鄭伊琦，張安強(qiáng)，張小軍，梅光明，何鵬飛,

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310014；4.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

豬苓（Polyporus umbellatus）為真菌界，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌目（Polyporales），多孔菌科、多孔菌屬[1]，別名豕苓、豬茯苓等，在我國分布范圍較廣，主要產(chǎn)自河北、山西、陜西。豬苓菌核具有利水滲濕功效[2]，作為藥物使用在我國已有悠久歷史[2]。豬苓中含有包括甾體類及多糖類等化合物在內(nèi)的多種營養(yǎng)成分，其多糖含量依產(chǎn)地不同而在4.12～31.18 mg/g 范圍內(nèi)[3]。豬苓多糖與其許多生理功能具有緊密聯(lián)系，具有良好的免疫增強(qiáng)[4-5]、抗腫瘤[6]、肝臟保護(hù)[7]、抗輻射[8]等生理功能。Gao 等[9]還發(fā)現(xiàn)豬苓多糖-硒納米粒子具有抗增殖能力且低細(xì)胞毒性，可作為一種膳食補(bǔ)充劑運(yùn)用于癌癥化學(xué)預(yù)防中。

由于真菌分布范圍極其廣泛，已被作為活性多糖的重要來源進(jìn)行開發(fā)。真菌多糖的提取方法有很多，目前除了傳統(tǒng)的熱水浸提法外，還有酶法提取、超聲輔助熱水提取法、微波輔助熱水提取法等方法[10]。傳統(tǒng)提取法具有耗時(shí)長、得率低、能耗大等缺點(diǎn)，超聲輔助熱水提取法是利用高頻的超聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和擾動(dòng)效應(yīng)等特點(diǎn)，簡化提取過程，大幅縮短提取時(shí)間，提高提取效率，不對(duì)提取物、活性產(chǎn)生影響，且操作方法簡單成本較低，具有高重現(xiàn)性被廣泛應(yīng)用于各類有效成分的提取[11]。提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲功率是超聲輔助提取過程中的重要參數(shù)，也是多糖提取工藝優(yōu)化中極受關(guān)注的變量參數(shù)[12-13]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種可用于優(yōu)化工藝條件的有效方法，該方法可以確定工藝運(yùn)行過程中不同影響因素及各因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。通過對(duì)數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法的結(jié)合，擬合得到一個(gè)完整的二次多項(xiàng)式模型，用以呈現(xiàn)更優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表達(dá)[14]。對(duì)多糖進(jìn)行提取時(shí)，除了提高產(chǎn)量外，還應(yīng)考慮其生物活性。Anraku 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑可有效延緩脂質(zhì)氧化、抑制癌細(xì)胞增殖以及自由基產(chǎn)生，抗氧化活性是生物活性的基礎(chǔ)。熱水浸提法仍是目前豬苓菌核多糖的主要提取方法，該方法具有耗時(shí)長、提取效率低等不足。將超聲輔助提取法應(yīng)用于豬苓菌核多糖的提取，并應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法確定不同參數(shù)對(duì)多糖得率的影響作用，建立最優(yōu)提取工藝，提高豬苓菌核多糖得率及提取效率，對(duì)于豬苓菌核多糖開發(fā)利用具有極其重要的意義。

故本文采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法探究了豬苓菌核多糖超聲輔助熱水提取過程中提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲功率對(duì)多糖得率的影響作用并確定最優(yōu)提取工藝條件，同時(shí)通過DPPH 自由基清除試驗(yàn)和總還原力試驗(yàn)評(píng)估最優(yōu)工藝條件下獲得的豬苓菌核多糖的體外抗氧化活性，為豬苓菌核活性多糖的高效制備及進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥的豬苓菌核 產(chǎn)自陜西省佛坪縣；DPPH、抗壞血酸 美國Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、3,5-二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DJ-04 中藥粉碎機(jī)、SHB-Ⅱ-A 循環(huán)水真空泵上海淀久儀器有限公司；RE2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；V-1800PC 紫外-可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬苓菌核預(yù)處理 干燥豬苓菌核使用粉碎機(jī)粉碎后，加入8 倍質(zhì)量的工業(yè)酒精浸泡過夜，重復(fù)3 次，以去除其中小分子糖、色素和脂溶性成分等物質(zhì)[16]。酒精浸泡后的豬苓菌核粉末經(jīng)過濾、干燥后，置于陰涼通風(fēng)處備用。

1.2.2 豬苓菌核多糖的超聲輔助提取 準(zhǔn)確稱取10 g經(jīng)預(yù)處理后的豬苓菌核粉末，按照液料比20 mL/g加入蒸餾水，置于超聲功率300 W、提取溫度70 ℃的條件下超聲提取90 min。提取液經(jīng)7000 r/min 離心10 min 和過濾后減壓濃縮，用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在改變其中一個(gè)影響因素而其余因素不變的情況下，分別考察提取溫度水平（50、60、70、80、90 和100 ℃）、超聲功率水平（120、180、240、300 和360 W）、液料比水平（10、15、20、25 和30 mL/g）和提取時(shí)間水平（25、40、55、70 和90 min）四個(gè)影響因素對(duì)豬苓菌核多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（BBD）對(duì)豬苓菌核多糖提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，考察因素及水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表2。在響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，比較預(yù)測多糖得率與實(shí)際多糖得率。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Independent variables and their levels for the response surface design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result Box-Behnken

1.2.5 豬苓菌核粗多糖分離工藝 按照最優(yōu)工藝提取豬苓菌核多糖，提取液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮10 倍后，加入工業(yè)酒精使酒精濃度依次達(dá)到30%vol、60%vol、80%vol，靜置過夜后離心（7000 r/min，10 min），沉淀分別命名為粗多糖PUPF-30、PUPF60、PUPF80。

1.2.6 總糖含量測定 使用苯酚-硫酸法測定總糖含量[17]，具體步驟為取1.00 mL 多糖溶液于試管中，補(bǔ)加水至2.00 mL，加入5 mL 6%苯酚溶液，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫后，測定490 nm 處吸光度值?？偺呛恳詿o水葡萄糖計(jì)，濃度范圍20～120 μg/mL的回歸方程為y=0.0068x-0.0025，決定系數(shù)R2=0.998。

1.2.7 還原糖含量測定 還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[17]，簡要步驟如下：取1.00 mL多糖溶液于試管中，加入3.00 mL 水楊酸試劑，置于沸水浴中反應(yīng)5 min 后，冷卻至室溫并用水定容至25.0 mL，測定520 nm 處吸光值。還原糖含量以無水葡萄糖計(jì)，濃度范圍0.2～1.0 mg/mL 的回歸方程為y=1.002x-0.0355，決定系數(shù)R2=0.999。

1.2.8 豬苓多糖得率測定 豬苓菌核多糖提取液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，分別測定總糖和還原糖含量，得率按下式計(jì)算：

式中：Ct表示稀釋液中總糖濃度，mg/mL；Nt表示總糖測定稀釋倍數(shù)；Cr表示稀釋液中還原糖濃度，mg/mL；Nr表示還原糖測定稀釋倍數(shù)；V 表示提取液體積，mL；M 表示原料質(zhì)量，g。

1.2.9 蛋白質(zhì)含量測定 按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明，取25 μL 樣品溶液與200 μL BCA 工作液混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，測定562 nm 處吸光值。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線，回歸方程y=0.00128x+0.04034，決定系數(shù)R2=0.999。

1.2.10 紫外全波長掃描 豬苓菌核粗多糖組分用蒸餾水配制成2 mg/mL 溶液，置于石英比色皿中，采用紫外分光光譜儀在200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.11 抗氧化活性測定

1.2.11.1 DPPH 自由基清除活性 粗多糖組分用蒸餾水稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL 的溶液，移取2.00 mL 溶液與等體積的0.2 mmol/L 新鮮配制的DPPH 甲醇溶液混勻，避光孵育30 min后，在517 nm 處測量吸光度值。實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸為陽性對(duì)照[18]。清除活性計(jì)算公式如下：

式中：Ai表示樣品吸光度值；Aj表示樣品本底吸光度值；A0表示空白對(duì)照吸光度值。

1.2.11.2 總還原力測定 向各試管中加入不同濃度的樣品溶液，加入等體積0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和1%（w/v）鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴20 min后加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后離心取2.5 mL 上清液加入等體積蒸餾水和0.5 mL 氯化鐵溶液，在波長700 nm 處測量吸光度值[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均平行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）表示。采用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平P＜0.05。試驗(yàn)中圖形的繪制使用OriginPro 2015，使用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在保證其余因素不變的情況下，提取溫度、超聲功率、液料比和提取時(shí)間對(duì)豬苓菌核多糖得率的影響如圖1 所示。在液料比20 mL/g、超聲功率300 W、提取時(shí)間90 min 條件下，隨著提取溫度從50 ℃升到100 ℃，豬苓菌核多糖得率先顯著升高（P＜0.05），70 ℃后則無明顯變化（圖1a）。地木耳多糖超聲輔助提取中也有相似的得率隨溫度變化趨勢[20]，其原因可能是溫度升高有助于提高多糖的溶解度及傳質(zhì)效率，但高溫下蒸氣壓升高而形成的氣穴緩沖作用減弱了超聲空化作用[21-22]。因此，選擇提取溫度為60、70、80 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiments

超聲功率與空化氣泡數(shù)量、崩塌能量及空化過程經(jīng)濟(jì)型等密切相關(guān)，是聲空化作用中的重要參數(shù)[23]。圖1b 顯示了液料比20 mL/g、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間90 min 條件下，豬苓菌核多糖得率在120～300 W范圍內(nèi)與超聲功率顯著正相關(guān)（P＜0.05），但在300～360 W 范圍內(nèi)則為負(fù)相關(guān)，這可能是由于超聲功率超過了空化作用的臨界功率值，空化氣泡不能充分崩塌而導(dǎo)致的[24]。此外，超聲功率過大而使多糖出現(xiàn)部分降解，也是造成多糖得率下降的另一可能原因[25]。因此，選擇超聲功率為240、300 和360 W 三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

在提取溫度70 ℃、超聲功率300 W、提取時(shí)間90 min 條件下，液料比在10～30 mL/g 范圍內(nèi)對(duì)豬苓菌核多糖得率的影響如圖1c 所示，隨著液料比的增大，多糖得率先顯著升高（P＜0.05）而后緩慢降低（P＞0.05），液料比為20 mL/g 時(shí)的多糖得率最大。液料比增大，固相和液相間多糖的質(zhì)量濃度差增加，從而使傳質(zhì)動(dòng)力增加，多糖得率增大；但溶劑增多也造成了單位體積內(nèi)的超聲能量降低，而使得多糖得率降低[26]。選擇液料比為15、20 和25 mL/g 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

在液料比20 mL/g、提取溫度70 ℃、超聲功率300 W 條件下，提取時(shí)間在25～90 min 范圍內(nèi)對(duì)豬苓菌核多糖得率的影響如圖1d 所示。25～55 min 內(nèi)多糖得率隨提取時(shí)間延長顯著升高（P＜0.05），55～90 min 內(nèi)多糖得率則先緩慢升高后緩慢下降。延長提取時(shí)間有助于多糖在溶劑中的溶出和擴(kuò)散，但時(shí)間過長則可能使多糖發(fā)生降解而影響多糖得率[13]。綜上，選擇提取時(shí)間為40、55 和70 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型及統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)提取溫度（X1）、超聲功率（X2）、液料比（X3）及提取時(shí)間（X4）進(jìn)行BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。隨著因子水平的組合變化，多糖得率在2.05%～2.44%范圍內(nèi)波動(dòng)。采用Design Expert 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到完全二次多項(xiàng)式回歸模型如下：

回歸模型進(jìn)一步應(yīng)用方差分析及顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見表3。F值和P值用于顯著性評(píng)估，F(xiàn)值越高，P值越低，顯著性則越高[27]。從表3 可知，模型F值為144.18，P＜0.0001，表明回歸模型極其顯著，模型很好地解釋了多糖得率中的變異；失擬項(xiàng)F=0.8500，P＞0.05，說明了模型失擬和純誤差造成的得率變異之間差異不顯著，模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值吻合良好[28]。決定系數(shù)R2=0.9931，校正決定系數(shù)=0.9862，預(yù)測決定系數(shù)=0.9696，說明該回歸模型選擇合適，具有良好的擬合優(yōu)度和預(yù)測能力。較小的變異系數(shù)CV（0.6535%）說明結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性較高。Adeq Precision 指示了模型信噪比，其值大于4 則表明模型抗干擾能力良好[29]。該模型Adeq Precision=35.7917，說明其在自變量范圍內(nèi)是準(zhǔn)確可靠的。

表3 二次模型的方差分析表Table 3 ANOVA table for quadratic model

2.2.2 響應(yīng)面模型充分性診斷 模型充分性診斷可判斷近似模型是否會(huì)產(chǎn)生不良或誤導(dǎo)性的結(jié)果[30]。預(yù)測值與實(shí)際值關(guān)系可用于評(píng)估模型適用性，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布近似直線則表明模型預(yù)測得率和實(shí)際得率之間高度一致。標(biāo)準(zhǔn)化殘差的正態(tài)概率分布近似為一條直線，證明了模型標(biāo)準(zhǔn)化殘差符合正態(tài)分布。殘差與實(shí)驗(yàn)運(yùn)行順序二者關(guān)系可用于驗(yàn)證殘差的序列相關(guān)性，殘差圍繞中心線隨機(jī)分布，表明彼此相近的殘差之間無相關(guān)性。綜上，本文所采用的響應(yīng)面模型對(duì)豬苓菌核多糖得率的描述是充分的。

2.2.3 響應(yīng)面因素分析 由方差分析表（表3）中各項(xiàng)回歸系數(shù)的F值和P值可知，所有線性系數(shù)和二次項(xiàng)系數(shù)均極為顯著，交互項(xiàng)中X1X2、X1X3、X2X3、X3X4的系數(shù)也是顯著的，說明提取溫度和提取時(shí)間之間以及超聲功率和提取時(shí)間之間無顯著交互作用，而其余因素間的交互作用對(duì)多糖得率有顯著影響。由X1X2的系數(shù)及F值可知，交互項(xiàng)中提取溫度和超聲功率的交互作用對(duì)多糖得率影響最大。根據(jù)回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)符號(hào)可知，多糖得率與線性項(xiàng)正相關(guān)，而與交互項(xiàng)及二次項(xiàng)均為負(fù)相關(guān)，因此可推斷出豬苓菌核多糖得率可能存在最大值。

響應(yīng)曲面圖和等高線圖可直觀生動(dòng)地顯示不同因素對(duì)因變量的影響作用，等高線接近橢圓則說明兩因素的交互作用顯著；響應(yīng)曲面圖中曲線越陡則該因素影響越大[31]。圖2a～圖2f 顯示了隨著提取溫度、超聲功率、液料比和提取時(shí)間的增大，豬苓菌核多糖得率均先上升后下降的變化趨勢，響應(yīng)曲面中曲線變化趨勢表明不同因素對(duì)多糖得率的影響作用由大到小分別為：提取時(shí)間、液料比、提取溫度、超聲功率。橢圓形等高線圖（圖2a、圖2b、圖2d、圖2f）說明了提取溫度和超聲功率、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、液料比和提取時(shí)間之間交互作用顯著；近似圓形的等高線圖（圖2c、圖2e）則表明提取溫度和提取時(shí)間、超聲功率和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)多糖得率無顯著影響。

圖2 各因素交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of the effects of interactions among factors on polysaccharide yield

由圖2a～圖2f 可直觀地看到在響應(yīng)面優(yōu)化的參數(shù)范圍內(nèi)，豬苓菌核多糖得率可取得最大值。利用回歸預(yù)測模型計(jì)算可知豬苓菌核多糖超聲輔助提取最佳工藝條件為提取溫度72.3 ℃、超聲功率304.2 W、提取時(shí)間為63.6 min、液料比為21.7 mL/g，最大得率為2.48%。

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 參照響應(yīng)面最佳提取工藝，并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工藝條件為提取溫度72.0 ℃、提取功率300 W、提取時(shí)間65 min 和液料比22 mL/g，在此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)得到豬苓菌核多糖得率為2.47%±0.03%，與回歸模型預(yù)測的多糖得率最大值相比無顯著差異，說明應(yīng)用響應(yīng)面模型優(yōu)化多糖超聲輔助提取工藝條件的結(jié)果可靠。

2.3 豬苓粗多糖理化特性分析

按照最優(yōu)工藝條件提取后，通過酒精沉淀分級(jí)得到3 個(gè)豬苓菌核粗多糖組分PUPF30、PUPF60、PUPF80，它們的紫外全波長掃描結(jié)果如圖3 所示。3 個(gè)組分的最大紫外吸收均在200～210 nm，表明了多糖為它們的主要成分；同時(shí)260～280 nm 范圍內(nèi)的少量吸收則說明了它們也含有少量蛋白和核酸。對(duì)3 個(gè)粗多糖組分的總糖、還原糖和蛋白含量進(jìn)一步進(jìn)行測定，結(jié)果如表4 所示。多糖含量由高到低為PUPF60、PUPF80、PUPF30，對(duì)應(yīng)含量分別為58.60%、50.35%、39.99%；蛋白含量由低到高為PUPF60、PUPF80、PUPF30，對(duì)應(yīng)含量分別為14.42%、25.54%、25.80%。PUPF60 在三個(gè)組分中是多糖含量最高且蛋白含量最低的組分。

圖3 豬苓菌核粗多糖紫外全波長掃描圖Fig.3 UV scanning spectra of crude polysaccharide fractions form crude polysaccharide from Polyporus umbellatus sclerotium

表4 豬苓菌核粗多糖組分糖含量和蛋白含量Table 4 Glucose content and protein content of crude polysaccharide components in sclerotium of Polyporus umbellatus

2.4 豬苓菌核多糖體外抗氧化活性

2.4.1 豬苓菌核多糖的DPPH 自由基清除活性DPPH 作為一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其在517 nm處的最大吸收隨著自由基清除劑的加入而下降，被廣泛用于自由基消除能力的體外評(píng)估[32-33]。豬苓菌核粗多糖組分的DPPH 自由基清除活性如圖4 所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，三個(gè)粗多糖組分均呈現(xiàn)出一定的DPPH 自由基清除活性，自由基清除能力隨多糖濃度增高而增高。PUPF60 和PUPF80 的自由基清除活性明顯優(yōu)于PUPF30，濃度4 mg/mL 時(shí)，PUPF30的清除率為50.63%，而PUPF60 和PUPF80 的清除率分別為83.95%和87.48%，接近同等濃度下VC的清除率。

圖4 豬苓菌核粗多糖組分對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effects of crude polysaccharide components from Polyporus umbellatus sclerotium on DPPH radical clearance rate

2.4.2 豬苓菌核粗多糖組分的總還原能力測試結(jié)果多糖的總還原力與抗氧化活性呈正相關(guān)，多糖作為一種電子供體能與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定產(chǎn)物，阻止過氧化物生成[34]。豬苓菌核多糖能使鐵氰化物復(fù)合物中Fe3+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的Fe2+，還原力越強(qiáng)，對(duì)應(yīng)的吸光度值越高[35]。如圖5，在0.1～4.0 mg/mL 的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著豬苓菌核多糖濃度增大，吸光度值也隨之增大。三個(gè)粗多糖組分的總還原力大小比較結(jié)果為PUPF80＞PUPF60＞PUPF30。

圖5 豬苓菌核粗多糖組分對(duì)體系總還原力的影響Fig.5 Effect of crude polysaccharide components from Polyporus umbellatus sclerotium on total reducing power of the system

活性氧（ROS），包括過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基等，是引起食品、藥品氧化劣變以及多項(xiàng)機(jī)體失調(diào)的重要影響因素，而抗氧化劑是有效降低這些活性氧造成的不利效應(yīng)的重要物質(zhì)。合成抗氧化劑潛在的毒副效應(yīng)近年來日益受到關(guān)注，因此天然抗氧化劑的開發(fā)研究正逐漸加速。多糖是天然抗氧化劑的重要來源，如鐵皮石斛多糖[36]和祁白芷多糖[37]的抗氧化活性均已報(bào)道。天然活性多糖可能的抗氧化機(jī)制是通過從穩(wěn)定的化合物中轉(zhuǎn)移氫原子或單電子來終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同時(shí)多糖的抗氧化與其化學(xué)組成、分子量、構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)[38-39]?？寡趸Y(jié)果顯示豬苓菌核經(jīng)超聲輔助提取后，制備得到的三個(gè)組分均具有一定的抗氧化活性，同時(shí)PUPF60 和PUPF80 在DPPH 自由基清除能力及總還原能力測試中的抗氧化性能優(yōu)于PUPF30，有作為候選天然抗氧化劑而進(jìn)一步研究利用的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，豬苓菌核多糖超聲輔助提取的響應(yīng)面回歸模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，對(duì)多糖得率的描述充分，適于多糖得率的優(yōu)化預(yù)測分析。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝條件為提取溫度72.0 ℃、提取功率300 W、提取時(shí)間65 min和液料比22 mL/g，在此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)得到豬苓菌核多糖得率為2.47%±0.03%，與回歸模型預(yù)測的豬苓菌核多糖最大得率結(jié)果無顯著差異?；貧w模型顯著性分析表明豬苓菌核多糖得率不僅與四個(gè)提取參數(shù)顯著相關(guān)，也與提取溫度和超聲功率、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、液料比和提取時(shí)間之間的交互作用顯著相關(guān)。超聲輔助提取的豬苓菌核多糖經(jīng)分級(jí)醇沉制備得到PUPF30、PUPF60、PUPF80，多糖含量分別為39.99%、58.60%、50.35%，蛋白含量分別為25.80%、14.42%、25.54%?？寡趸瘻y試結(jié)果表明豬苓菌核多糖組分在DPPH 自由基清除能力和還原力均呈一定的劑量依賴性，但PUPF80和PUPF60 的抗氧化能力明顯優(yōu)于PUPF30。綜上，響應(yīng)面應(yīng)用于豬苓菌核多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化是合適的，且優(yōu)化后的提取工藝可用于豬苓菌核活性多糖的有效提取制備，為豬苓菌核多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。