羅 珍，寧初光，李祚禛，么春艷 ，魏曉麗，李泓穎，蔡 亞，蔣單棟

（1.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州 510623；2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310013；3.健士星生物技術(shù)研發(fā)（上海）有限公司，上海 200335）

皮膚衰老是一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，包括內(nèi)源性衰老和外源性衰老。內(nèi)源性衰老是隨著時(shí)間流逝生理和基因變化的必然結(jié)果，這些變化不僅發(fā)生在皮膚上，還發(fā)生在其他人體組織中。外源性老化是由于暴露于外部刺激（如紫外線輻射、環(huán)境毒素和傳染性物質(zhì)）導(dǎo)致DNA 改變，以及皮膚皺紋、彈性降低、松弛和粗糙的外觀變化[1]。陽(yáng)光是對(duì)皮膚威脅最大的外部因素，因此，外源性老化也被稱為光老化[2]。紫外線是陽(yáng)光的重要組成部分，它通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的發(fā)色體和光敏劑相互作用，產(chǎn)生過(guò)量的自由基，進(jìn)而在皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞損傷（如脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA 碎片化）、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期紫外輻照會(huì)造成皮膚衰老，主要表現(xiàn)為皮膚紅斑、粗糙、褶皺、表皮增厚和色素沉著[3]。

番茄Lycopersicon esculintumMill.（LE）是人們生活中最常食用的蔬菜之一，含有豐富的類胡蘿卜素。有顏色的類胡蘿卜素，如番茄紅素和β-胡蘿卜素等已廣泛應(yīng)用于膳食補(bǔ)充劑中，通過(guò)攝入含有類胡蘿卜素的食物或補(bǔ)充劑能夠?qū)崿F(xiàn)類胡蘿卜素在皮膚中的沉積，顯著抑制MMPs 表達(dá)和MDA 形成，以保護(hù)皮膚免受光照傷害[4]。有報(bào)道指出口服或局部使用這些顏色強(qiáng)烈的類胡蘿卜素，會(huì)一定程度上造成皮膚黃色、橙色或紅色的現(xiàn)象[5]。而無(wú)色番茄紅素未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。無(wú)色的多氫番茄紅素在皮膚中的積累比番茄紅素更高效[6]。多氫番茄紅素中的八氫番茄紅素（phytoene）和六氫番茄紅素（phytofluene）（見(jiàn)圖1），由于烯烴鏈更短，所以能夠最大限度地吸收紫外線[7]。這些研究提示無(wú)色番茄紅素也具有光保護(hù)潛力。臨床研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，口服番茄提取物Phytofl ORAL（相當(dāng)于5 mg/d 多氫番茄紅素），能夠提升皮膚抵御紫外輻照的能力，改善皮膚亮度，減少皮膚干燥和粗糙程度，均勻膚色和改善皮膚紋理。當(dāng)皮膚受到紫外輻照發(fā)生損傷時(shí)，這類含有多氫番茄紅素的番茄提取物通過(guò)何種生理機(jī)制發(fā)揮抗光老化作用還有待進(jìn)一步的研究。

圖1 八氫番茄紅素和六氫番茄紅素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of octa-hydrolycopene and hexa-hydrolycopene

本文中關(guān)注的另一植物是野櫻莓Aronia melanocarpa（AM），別名黑果腺肋花楸，富含花青素和原花青素。體外研究發(fā)現(xiàn)野櫻莓提取物對(duì)N,N-二苯基三硝基苯肼自由基（DPPH·）具有較好的清除能力，可見(jiàn)其具有抗氧化活性[10]。局部使用野櫻莓提取物能夠抑制對(duì)苯二甲酸造成的耳腫脹，減少促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)野櫻莓提取物可能通過(guò)抑制ROS-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，抑制促炎介質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎活性[11]。以累積劑量150 mJ/cm2UVB 輻照的ICR 小鼠，連續(xù)1 周背部涂抹1%野櫻莓提取物，與模型對(duì)照組相比，皮膚厚度減少，MMP-1 和MMP-3 免疫化學(xué)反應(yīng)減少，I 型和III 型膠原熒光反應(yīng)增加，由此可見(jiàn)外用野櫻莓提取物能夠通過(guò)減弱UVB 誘導(dǎo)的膠原蛋白破壞來(lái)減輕紫外光造成的光損傷[12]。但目前僅有外用延衰的研究，缺少口服野櫻莓美容功效報(bào)道。Zhao 等[13]發(fā)現(xiàn)口服野櫻莓提取物通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/NF-κB通路抑制炎癥，顯著延緩小鼠腦衰老。此研究中口服延衰功效并未聚焦于皮膚，同時(shí)欠缺抗光老化的相關(guān)機(jī)制研究。為了減少對(duì)皮膚顏色的影響，本研究將使用含有多氫番茄紅素的番茄提取物和富含花青素的野櫻莓提取物，在UVB 輻照HaCaT 角質(zhì)形成細(xì)胞光損傷模型上，分別考察二者對(duì)紫外造成的細(xì)胞凋亡以及ROS、PGE2的影響。之后會(huì)進(jìn)一步在UVB 輻照ICR 小鼠光老化模型上進(jìn)行研究，探究口服番茄提取物和野櫻莓提取物的混合物（以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)A）能否通過(guò)抗炎抗氧化途徑，減少皮膚的紫外損傷。以此填補(bǔ)番茄提取物和野櫻莓提取物合用抗光老化功效機(jī)制研究的空白。為利用番茄提取物和野櫻莓提取物研發(fā)功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄提取物（含有11.00%類胡蘿卜素，其中包括9.00%多氫番茄紅素、30.07%飽和脂肪酸、50.02%不飽和脂肪酸） 以色列Lycored 有限公司；野櫻莓提取物（又名黑果腺肋花楸果果汁粉，花青素含量為1.8%，原花青素含量為8.55%，總糖11.6%，纖維3.20%，糊精為40%） 廣州康萊食品添加劑有限公司；DLα生育酚乙酸酯、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、H2DCFDA、吖啶橙 Sigma 公司；CCK-8、β-半乳糖苷酶染色試劑盒 Servicebio 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基Hyclone 公司；青-鏈霉素 武漢Boster 生物技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶 Gibco 公司；胎牛血清 上海普飛生物技術(shù)有限公司；PGE2ELISA 試劑盒、SOD 檢測(cè)試劑盒、MDA 檢測(cè)試劑盒、COX-2 ELISA檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；脫毛膏廣州依露化妝品有限公司；無(wú)水乙醇 杭州宏達(dá)化工儀器有限公司；二甲苯、鹽酸分化液、中性樹(shù)膠 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素染液 杭州浩克生物科技有限公司；氨水 MACKLIN 上海麥克林生化科技有限公司；TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒、IL-1βELISA 檢測(cè)試劑盒、IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒 博士德生物工程有限公司；人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT上海復(fù)祥生物科技有限公司；SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠32 只，4 周齡，體重18±2 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002）。

SH-4B 紫外燈 上海希格瑪高技術(shù)有限公司；D3024R 臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī) DragonLab；FBZ2001-up-p 標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀 青島富勒姆科技有限公司；SpectraMax M4 多功能酶標(biāo)儀 Molecular Devices 公司；EG1150C 包埋機(jī)、RM2235 切片機(jī)、TP1020 脫水機(jī) LEICA 公司；51A011 KD-P 組織攤片機(jī) 浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；HGPF-50 烤箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DP260s 達(dá)科為染色機(jī) 深圳市達(dá)科為醫(yī)療科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中維生素E、番茄提取物用DMSO 預(yù)溶，野櫻莓提取物粉末用生理鹽水新鮮配制，而后三者以新鮮RPMI1640 培養(yǎng)基（10%胎牛血清，100 U/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素）調(diào)至終濃度。維生素E 終濃度為40 μg/mL，番茄提取物和野櫻莓提取物終濃度為30 和100 μg/mL。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中維生素E 終濃度為80 mg/kg。根據(jù)文獻(xiàn)所述多氫番茄紅素抗光老化人體起效劑量為5 mg/d[8]，原花青素美容功效人體起效劑量為24 mg/kg[14]，因此本研究中使用50 mg/d 番茄提取物和300 mg/d 番茄提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終番茄提取物和野櫻莓提取物以1:6 的質(zhì)量比混合為混合物L(fēng)A（相當(dāng)于人體劑量為350 mg/d）。用0.1 mL/10 g體重的0.5% CMC-Na 溶液配制樣品，LA 的最終給藥劑量為53.08 mg/kg。

1.2.2 番茄提取物和野櫻莓提取物抗UVB 輻照HaCaT 細(xì)胞光老化試驗(yàn)

1.2.2.1 CCK8 法檢測(cè)番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率的影響 將人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT 培養(yǎng)于RPMI1640 培養(yǎng)基中（10%胎牛血清，100 U/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素），移去培養(yǎng)基后，在室溫下，經(jīng)0.25%胰酶消化2 min，用含有10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化，1200 r/min 離心10 min，用RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，并接種鋪盤(pán)。利用2～4 代的HaCaT 細(xì)胞進(jìn)行衰老實(shí)驗(yàn)。

將HaCaT 細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔接種在96 孔板中，在完全培養(yǎng)基中孵育24 h 后，用生理鹽水或10、30、100、300、1000 μg/L 提取物進(jìn)行處理。生理鹽水組為對(duì)照組。48 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，反應(yīng)1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光值（OD）。細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對(duì)照）/（OD對(duì)照組-OD空白對(duì)照）×100[15]。

1.2.2.2 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng) 待HaCaT 細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，后以1×105個(gè)/mL 接種于6 孔培養(yǎng)板，貼壁后給予40 μg/mL 維生素E，30、100 μg/mL 番茄提取物和30、100 μg/mL野櫻莓提取物分別處理24 h，待其70%融合時(shí)，移去培養(yǎng)基，進(jìn)行UVB 輻照?？瞻捉M和模型組細(xì)胞使用等量生理鹽水處理24 h。模型組和各受試物處理組進(jìn)行UVB 輻照，紫外線與細(xì)胞之間的距離為15 cm，UVB 能譜為312 nm，UVB 強(qiáng)度為20 mJ/cm2。照射后，繼續(xù)用受試物孵育，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2.3 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)UVB 導(dǎo)致HaCaT 凋亡細(xì)胞數(shù)的影響 用Hoechst 和吖啶橙（AO）染色法檢測(cè)HaCaT 的細(xì)胞凋亡指數(shù)[16]。在440 nm 的熒光顯微鏡下，Hoechst 染色和AO 染色可見(jiàn)活細(xì)胞和死細(xì)胞的核。將細(xì)胞置于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，UVB 輻照后，繼續(xù)用受試物孵育6 h，PBS洗滌后，用不同的染料（10 μg/mL）染色30 min，在40 倍的330/380 nm 激發(fā)濾光片和440 nm 阻擋濾光片熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。選擇物鏡整體觀察區(qū)域，計(jì)數(shù)細(xì)胞核碎裂或凝結(jié)的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.2.4 H2DCF-DA 測(cè)定ROS UVB 輻照后，繼續(xù)用受試物孵育24 h 后，用探針2’,7’-二氯熒光素-二乙酸測(cè)定ROS 的形成[17-18]。熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS，37 ℃下，用10 mmol/L H2DCF-DA 孵育細(xì)胞15 分鐘。然后用0.01 mol/L PBS（pH7.3～7.4，包含0.9% NaCl）沖洗細(xì)胞兩次，將細(xì)胞板放入酶標(biāo)儀中。激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm。測(cè)定吸光值（OD）。熒光值DCF（a.u.）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照[19]。

1.2.2.5 ELISA 檢測(cè)PGE2UVB 輻照后，受試物孵育24 h 后，使用ELISA 試劑盒測(cè)量培養(yǎng)上清中的PGE2濃度。

1.2.3 LA 對(duì)UVB 輻照小鼠皮膚光老化的影響1.2.3.1 動(dòng)物準(zhǔn)備 選用4 周齡雄性ICR 小鼠，體重18±2 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)（溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光照-黑暗循環(huán)為12 h:12 h，自由攝食飲水）1 周后，開(kāi)始試驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：20201021-006。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0011。

1.2.3.2 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，稱量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重并將32 只ICR 小鼠隨機(jī)分為4 組，每組8只。設(shè)置空白組、模型組、維生素E 組（80 mg/kg）和LA 組（53.08 mg/kg），空白組和模型組均給予0.5% CMC-Na 溶液，各組動(dòng)物每天灌胃1 次，每只灌胃體積為0.1 mL/10 g 體重，連續(xù)灌胃4 周。

1.2.3.3 光老化小鼠模型的建立 除空白組外，其他各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用脫毛膏去除背部毛發(fā)，每天置于50 mL 離心管中并固定尾部，離心管壁具有2×2 cm的空洞以便于紫外線直接照射動(dòng)物皮膚，燈管距離背部1 cm。紫外線UVB 照射劑量為：每周一、三、五照射，第一周每次54 mJ/cm2，第二周每次108 mJ/cm2，第三周和第四周每次均為200 mJ/cm2，總計(jì)量為1686 mJ/cm2[20]。

1.2.3.4 皮膚樣本處理 分別于照射前和用藥后1、2、3、4 周時(shí)使用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部皮膚厚度。實(shí)驗(yàn)4 周后，取小鼠背部正中面積為1 cm×1 cm大小，重量約0.5 g 的完整皮膚組織，迅速放入10%中性甲醛固定，作組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)算機(jī)分析。

1.2.3.5 皮膚組織HE 染色 將標(biāo)本固定于10%甲醛溶液，按常規(guī)石蠟包埋、切片（約5 μm）；切片脫蠟至水；入蘇木素液中染色5 min，流水沖洗1 次；1%鹽酸酒精分化液分色15 s，流水沖洗2 次；70%和90%酒精中各脫水10 min，1%伊紅染色30 s，自來(lái)水沖洗，涼干；二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿及間質(zhì)呈紅色。在光學(xué)顯微鏡下觀察表皮和真皮情況，統(tǒng)計(jì)表皮和真皮厚度。

1.2.3.6 皮膚組織中的SOD 活性和MDA 含量的測(cè)定 取背部脫毛后皮膚組織約0.5 g，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重。量筒量取該組織塊9 倍重量預(yù)冷生理鹽水，用眼科小剪剪碎皮膚組織塊后倒入勻漿管中，與生理鹽水混合后，用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制成10%組織勻漿液，10000 r/min 低溫離心10 min，取上清備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SOD 活性和MDA 含量測(cè)定。

1.2.3.7 皮膚組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2的測(cè)定 取組織勻漿上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測(cè)定皮膚組織勻漿液中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2 水平，具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 繪圖軟件作圖，SigmaStat 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用成組t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表明結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)HaCaT 細(xì)胞抗光老化作用的影響

2.1.1 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)HaCaT 細(xì)胞存活率的影響 采用CCK8 法檢測(cè)番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)HaCaT 細(xì)胞是否具有毒性。圖2 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，番茄提取物在10、30、100、300 μg/mL 顯著（P＜0.05）促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞增殖。由于300 μg/mL 番茄提取物使HaCaT 存活率顯著提升了57.5%，可知此濃度下對(duì)細(xì)胞增殖影響較大。同時(shí)為了便于后續(xù)機(jī)制研究能夠有較為明顯的變化呈現(xiàn)，因此選擇對(duì)細(xì)胞存活率影響較小的30 和100 μg/mL 進(jìn)行后續(xù)研究。野櫻莓提取物在10～1000 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對(duì)HaCaT 細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著影響。為了便于對(duì)番茄提取物和野櫻梅提取物進(jìn)行比較研究，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用30、100 μg/mL濃度的番茄提取物和野櫻莓提取物來(lái)進(jìn)行各項(xiàng)細(xì)胞學(xué)研究。

圖2 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)HaCaT 細(xì)胞的增殖影響Fig.2 Effect of tomato extract and Aronia melanocarpa extract on HaCaT cell proliferative activity

2.1.2 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)UVB 致HaCaT凋亡的影響 由表1 所示，UVB 輻照后含有凝聚的凋亡小體的角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。研究顯示UVB 輻射具有極強(qiáng)地基因毒性，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為胞膜有小泡狀形成和細(xì)胞核碎裂[21]。本文中所述細(xì)胞模型呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的顯著增加，展現(xiàn)出UVB 對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞造成的光損傷特點(diǎn)。這也與Umar Muzaffer 等[16]研究中，紫外輻照使HaCaT細(xì)胞凋亡體數(shù)量提高84.29%的報(bào)道一致。

表1 受試物對(duì)UVB 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Effect of test samples on cell apoptosis of HaCaT cell induced by UVB

經(jīng)過(guò)番茄提取物、野櫻莓提取物和維生素E 處理能夠顯著降低UVB 導(dǎo)致的凋亡，提示上述受試物具有抗UVB 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞凋亡的作用，其中40 μg/mL 維生素E 顯著減少凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)（P＜0.05）。還能看到100 μg/mL 番茄提取物和30 μg/mL 野櫻莓提取物顯著減少凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)（P＜0.05），但相較于維生素E 未見(jiàn)顯著差異。Fazekas 等[22]發(fā)現(xiàn)外用番茄紅素能夠有效減少紫外造成的細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制半胱天冬酶（caspase）-3 的裂解，恢復(fù)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），阻斷UVB 損傷后的凋亡通路來(lái)防止DNA 損傷。Calò等[23]研究發(fā)現(xiàn)富含花青素的歐洲越橘提取物能夠顯著減少紫外輻照后HaCaT 凋亡細(xì)胞比例。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

2.1.3 番茄提取物和野櫻莓提取物對(duì)細(xì)胞中ROS和PGE2的影響 由表2 所示，與空白組相比，UVB會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中ROS 生成顯著增加（P＜0.05），100 μg/mL 番茄提取物組ROS 的熒光值極顯著降低（P＜0.01）。與維生素E 相比，100 μg/mL 野櫻莓提取物有顯著增加（P＜0.05），其余提取物受試組均未有顯著差異。與模型組相比，經(jīng)過(guò)100 μg/mL 番茄提取物和維生素E 處理后熒光值能夠顯著降低（P＜0.05），提示上述受試物均具有清除自由基的作用。結(jié)果顯示，番茄提取物能夠緩解UVB 造成的ROS 過(guò)度生成，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。這與Sara 等[24]研究結(jié)果一致，富含類胡蘿卜素的柿子提取物能夠顯著抑制紫外誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生。此外，ROS 的降低可能是通過(guò)激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2），刺激血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化能力，使ROS 生成維持正常水平，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[25]。

由表2 所示，UVB 會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中PGE2生成顯著增加（P＜0.05），與空白組相比，100 μg/mL番茄提取物也能夠使PGE2生成極顯著減低（P＜0.01）。與維生素E 相比，番茄提取物和野櫻莓提取物均未有顯著差異。值得注意的是，與模型組相比，100 μg/mL 番茄提取物能夠使PGE2生成顯著減低到（113.80±9.71）ng/g（P＜0.05）。這與Yoshihisa 等[26]的研究結(jié)果一致，類胡蘿卜素顯著降低HaCaT 角質(zhì)形成細(xì)胞中COX-2 的mRNA 水平，減少PGE2的釋放。Joseph Schwager 等[27]的研究顯示，番茄提取物還能夠通過(guò)降低巨噬細(xì)胞中NO、PGE2、TNF-α、IL-1β和IL-6 的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。相較于模型組，經(jīng)過(guò)100 μg/mL 野櫻莓提取物處理后顯著降為（152.74±12.85）ng/g（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)[28-29]花青素可能通過(guò)下調(diào)UVB 誘導(dǎo)的COX-2，降低PGE2。在光老化細(xì)胞模型中，研究發(fā)現(xiàn)番茄提取物和野櫻莓提取物具有清除ROS 和PGE2的作用。在Azahara等[30]研究中發(fā)現(xiàn)外用類胡蘿卜素通過(guò)Nrf-2 途徑下調(diào)COX-2 和iNOS，上調(diào)HO-1 蛋白，從而減輕UVB誘導(dǎo)的紅斑。預(yù)測(cè)番茄提取物和野櫻莓提取物可能通過(guò)提升皮膚細(xì)胞抗氧化能力緩解紫外造成的氧化應(yīng)激，同時(shí)可能通過(guò)下調(diào)COX-2，減少PGE2、TNFα、IL-1β和IL-6 等促炎因子，來(lái)緩解紫外造成的皮膚損傷。接下來(lái)將在動(dòng)物光老化模型中進(jìn)一步研究番茄提取物和野櫻莓提取物組合物的抗光老化機(jī)制。

2.2 LA 對(duì)UVB 輻照小鼠皮膚光老化的影響

2.2.1 皮膚厚度的變化 如表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，模型組皮膚厚度為（3.45±0.45）mm，與空白組相比，模型組小鼠皮膚厚度顯著增加（P＜0.01），維生素E 組和LA 組也顯著增加（P＜0.01）。這是由于UVB 照射造成皮膚的急性損傷，由于炎癥反應(yīng)和水腫，常表現(xiàn)為皮膚厚度增加[31]。此外還觀察到，LA 組小鼠皮膚厚度為（2.49±0.41）mm，與模型組相比，LA 能夠顯著降低皮膚厚度（P＜0.01）。Fazekas 等[23]發(fā)現(xiàn)番茄紅素劑量依賴性地抑制UVB 導(dǎo)致的皮膚厚度增加，與本研究結(jié)果一致。與維生素E 組相比，LA 組皮膚厚度有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 受試物對(duì)ICR 小鼠皮膚厚度的影響Table 3 Effect of test samples on skin thickness of ICR mice

表4 受試物對(duì)ICR 小鼠真皮表皮厚度的影響Table 4 Effect of test samples on dermis and epidermis thickness of ICR mice

2.2.2 LA 對(duì)光老化小鼠皮膚組織病理學(xué)形態(tài)影響空白組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，表皮層較薄，真皮層中可以看到波浪狀膠原纖維束，排列有序分布均勻，間質(zhì)中均勻分布著成纖維細(xì)胞。模型組小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)紊亂，與對(duì)照組相比表皮層不規(guī)則地增厚，真皮層組織排列紊亂，膠原纖維斷裂成團(tuán)嚴(yán)重，有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這與文獻(xiàn)[32-33]研究的紫外線引起的光老化小鼠皮膚變化特征是一致的。與模型組相比，維生素E 組小鼠皮膚表皮厚度稍有減少，真皮層仍有成團(tuán)現(xiàn)象，但排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少。LA 組小鼠的皮膚組織受損程度得到緩解，表皮結(jié)構(gòu)完整厚度較薄，真皮層纖維排列趨向整齊，層次較清晰，極少有成團(tuán)現(xiàn)象，比維生素E 組更接近正常小鼠皮膚。

通過(guò)組織切片HE 染色圖片分析可知，與空白組比較，經(jīng)過(guò)紫外輻照后的小鼠真皮和表皮厚度顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，LA 組和維生素E 組真皮厚度顯著降低（P＜0.01）（圖3）。LA 和維生素E 都有降低表皮厚度的趨勢(shì)，但與模型組相比沒(méi)有顯著性差異。與維生素E 組相比，LA 組真皮厚度和表皮厚度均有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜合來(lái)看，LA能夠顯著降低紫外造成的真皮變厚，具有改善表皮變厚的趨勢(shì)。

圖3 UVB 誘導(dǎo)ICR 小鼠皮膚光老化的H&E 染色（×100）Fig.3 H&E staining in UVB induced skin photoaging model ICR mice

2.2.3 LA 對(duì)光老化小鼠皮膚中SOD 活性和MDA水平的影響 如表5 所示，紫外照射導(dǎo)致皮膚中SOD 活性降低，但與空白組相比沒(méi)有顯著性差異。與空白組相比，LA 組能夠極顯著增加SOD 活性（P＜0.01）。與模型組相比，服用了LA 能夠使SOD活性極顯著增加（P＜0.01）。紫外照射導(dǎo)致皮膚中MDA 顯著增加到（22.72±1.64）U/mg（P＜0.01），LA和維生素E 能夠分別使MDA 顯著降低到（13.02±2.24）nmol/mg 和（17.31±2.58）nmol/mg（P＜0.01）。與維生素E 組相比，LA 組SOD 活性極顯著增加（P＜0.01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05）。暴露于紫外光下能通過(guò)各種機(jī)制間接導(dǎo)致ROS 的產(chǎn)生。當(dāng)ROS 產(chǎn)生過(guò)多，超過(guò)了自身的抗氧化防御能力，就會(huì)發(fā)展為氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激能夠?qū)е录?xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，MDA 水平能夠客觀反映自由基的水平[34]。本研究結(jié)果表明口服番茄提取物和野櫻莓提取物的混合物能夠提高光老化小鼠皮膚中SOD 活性，降低MDA 水平。楊斌等[4]研究顯示番茄紅素灌胃對(duì)UVA 照射引起的MDA 含量升高有顯著抑制作用，本研究結(jié)果與其一致。Hatta 等[35]已經(jīng)證明，當(dāng)八氫番茄紅素和六氫番茄紅素被添加到飲食中時(shí)，這些活性成分會(huì)優(yōu)先在皮膚中積累。口服吸收的植物活性成分，通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)狡つw，提升SOD 活力，清除多余自由基，減少紫外造成的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡。

表5 受試物對(duì)受試物對(duì)UVB 誘導(dǎo)ICR 小鼠光老化皮膚中SOD 活性和MDA 水平的影響Table 5 Effect of test samples on SOD activity and MDA level in skin of UVB induced skin photoaging model ICR mice

2.2.4 LA 對(duì)光老化小鼠皮膚中IL-1β、IL-6、COX-2、TNF-α的影響 在UVB 誘導(dǎo)下，與空白組相比，模型組皮膚中炎癥因子IL-6 和TNF-α極顯著增加（P＜0.01），而IL-1β、COX-2 具有上升趨勢(shì)。值得注意的是，與空白組相比，LA 使皮膚中IL-1β 顯著降低（P＜0.05）。給與受試物后，與模型組相比，維生素E 能夠顯著降低COX-2 和TNF-α水平（P＜0.05）。LA 使皮膚中IL-6 顯著下降為（63.34±44.14）pg/mL（P＜0.05），COX-2 顯著下降為（2.53±1.22）ng/mL（P＜0.05）、TNF-α 極顯著降低到（4.95±3.39）pg/mL（P＜0.01）。與維生素E 組相比，LA 組IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2 均有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。光老化皮膚中抗氧化防御機(jī)制水平降低，ROS 會(huì)刺激皮膚中的炎癥反應(yīng)，使皮膚的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，炎癥反應(yīng)增加[36]。急性UVB 照射導(dǎo)致真皮肥大細(xì)胞脫顆粒增加[37]。通過(guò)釋放組胺和PGE2等促炎介質(zhì)，導(dǎo)致血管擴(kuò)張、外溢和細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生輻射紅斑[38]。本研究彌補(bǔ)了Tsoyi 等[28]研究中只有外用抗光老化機(jī)制研究的不足，證明了口服LA 能夠通過(guò)降低皮膚中促炎因子TNF-α、IL-6、COX-2 來(lái)緩解紫外造成的炎癥反應(yīng)，說(shuō)明了細(xì)胞模型研究中PGE2的減少，可能是由于下調(diào)COX-2 產(chǎn)生的結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)UVB 誘導(dǎo)皮膚炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，如UVB 激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38 通路[39]。隨后，由c-Jun和c-Fos 組成的AP-1 復(fù)合物被磷酸化的JNK 反式激活，誘導(dǎo)COX-2、TNF-α和IL-8 等基因的表達(dá)[40]。這些研究表明天然植物成分或可通過(guò)抑制p38 和ERK1/2 MAPK 或NF-κB 信號(hào)通路[41]，減少COX-2 表達(dá)和PGE2的生成。口服LA 是否通過(guò)抑制MAPK/NF-κB 信號(hào)通路來(lái)緩解紫外造成的皮膚光老化現(xiàn)象，這還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

表6 受試物對(duì)UVB 誘導(dǎo)ICR 小鼠光老化皮膚中炎癥因子的影響Table 6 Effect of cytokine in skin of UVB induced skin photoaging model ICR mice

3 結(jié)論

本文發(fā)現(xiàn)番茄提取物和野櫻莓提取物均能夠清除ROS，抑制PGE2過(guò)度生成，減少UVB 輻照造成的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，但其抑制光老化造成細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路的機(jī)理還需要深入研究?？诜呓M合物L(fēng)A 通過(guò)提高皮膚中SOD 活力，降低MDA 水平，顯著下調(diào)IL-6、COX-2、TNF-α表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)，改善UVB 造成的皮膚異常增厚。但LA 中番茄提取物和野櫻莓提取物是否存在著協(xié)同增效作用還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。綜合來(lái)看，番茄提取物和野櫻莓提取物具有保護(hù)皮膚減少紫外光老化損傷的作用，這為進(jìn)一步探索番茄提取物和野櫻莓提取物抗光老化的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為它們?cè)诿廊荼＝∑奉I(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。