＊邱云峰 李信哲 陳歌輝 惠建博 果崇申 劉紹琴*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院 黑龍江 150080 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院 黑龍江 150001）

鈦合金憑借其優(yōu)異的生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、耐腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)廣泛用作骨骼、關(guān)節(jié)、牙齒等替代物。然而鈦植入物表面由于細(xì)菌粘附極易引發(fā)細(xì)菌感染，造成植入失效或面臨二次手術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題[1]?；诖?，鈦植入物表面抗菌納米涂層制備是近年來(lái)納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究熱點(diǎn)之一[2]。

無(wú)機(jī)納米抗菌劑具有廣譜抗菌性能，可以殺滅耐藥細(xì)菌[3]。研究發(fā)現(xiàn)光熱-光動(dòng)力、光熱-化療等聯(lián)合療法比單獨(dú)療法具有更優(yōu)異的協(xié)同抗菌效果，可以減少藥物用量和高熱對(duì)正常組織的損傷[4]。在鈦植入物表面制備聯(lián)合抗菌涂層是納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的發(fā)展方向，但是目前高校在相關(guān)領(lǐng)域的教學(xué)中主要依賴(lài)于科技前沿導(dǎo)論等理論課程，即使開(kāi)設(shè)抗菌類(lèi)實(shí)驗(yàn)也僅僅是圍繞平板計(jì)數(shù)法等實(shí)驗(yàn)操作，忽視與國(guó)際研究熱點(diǎn)的聯(lián)系[5-6]。遵循此思路，有必要將聯(lián)合抗菌納米涂層引入到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，提高學(xué)生的科研創(chuàng)新能力，把握前沿學(xué)術(shù)方向[7]。本綜合實(shí)驗(yàn)抗菌涂層制備工藝成熟便捷，實(shí)驗(yàn)參數(shù)容易控制，學(xué)院分析測(cè)試技術(shù)平臺(tái)和微生物平臺(tái)完善，實(shí)驗(yàn)周期較短，適合本科生的專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

（1）了解光熱效應(yīng)和光照產(chǎn)生活性氧物種的原理。（2）掌握聚多巴胺/Ag@AgCl涂層的制備方法。（3）了解XRD、SEM、FTIR等設(shè)備結(jié)構(gòu)、原理和使用方法。（4）掌握抑菌性能研究方法。

2.實(shí)驗(yàn)原理

（1）聚多巴胺的光熱治療抗菌原理。聚多巴胺是一種具有近紅外吸收特性的仿生高分子材料，在弱堿性水相條件下即可發(fā)生自聚合反應(yīng)，具有優(yōu)異的生物安全性。其光熱轉(zhuǎn)換效率可以高達(dá)40%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)中廣泛使用的金納米棒（20%）。聚多巴胺可以迅速將光能轉(zhuǎn)化為熱能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)而殺滅細(xì)菌[8]。并且對(duì)于已經(jīng)形成生物被膜的結(jié)構(gòu)也可以利用高熱破壞外層菌膜結(jié)構(gòu)殺滅深層細(xì)菌。基于此物理殺菌機(jī)制可以避免耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。

（2）Ag@AgCl光動(dòng)力治療抗菌原理。光敏劑在特定波長(zhǎng)的光激發(fā)下，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周?chē)腛2分子形成高活性氧物種,引起細(xì)菌氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。光動(dòng)力殺菌技術(shù)能夠選擇性地治療局部感染病灶，對(duì)健康組織和周邊細(xì)胞損害小。Ag@AgCl包含AgCl半導(dǎo)體（帶隙：3.25eV）光吸收和Ag的表面等離激元共振吸收，吸收光譜范圍覆蓋可見(jiàn)區(qū)到近紅外波段，可以在光激發(fā)下產(chǎn)生活性氧物種，已經(jīng)廣泛用于光動(dòng)力抗菌和抗腫瘤等。

（3）聚多巴胺/Ag@AgCl涂層的光熱-光動(dòng)力協(xié)同抗菌原理。光熱效應(yīng)顯著改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，光動(dòng)力生成的ROS可以更加容易的進(jìn)入到細(xì)菌的內(nèi)部，造成DNA損傷和蛋白質(zhì)變性，大量蛋白質(zhì)等流失后引起細(xì)菌的死亡。因此光熱-光動(dòng)力協(xié)同抗菌劑可以比單一抗菌療法具有更加優(yōu)異的抗菌效果。

3.實(shí)驗(yàn)儀器

（1）實(shí)驗(yàn)試劑。醫(yī)用鈦片、硝酸銀、鹽酸多巴胺、Tris-HCl、蒸餾水、氫氧化鉀、肉湯、瓊脂、pH試紙、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、Syto 9綠色熒光染料和碘化丙啶（PI）。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器。燒杯、錐形瓶、移液槍、磁力加熱攪拌器、烘箱、XRD、SEM、FTIR、CLSM、近紅外光源激光器、紅外攝像儀、超聲波清洗器、潔凈臺(tái)、滅菌鍋、紫外燈、酒精燈、涂布棒。

（3）實(shí)驗(yàn)表征。采用Quanta 200FEG型號(hào)SEM表征鈦片形貌。通過(guò)PANalytical Empyrean型號(hào)XRD測(cè)定結(jié)構(gòu)。采用賽默飛FTIR表征聚多巴胺分子結(jié)構(gòu)。采用菲利爾E8紅外成像儀測(cè)試光熱轉(zhuǎn)換溫度。采用808nm近紅激光器進(jìn)行抗菌性能研究。采用尼康A(chǔ)1R激光掃描共聚焦顯微鏡觀察活死細(xì)胞。

4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）醫(yī)用鈦片的表面處理。將1mm厚度鈦片裁剪為1cm×1cm，乙醇和水分別超聲清洗5min待用。配置4mol/L氫氧化鉀水溶液50mL，將上述鈦片浸入裝有堿液的燒杯中，室溫刻蝕24h，反應(yīng)結(jié)束后用大量去離子水清洗去除表面殘留，pH試紙測(cè)試水溶液pH為7左右，放入50℃烘箱烘干。采用SEM觀察堿刻蝕鈦片形貌。如圖1所示，4mol/L堿溶液可以在鈦片表面刻蝕多孔納米結(jié)構(gòu)。

圖1 （a）純水和（b）4mol/L氫氧化鉀溶液刻蝕醫(yī)用鈦片表面的SEM圖

（2）聚多巴胺/Ag@AgCl涂層。將0.05g多巴胺鹽酸鹽和0.05g AgNO3加入到7mL Tris-HCl緩沖溶液（pH8.5，0.01mol/L）中，將多孔鈦片浸泡在上述混合溶液，連續(xù)機(jī)械攪拌24h，獲得聚多巴胺/Ag@AgCl。通過(guò)XRD進(jìn)行測(cè)定結(jié)構(gòu)。采用FTIR表征聚多巴胺的酰胺基、芳香環(huán)和鄰苯二酚中羥基官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)。

（3）光熱性能評(píng)價(jià)。激光功率（1W/cm2），距離10cm，使用熱成像儀每分鐘記錄溫度變化和熱圖像，輻照時(shí)間20min，利用Origin軟件繪制曲線。如圖2所示，在808nm激光輻照下溫度逐漸升高，20min后溫度達(dá)到56.5℃，高于對(duì)照組。

圖2 （a）涂層修飾鈦片在激光輻照下的熱成像圖；（b）純水、鈦片和涂層修飾鈦片升溫曲線

（4）光熱-光動(dòng)力抗菌性能和機(jī)理研究。使用滅菌鍋對(duì)錐形瓶、肉湯和瓊脂培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。選擇革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）和陰性菌（大腸桿菌）作為研究對(duì)象，復(fù)蘇冷凍細(xì)菌，將對(duì)數(shù)期菌懸液稀釋至108CFU/mL待用。選擇24孔板作為反應(yīng)器，將50μL細(xì)菌培養(yǎng)物加入450μL肉湯中，將修飾涂層的鈦片浸泡在上述肉湯中，37℃條件下培養(yǎng)6h。使用808nm激光輻照，采用紅外熱像儀監(jiān)測(cè)溫度。殺菌完成后，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌懸液稀釋?zhuān)傊?7℃培養(yǎng)12h。采用ImageJ軟件對(duì)菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)平行三次。如圖3所示，涂層修飾鈦片表面菌落數(shù)目最少，其抑菌率為99.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于無(wú)光照組，以及光照純鈦片和聚多巴胺修飾鈦片對(duì)照組。

圖3 （a）鈦片和涂層修飾鈦片表面在光照下大腸桿菌落生長(zhǎng)情況（b）鈦片、聚多巴胺修飾鈦片和涂層修飾鈦片的抑菌率

使用移液槍稱(chēng)取熒光染料滴加到PBS溶液中，將染料滴加到覆蓋菌落的鈦片，避光吸附15min，沖洗3次，利用激光共聚焦顯微鏡表征活死細(xì)菌。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)束，4%多聚甲醛溶液低溫固定，乙醇梯度脫水10min，自然晾干，噴金處理后測(cè)試SEM。

（5）其它協(xié)同抗菌涂層的制備方法。為了提高學(xué)生抗菌納米涂層研發(fā)能力，除了上述聚多巴胺/Ag@AgCl涂層，鼓勵(lì)學(xué)生分組設(shè)計(jì)抗菌涂層，例如選擇碳材料、半導(dǎo)體等抗菌材料，通過(guò)調(diào)研文獻(xiàn)，撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)可行性分析，依據(jù)光熱-光動(dòng)力基本原理，設(shè)計(jì)抗菌涂層，對(duì)比抗菌效果，總結(jié)設(shè)計(jì)規(guī)律和抗菌機(jī)制，為研究生階段的科研課題設(shè)計(jì)打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

5.實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容設(shè)計(jì)

(1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)涉及材料、抗菌、表征等多個(gè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識(shí)，將提前2周安排學(xué)生查閱光熱-光動(dòng)力抗菌研究的文獻(xiàn)，并建議學(xué)生掌握以下知識(shí)：①了解鈦片堿刻蝕、聚多巴胺合成和Ag@AgCl制備方面的知識(shí)；②了解光熱治療和光動(dòng)力治療的原理；③了解耐藥菌的產(chǎn)生機(jī)制以及殺滅耐藥菌的主要方法；④了解活死細(xì)菌染色機(jī)理；⑤了解儀器和制圖軟件的原理和操作方法。

(2)實(shí)驗(yàn)課程安排

本綜合實(shí)驗(yàn)擬為醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院的新醫(yī)學(xué)科學(xué)與技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)，累計(jì)72學(xué)時(shí)，本部分16學(xué)時(shí)，4～6人一組。為保障實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，每次操作至少2人在場(chǎng)，教師現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，共同完成實(shí)驗(yàn)。

具體安排如下：①理論課2學(xué)時(shí)。講授鈦片刻蝕原理、聚多巴胺形成機(jī)制、一步法制備Ag@AgCl原理、光熱和光動(dòng)力抗菌原理、活死細(xì)菌染色和死菌表征方法。②鈦片預(yù)處理2學(xué)時(shí)，包括清洗鈦片、配置堿液、稱(chēng)量藥品等。③聚多巴胺/Ag@AgCl涂層修飾鈦片制備2學(xué)時(shí)，包括配置Tris溶液、稱(chēng)量藥品、準(zhǔn)備攪拌器等。④形貌和組成表征3學(xué)時(shí)。大二本科生通過(guò)大學(xué)生科創(chuàng)項(xiàng)目熟悉常用表征設(shè)備，根據(jù)準(zhǔn)備樣品、上機(jī)操作等安排3學(xué)時(shí)。⑤抗菌研究7學(xué)時(shí)。根據(jù)器皿滅菌、制備瓊脂、細(xì)菌復(fù)蘇、光照等安排7學(xué)時(shí)。⑥實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2周以?xún)?nèi)上交實(shí)驗(yàn)論文。包括原理、圖表和分析、結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)、文獻(xiàn)等內(nèi)容。

(3)思考題

設(shè)計(jì)如下問(wèn)題供學(xué)生思考：①為什么要設(shè)計(jì)協(xié)同抗菌納米催化劑？②單質(zhì)Ag的作用是什么？③除了聚多巴胺/Ag@AgCl涂層，還可以設(shè)計(jì)哪些新穎的協(xié)同抗菌劑？

6.結(jié)束語(yǔ)

本綜合實(shí)驗(yàn)通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了光熱-光動(dòng)力協(xié)同抗菌納米材料的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，使學(xué)生們了解抗菌納米材料的前沿進(jìn)展，培養(yǎng)學(xué)生們查詢(xún)文獻(xiàn)、整理資料、總結(jié)前沿?zé)狳c(diǎn)的能力。本實(shí)驗(yàn)中聚多巴胺在堿性條件下就可以聚合，并且使用的化學(xué)試劑包含氯離子，可以同時(shí)制備Ag@AgCl，一步法就可以方便的在鈦片表面形成穩(wěn)定的納米抗菌涂層，制備方法簡(jiǎn)便可控，適合本科生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。在抗菌性能研究和材料表征過(guò)程中，學(xué)生們的理論知識(shí)可以在實(shí)踐操作中得到有效的檢驗(yàn)，有利于提高學(xué)生的科研創(chuàng)新能力。