(nóng)桿菌用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染緩沖液懸浮后OD600值分別定為1.0，靜置2 h后等量混勻，使用1 mL無(wú)菌注射器浸潤(rùn)本氏煙，以TRV-RNA2和TRV-RNA1等量混勻作為空白對(duì)照，以TRV-RNA2-PDS和TRV-RNA1等量混勻作為指示作用。每處理20個(gè)重復(fù)。定期觀(guān)察煙草生長(zhǎng)狀況。

1.5 病毒接種

將保存于-80 ℃含有CGMMV克隆載體的菌液活化后，在LB液體培養(yǎng)基（50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Kan）28 ℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，然后將菌液6 000 r/min離心2 min，棄上清并將沉淀溶解于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染液中，OD600定為1.0，靜置2 h，注射到長(zhǎng)勢(shì)較好的本氏煙植株中，7—10 d系統(tǒng)葉發(fā)病。采集剛發(fā)病的系統(tǒng)葉葉片研磨并摩擦接種到本氏煙植株上。

表1 載體構(gòu)建相關(guān)引物核苷酸序列

1.6 qRT-PCR分析

采用Trizol法提取本氏煙植株葉片的總RNA，總RNA通過(guò)HiScript&III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Real-Time System熒光定量PCR儀檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量（表2）。參照SYBR Green I說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)體系（95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，65 ℃10 s，95 ℃ 5 s；反應(yīng)總體系10 μL：2×SYBR Master mix 5 μL，正向和反向引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表2 qRT-PCR相關(guān)引物核苷酸序列

1.7 Western blot分析

采集葉片樣品，迅速置于液氮中快速制凍，將樣品研磨破碎，加入蛋白裂解液充分裂解30 min，13 000 r/min高速低溫離心10 min，取上清液加入5×Loading buffer后PCR儀99 ℃變性10 min，將處理組和空白對(duì)照蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；使用轉(zhuǎn)膜儀在25 v電壓25 min條件下將特異性蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)到NC膜上；使用5%的脫脂奶粉封閉緩沖液對(duì)NC膜進(jìn)行封閉，然后轉(zhuǎn)入5%的脫脂奶粉配制的一抗（1﹕5 000）4 ℃過(guò)夜孵育，二抗使用羊抗兔或羊抗鼠抗體（1﹕10 000）；使用底色化學(xué)發(fā)光劑eECL（諾唯贊生物試劑公司）進(jìn)行顯色并利用ImageJ對(duì)圖片進(jìn)行分析。供試一抗CGMMV CP抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備，GFP抗體購(gòu)自abmart公司。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

CGMMV侵染不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平的統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析，然后用最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)。VIGS和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)后基因表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析使用T測(cè)驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件制作柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 NbERF RAP2-1同源進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)NbERF RAP2-1（Nbv5tr6241794.1）蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化分析。由圖1可知，NbERF RAP2-1與多種煙草中的ERF RAP蛋白分離物聚到一小支，同源性極高；與擬南芥中的ERF RAP轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 NbERF RAP2-1亞細(xì)胞定位

利用共聚焦顯微鏡觀(guān)察NbERF RAP2-1-GFP亞細(xì)胞定位情況，NbERF RAP2-1-GFP與細(xì)胞核marker蛋白H2B-RFP共定位于細(xì)胞核中，而對(duì)照蛋白GFP定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，推測(cè)NbERF RAP2-1作為轉(zhuǎn)錄因子其主要在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄參與病毒侵染（圖2）。

2.3 CGMMV侵染對(duì)NbERF RAP2-1轉(zhuǎn)錄水平的影響

利用qRT-PCR方法，在CGMMV侵染的情況下檢測(cè)的表達(dá)情況。由于CGMMV侵染后6 d出現(xiàn)癥狀，在CGMMV侵染后6、9、12、15、18 d使用直徑1 cm的取樣器分別在CGMMV侵染系統(tǒng)葉與WT植株對(duì)應(yīng)葉位采集樣品，檢測(cè)CGMMV侵染前期、中期和后期，植物內(nèi)源的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，在CGMMV接種6、9、12 d時(shí)的表達(dá)量與WT植株相比無(wú)明顯變化，15、18 d時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)。結(jié)果表明，CGMMV侵染后期抑制的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖3）。

圖1 基于氨基酸序列的NbERF RAP2-1進(jìn)化樹(shù)分析

圖2 NbERF RAP2-1和GFP的亞細(xì)胞定位

2.4 NbERF RAP2-1沉默后抑制了CGMMV的侵染

上述結(jié)果表明CGMMV侵染后期顯著抑制了的轉(zhuǎn)錄水平，為進(jìn)一步明確NbERF RAP2-1是否在CGMMV侵染過(guò)程中起一定作用，利用TRV介導(dǎo)的VIGS系統(tǒng)將植物內(nèi)源沉默。將含有沉默片段的TRV-RNA2-載體的農(nóng)桿菌與TRV-RNA1共注射到本氏煙葉片中進(jìn)行基因沉默，標(biāo)記為T(mén)RV:；對(duì)照植物用空載的TRV-RNA2和TRV-RNA1進(jìn)行共注射，標(biāo)記為T(mén)RV: 00。qRT-PCR結(jié)果顯示在沉默后10 d TRV:植株沒(méi)有表型變化（圖4-A）。檢測(cè)的沉默效率發(fā)現(xiàn)TRV:中的轉(zhuǎn)錄水平是對(duì)照植株的65%（圖4-B），說(shuō)明植物內(nèi)源被有效沉默。

在沉默10 d的植株上摩擦接種CGMMV。接種8 d后對(duì)照植株TRV: 00系統(tǒng)葉片出現(xiàn)卷曲癥狀，而TRV:未觀(guān)察到卷曲癥狀（圖4-A）。使用直徑1 cm的取樣器，在TRV:發(fā)病的系統(tǒng)葉以及TRV: 00對(duì)應(yīng)的葉位采集樣品，分別提取RNA和蛋白，利用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)CGMMV RNA水平及蛋白水平的積累情況，結(jié)果顯示與對(duì)照相比，沉默植株上的CGMMV積累量無(wú)論是RNA水平（圖4-C）還是蛋白水平（圖4-D）均顯著降低。說(shuō)明沉默后有效抑制了CGMMV的侵染。

柱上標(biāo)有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）Different letters on the bars represent significantly different at 0.05 level

A：TRV: NbERF RAP2-1和TRV: 00在CGMMV侵染后的生物學(xué)表型Biological phenotypes of TRV: NbERF RAP2-1 and TRV: 00 after infection with CGMMV；B：VIGS NbERF RAP2-1的沉默效率Silencing efficiency of VIGS NbERF RAP2-1；C：TRV: NbERF RAP2-1對(duì)CGMMV CP轉(zhuǎn)錄水平的影響 Effect of TRV: NbERF RAP2-1 on the transcription level of CGMMV CP；D：TRV: NbERF RAP2-1對(duì)CGMMV CP蛋白水平的影響 Effect of TRV: NbERF RAP2-1 on the protein level of CGMMV CP

2.5 NbERF RAP2-1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)抑制CGMMV侵染

上述結(jié)果表明被有效沉默后，CGMMV在本氏煙中的侵染顯著被抑制，那么當(dāng)NbERF RAP2-1的表達(dá)顯著增強(qiáng)后是否影響CGMMV的侵染？首先在本氏煙7—8葉位摩擦接種CGMMV，1 h后在同一葉位的兩側(cè)過(guò)表達(dá)NbERF RAP2-1-GFP及對(duì)照GFP。在病毒接種24、48和72 h時(shí)使用熒光顯微鏡觀(guān)察NbERF RAP2-1-GFP及對(duì)照GFP，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光表達(dá)，同時(shí)在CGMMV侵染24、48和72 h的摩接葉上使用直徑1 cm的打孔器分別取GFP對(duì)照和NbERF RAP2-1-GFP浸潤(rùn)葉片，提蛋白利用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)24 h時(shí)NbERF RAP2-1-GFP與GFP已經(jīng)表達(dá)（圖5-A），通過(guò)熒光顯微鏡可以觀(guān)察到NbERF RAP2-1在24、48和72 h時(shí)均有熒光表達(dá)；Western blot檢測(cè)24、48和72 h時(shí)CGMMV CP蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)NbERF RAP2-1過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致CGMMV CP蛋白積累量顯著抑制（圖5-B）；通過(guò)ImageJ分析CGMMV CP蛋白相對(duì)表達(dá)水平，也證明了NbERF RAP2-1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)顯著抑制了CGMMV的侵染（圖5-C）；使用qRT-PCR檢測(cè)CGMMV的mRNA相對(duì)表達(dá)量（圖5-D），顯示NbERF RAP2-1過(guò)表達(dá)后抑制CGMMV的復(fù)制。說(shuō)明NbERF RAP2-1過(guò)表達(dá)后在病毒侵染早期，即復(fù)制階段就抑制了CGMMV的侵染。

A：NbERF RAP2-1-GFP 24 h時(shí)Western blot表達(dá)驗(yàn)證Verification of NbERF RAP2-1-GFP expression at 24 h by Western blot；B：NbERF RAP2-1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)CGMMV CP蛋白水平的影響 Effects of transient overexpression of NbERF RAP2-1 on the protein level of CGMMV CP；C：24、48、72 h摩接葉CGMMV CP蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分析Analysis of the relative expression of CGMMV CP protein in inoculated leaves at 24, 48 and 72 h；D：NbERF RAP2-1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)CGMMV CP轉(zhuǎn)錄水平的影響Effect of transient overexpression of NbERF RAP2-1 on the transcription level of CGMMV CP

3 討論

3.1 NbERF RAP2-1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控病毒侵染

黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）是我國(guó)重要的檢疫性病毒，近年來(lái)在北美[1]和澳大利亞[23]發(fā)現(xiàn)CGMMV能夠侵染西瓜，2005年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)均檢測(cè)到CGMMV的發(fā)生，給瓜類(lèi)和蔬菜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。前期通過(guò)CGMMV侵染本氏煙的RNA-Seq數(shù)據(jù)篩選到乙烯相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1。本研究檢測(cè)了CGMMV侵染不同時(shí)期內(nèi)源轉(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，在CGMMV侵染后期可以有效抑制的轉(zhuǎn)錄（圖3）。這與之前的報(bào)道有所不同，在之前的報(bào)道中環(huán)境中的生物和非生物脅迫都可以誘導(dǎo)植物中ERF的轉(zhuǎn)錄[24-26]，例如大麗輪枝菌（）分泌的效應(yīng)子PevD1和丁香假單胞菌（pv.DC3000）可誘導(dǎo)擬南芥中的ERF114轉(zhuǎn)錄上調(diào)[27]。但本研究中在CGMMV侵染后期會(huì)抑制的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)NbERF RAP2-1具有一定的抗病作用，CGMMV在其侵染后期識(shí)別后抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)NbERF RAP2-1僅含有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族。利用其氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比對(duì)，表明NbERF RAP2-1與多種煙草的ERF RAP具有高度相似性（圖1），同時(shí)通過(guò)亞細(xì)胞定位顯示NbERF RAP2-1定位于細(xì)胞核（圖2），推測(cè)NbERF RAP2-1作為ERF家族轉(zhuǎn)錄因子成員行使功能。

3.2 NbERF RAP2-1在CGMMV侵染中的作用

在沉默的本氏煙植株中，CGMMV侵染的第8天其病毒積累量顯著降低（圖4）。而NbERF RAP2-1過(guò)表達(dá)后也會(huì)顯著抑制CGMMV的積累，并且在病毒侵染初期，24 h時(shí)就可檢測(cè)到CGMMV積累量降低（圖5）。推測(cè)在CGMMV侵染初期，即病毒RNA復(fù)制階段，NbERF RAP2-1可以有效抑制病毒復(fù)制；但隨著CGMMV不斷侵染，在CGMMV細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)時(shí)期，CGMMV識(shí)別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)植物中缺失后，不能在CGMMV侵染前期有效抑制CGMMV的復(fù)制，但是缺失可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，從而抑制了病毒系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)，繼而抑制病毒的侵染。這與之前報(bào)道的本氏煙中的高遷移率核蛋白（high mobility group nucleoprotein，NbHMG1/2a）類(lèi)似，核蛋白NbHMG1/2a無(wú)論過(guò)表達(dá)或者沉默對(duì)竹子花葉病毒（bamboo mosaic virus，BaMV）系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)的影響一致[28]。

3.3 NbERF RAP2-1可能參與植物免疫過(guò)程調(diào)節(jié)CGMMV侵染

ERF蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，其APs結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性，與下游基因的GCC盒特異性結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)。例如，ERF68可以通過(guò)與防御相關(guān)基因的GCC盒直接結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)番茄和煙葉對(duì)病原體的抗病性[29]；擬南芥的ERF96通過(guò)與啟動(dòng)子中的GCC基序結(jié)合，增加了JA/ET防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強(qiáng)了對(duì)壞死性營(yíng)養(yǎng)病原體的抵抗力[30]；DEMAX可以與PDF2.1啟動(dòng)子中的GCC盒元件結(jié)合并增加了擬南芥和亞麻薺對(duì)灰葡萄孢（）的抗性[31]。另外，ERF也可以和其他蛋白互作參與植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)。DONG等[32]研究表明，ERF可以通過(guò)與其他蛋白相互作用在植物免疫活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。蘋(píng)果的MdERF10和MdHLH92相互作用從而提高對(duì)白粉病的抗性[33]；擬南芥的AtERF72被發(fā)現(xiàn)與ACBP相互作用來(lái)調(diào)節(jié)防御[34]，并可以通過(guò)與TGA4相互作用來(lái)直接增強(qiáng)抗病性[35]；AtERF72被證明與ORA59相互作用以增強(qiáng)對(duì)胡蘿卜乳桿菌的抗病性[36]。但是關(guān)于NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過(guò)程中如何調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄或者蛋白表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。推測(cè)NbERF RAP2-1參與植物免疫過(guò)程，主要調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄或下游互作蛋白的表達(dá)來(lái)參與植物抗病毒過(guò)程。

4 結(jié)論

NbERF RAP2-1作為ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中行使功能，其在CGMMV侵染后期表達(dá)量顯著下調(diào)；沉默和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)均抑制CGMMV的積累。推測(cè)NbERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒RNA的復(fù)制；隨著CGMMV不斷侵染，CGMMV識(shí)別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)缺失后可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，從而抑制了病毒侵染后期的積累。由此可見(jiàn)，NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

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Function of Transcription Factor NbERF RAP2-1 in Cucumber Green Mottle Mosaic Virus Infection

YU LianWei1, JIANG XingLin1, YANG LingLing1, WANG He1, ZHANG YuYang1, XIE LiNa1, XIA ZiHao5, LI HongLian1,3,4, YANG Xue1,2, SHI Yan1

1College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2Crop science postdoctoral programme of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;3Collaborative Innovation Centre of Henan Grain crops, Zhengzhou 450002;4State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002;5College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866

【Background】Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) is an important quarantine plant virus in China, which has caused serious economic losses to vegetable and melon industry. The ERF transcription factor is involved in biotic and abiotic stress and the defense response against a variety of plant pathogens. In previous study, it was demonstrated that the host transcription factor NbERF RAP2-1 was significantly down-regulated after CGMMV infection.【Objective】Theobjective of this study is to clarify the function of the ERF transcription factor family members in CGMMV infection, and to provide a theoretical basis for disease control caused by CGMMV.【Method】MEGA7.0 was used to construct a phylogenetic tree to analyze the amino acid sequence of NbERF RAP2-1. The expression vector-GFP was constructed to observe the subcellular localization of. The transcript level ofat different stages of CGMMV infection was analyzed by qRT-PCR. VIGS and transient overexpression ofwere conducted to analyze the function ofduring CGMMV infection.【Result】Phylogenetic tree analysis showed that NbERF RAP2-1 was highly homologous to ERF transcription factors in tobacco, and was far from ERF transcription factors in. The results of subcellular localization showed that NbERF RAP2-1 was localized in the nucleus and acted as a transcription factor. The effect of CGMMV infection on the transcript level of theshowed that the expression level ofdid not significantly change at the 6, 9, and 12 d after inoculation, but at the 15 and 18 d after inoculation, the expression level of1 was significantly down-regulated. tobacco rattle virus (TRV) mediated VIGS was used to silence the, and CGMMV was inoculated in TRV:and TRV: 00 plants. At 8 d after inoculation, the leaves of TRV: 00 plants showed mottling and curling, while the TRV:plants showed no symptoms. At the same time, the detection results of CGMMV RNA and protein levels showed that TRV:could effectively inhibit the accumulation of CGMMV. Similarly, transient overexpression of NbERF RAP2-1 inhibited the accumulation of CGMMV at 24, 48, and 72 h, respectively.【Conclusion】effectively inhibit the initial CGMMV replication, i.e. the viral RNA replication stage. With the invasion of CGMMV, i.e. the intercellular and systemic movements of CGMMV, CGMMV recognizes and inhibits the transcript level of. Whenis knocked down, that may inhibit the transcription of downstream proteins, thereby inhibiting the accumulation of CGMMV at a later stage.plays an important role during the CGMMV infection.

cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV);; pathogenic mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.007

2023-05-11；

2023-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（3210170372）、河南省青年人才托舉工程項(xiàng)目（2022HYTP037）、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（KJCX2021A13）、河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專(zhuān)項(xiàng)（222102110059）

于連偉，E-mail：ylwnet972@163.com。通信作者楊雪，E-mail：yangxuepphappy@126.com。通信作者施艷，E-mail：shiyan00925@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）