韓麗春,何雪蓮,鄭鄢燕,左進華,王 清,王正榮
(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲 056107;2.北京市農林科學院農產品加工與食品營養(yǎng)研究所,果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室,農業(yè)農村部蔬菜采后處理重點實驗室,北京 100097;3.邯鄲市天然產物與功能食品開發(fā)重點實驗室,河北 邯鄲 056107)
扁豆[Lablab purpureus(Linn.)Sweet]是豆科、扁豆屬多年生纏繞藤本植物,在我國南北方均有種植,目前我國栽培的種類主要有綠扁豆、白扁豆、紫扁豆、豬耳豆等[1]。扁豆作為典型的豆類蔬菜代表,在“南菜北運”產銷物流鏈中占據(jù)一定地位,然而,扁豆豆莢組織幼嫩,且上市季節(jié)主要集中在夏秋季,在采后的商品化處理和物流過程中極易出現(xiàn)失水萎蔫、腐爛變質、銹斑化、豆粒膨大褐變等品質劣變問題而導致?lián)p耗嚴重,造成嚴重的經濟損失。針對改善豆類蔬菜采后品質劣變問題的研究有很多,包括采取1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)[2-3]、丙二酸[4]、殼聚糖涂膜[5]、精胺[6]和低溫貯藏[7]等方式處理以延緩豆類蔬菜的黃化、軟化、木質纖維化、銹斑化、失水萎縮、成熟衰老等品質劣變現(xiàn)象,從而維持其較好的感官品質,延長保鮮期。但目前扁豆的保鮮技術主要以冷藏為主,更多的保鮮方法仍有待進一步研究。
影響新鮮果實采后品質劣變的因素較多,但果實自身衰老是采后損耗的主要誘因。一氧化氮(nitric oxide,NO)作為植物中重要的信號分子,在調節(jié)果蔬的成熟衰老方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。NO可以通過調控果蔬貯藏過程中乙烯的合成以及抗氧化酶的活性來達到延緩果蔬成熟衰老的目的[10-11]。目前的研究中多采用NO氣體熏蒸或外源NO供體浸泡處理,而近年來外源NO供體硝普納(sodium nitro prusside,SNP)浸泡處理受到研究者的廣泛關注,NO氣體熏蒸需要無氧條件,而SNP浸泡處理可以避免此條件的限制,達到更好的保鮮效果[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),0.25 mmol/L的SNP浸泡處理芒果2 min后置于23 ℃貯藏,可有效抑制果實呼吸速率和質量損失,維持果實硬度、好果率和果皮色澤,保持良好的果實品質,并延長其貯藏期[14]。范林林等[15]研究SNP浸泡處理對豇豆貯藏品質的影響,發(fā)現(xiàn)使用0.3 mmol/L SNP可以很好地維持豇豆的感官品質,抑制乙烯的釋放和質量損失,減緩營養(yǎng)成分的降解,使豇豆維持較好的貯藏品質,保持商品價值。此外還有研究表明,SNP對藍莓[16-17]、蘋果[18]、血橙[19]等果蔬均有不同程度的保鮮效果,可以延緩果實的成熟衰老,抑制果實的品質劣變,調節(jié)抗氧化酶的活性,從而達到延長貯藏期的效果。但目前有關外源NO對扁豆成熟衰老影響的相關報道較少。
因此,本實驗選取扁豆作為研究對象,課題組前期利用不同濃度的SNP(0、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L)對扁豆進行處理,通過表型評價,確定最適SNP濃度為0.2 mmol/L,本研究進一步探討0.2 mmol/L SNP處理對扁豆采后品質的影響,以期為扁豆采后保鮮提供新的思路和理論依據(jù),為NO在蔬菜貯藏保鮮方面的應用提供理論參考。
扁豆購于北京果蔬好超市,挑選大小一致、質地脆嫩、新鮮有光澤、莢面清潔、無病蟲害及其他傷害的豆莢進行實驗。
0.03mm 低密度聚乙烯自封袋折扣包裝(20 cm×40 cm)北京華盾雪花有限公司。
SNP 上海麥克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉 西隴科學股份有限公司;交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP) 柏吉(湖北)生物科技有限公司;愈創(chuàng)木酚上海麥克林生化科技有限公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA) 柏吉(湖北)生物科技有限公司;硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA) 國藥集團化學試劑有限公司;過氧化氫酶(catalase,CAT)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活力檢測試劑盒北京索萊寶科技有限公司。
UV-1800紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;Spectra Maxi3酶標儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;TA-XT plus質構儀 英國SMS公司;Chroma-Meter CR-400色彩色差儀 柯盛行(杭州)儀器有限公司;Palette PR-100數(shù)顯折光儀 日本Atago公司;M20研磨機 艾卡(廣州)儀器設備有限公司。
1.3.1 樣品處理
將挑選好的扁豆分為兩組(每個處理組設置5 個取樣點,每個取樣點設置3 個平行,每個平行裝1 kg扁豆)進行浸泡處理,對照組(CK組)使用蒸餾水浸泡10 min,實驗組(SNP組)使用0.2 mmol/L濃度的SNP溶液浸泡10 min。室溫環(huán)境下自然晾干后裝入0.03 mm厚低密度聚乙烯自封袋中折扣包裝,每袋裝約1 kg的扁豆,在20 ℃相對濕度80%~90%條件下貯藏。從0 d開始每2 d對兩個處理組取樣進行觀察,統(tǒng)計腐爛率和銹斑率,同時測定色差、硬度、總可溶性固形物(total soluble solid,TSS),收集的豆莢組織于-80 ℃凍藏,以測定其他指標。
1.3.2 腐爛率和銹斑率的測定
腐爛率的測定:觀察扁豆腐爛個數(shù)以及腐爛面積占整個豆莢表面積的百分比,將扁豆的腐爛面積分為3級。0級:無腐爛;1級:腐爛面積比小于50%;2級;腐爛面積比達50%以上。按照式(1)計算腐爛率。
銹斑率的測定:觀察扁豆產生銹斑個數(shù)及銹斑面積占整個豆莢表面積的百分比,將扁豆的銹斑面積分為5級[20]。0級:無銹斑;1級:銹斑面積比例小于10%;2級:銹斑面積比例在10%~25%之間;3級:銹斑面積比例在25%~50%之間;4級:銹斑面積比例大于50%。按照式(2)計算銹斑率。
1.3.3 色澤和總葉綠素含量的測定
色澤使用Chroma-Meter CR-400色彩色差儀測定,選取扁豆中心避開豆粒所在位置進行測定,記錄a*、b*和L*值。a*值代表紅綠度,正值偏紅,負值偏綠;b*值代表黃藍度,正值偏黃,負值偏藍;L*值代表亮度,正值偏亮,負值偏暗。
總葉綠素含量的測定參照曹建康等[21]的方法。
1.3.4 丙二醛含量和硬度的測定
丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量采用曹建康等[21]的方法測定。
硬度采用TA-XT plus質構儀測定,探頭直徑為0.5 cm,選取扁豆中心位置表面平整的點(避開豆粒所在位置)進行測定。
1.3.5 TSS質量分數(shù)的測定
TSS質量分數(shù)使用手持式數(shù)顯折光儀測定,豆莢需去頭、尾、筋和豆粒,取中間部位進行測定。
1.3.6 類黃酮和總酚含量的測定
類黃酮和總酚含量的測定參照曹建康等[21]的方法。
1.3.7 代謝相關酶活力的測定
過氧化物酶(peroxidase,POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活力的測定參考曹建康等[21]的方法。
CAT、PPO和PAL活力均采用試劑盒進行測定。
以上指標測定時均取3 個平行,重復測定3 次。采用Excel 2021軟件進行數(shù)據(jù)處理,結果以平均值±標準差表示,采用Origin 2021軟件作圖,SPSS 21軟件用于數(shù)據(jù)差異顯著性分析(利用Duncan多重比較進行分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著)。
從圖1A可以看出扁豆的腐爛和銹斑主要集中在豆莢的兩側、尾部以及豆粒處。0 d的扁豆豆莢肥厚、色澤鮮嫩,而隨著貯藏時間的延長,扁豆開始失水萎蔫、腐爛變質、產生銹斑,色澤也變得暗淡無光且有變黃的趨勢,CK組的扁豆在第8天時已經完全失去了食用價值,豆粒膨大褐變,豆莢出現(xiàn)大面積銹斑腐爛,整個豆莢也出現(xiàn)萎蔫失水、暗淡無光的現(xiàn)象,SNP組扁豆外觀品質的劣變較CK組延緩2~4 d,可以明顯看出SNP組的扁豆外觀品質在第8天時與CK組第4~6天的相近。
圖1 SNP處理對扁豆外觀品質(A)、腐爛率(B)和銹斑率(C)的影響Fig.1 Effect of SNP treatment on the appearance quality (A),decay rate (B) and rust spot rate (C) of hyacinth bean
如圖1B所示,對照組扁豆在第4天有些許腐爛,腐爛扁豆僅占總體的6.01%,第8天時腐爛率達到43.08%,SNP組扁豆的腐爛出現(xiàn)時間相對延遲兩天,第6天開始在豆莢頭尾處出現(xiàn)腐爛,至貯藏末期腐爛率達到18.86%。如圖1C所示,CK組在2 d時出現(xiàn)的銹斑多處于1~2級,會在豆莢表面呈現(xiàn)輕微的褐色斑點,但因出現(xiàn)銹斑的扁豆數(shù)量較多,所以銹斑率達到10.61%,不影響食用價值,第8天銹斑率達到70.44%,且以3級銹斑居多,有少量4級銹斑出現(xiàn),莢面呈現(xiàn)大片褐色斑點,以豆莢頭部尾部兩側以及豆粒處最為明顯,扁豆完全失去商品價值;整個貯藏期間SNP組豆莢產生的銹斑在貯藏期內都處于1~2級,銹斑多呈現(xiàn)褐色小斑點,出現(xiàn)在豆莢兩側以及頭尾處,8 d時銹斑率達到30.5%,莢面出現(xiàn)的點狀銹斑較多,對商品價值造成了一定的影響。
果蔬的色澤變化對于消費者的直觀感受有較大影響,擁有良好的色澤可以提升消費者的購買欲。SNP處理對扁豆貯藏期色澤的影響差異極顯著(P<0.01)。在貯藏期間兩組的a*值和b*值呈上升趨勢(圖2A、B)。兩組a*值在前4 d的變化趨勢相近,且上升幅度較大,4~6 d時SNP組的a*值上升趨勢受到抑制,至第8天時,CK組的a*值較初值上升了41.44%,SNP組的a*值較初值上升了28.41%(圖2A)。b*值的起始值為13.00,從第2天開始CK組b*值上升速率加快,第8天時b*值已增加到20.08,較初值增加了54.49%,第8天時SNP組的b*值較初值增加了30.07%(圖2B)。兩個組的L*值皆呈下降的趨勢(圖2C),但CK組L*值的下降速率明顯要快于SNP組,L*值的初始值為52.46,第8天時CK組的L*值下降到35.46,SNP組的L*值下降到41.63。說明在貯藏期間使用SNP處理可以延緩扁豆的黃化褪色,維持扁豆的綠色和光澤。
圖2 SNP處理對扁豆a*(A)、b*(B)、L*(C)值和總葉綠素含量(D)的影響Fig.2 Effect of SNP treatment on the a* (A),b* (B) and L* (C) values and chlorophyll content (D) of hyacinth bean
葉綠素是植物光合作用的關鍵因子,它的存在對果蔬的顏色有極大的影響,其含量可以反映采后扁豆的顏色。如圖2D所示,葉綠素含量的變化趨勢為先升后降,CK組在第4天達到峰值(0.38 mg/g),4~6 d呈緩慢下降趨勢,第8天時葉綠素含量急劇下降,此時的葉綠素含量為貯藏期最低值(0.23 mg/g)。SNP組的葉綠素含量在0~4 d處于上升狀態(tài),在第4天達到峰值0.41 mg/g,后期葉綠素開始降解,含量逐漸下降。說明SNP浸泡處理對葉綠素的降解有一定的抑制效果,可以使扁豆保持良好的顏色,維持扁豆的商品價值。
MDA是細胞膜脂質過氧化的最終產物,其含量與細胞膜的完整性密切相關,可以反映細胞膜脂質過氧化的程度,直接影響細胞的衰老死亡,可以作為判斷膜氧化損傷的指標,細胞膜的完整性間接影響果蔬的硬度[22-23]。貯藏期間扁豆的MDA積累量逐漸增加(圖3A),在0~4 d時,CK組扁豆中MDA的積累量較少,第4天開始MDA含量上升幅度比較大,第8天時MDA的積累量達到1.44 μmol/g,SNP組的MDA含量一直低于CK組,至第8天時,SNP組的MDA積累量為1.01 μmol/g,較CK組低16.44%。如圖3B所示,扁豆在第0天的硬度為5.84 N,CK組在第8天時硬度降低到0.79 N,SNP組硬度則降至2.35 N,在0~6 d,兩組硬度的下降趨勢較為一致,但在第8天時,CK組硬度下降速率加快,與初始值相比下降了86.41%,而SNP組的降幅受到抑制,第8天時與初始值相比只下降了59.68%。綜上,SNP處理能夠極顯著抑制扁豆MDA的積累和硬度的下降(P<0.01)。
圖3 SNP處理對扁豆MDA含量(A)和硬度(B)的影響Fig.3 Effect of SNP treatment on the MDA content (A) and hardness (B) of hyacinth bean
果蔬中TSS含量是指提取物中溶解的糖、酸和維生素的總含量,主要是糖(包括葡萄糖、果糖、蔗糖等)的含量[24]。如圖4所示,兩組的TSS質量分數(shù)先增后降,但SNP組的TSS質量分數(shù)始終高于CK組。0~2 d,CK組和SNP組的TSS質量分數(shù)呈上升趨勢,CK組在第2天的TSS質量分數(shù)與初始值相比增加了10.70%,SNP組則增加了16.93%,兩組扁豆的TSS質量分數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)。在2~8 d,兩組的TSS質量分數(shù)呈下降趨勢,第4天的降幅比較明顯,貯藏后期的降幅趨于平緩。TSS質量分數(shù)在整個貯藏過程中呈現(xiàn)上述變化,其原因可能是在各種酶的作用下,一些大分子物質在早期被水解為可溶成分,隨后在呼吸作用的影響下,可溶成分逐漸被消耗[22]。
圖4 SNP處理對扁豆TSS質量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of SNP treatment on the total soluble solid content of hyacinth bean
酚類化合物是果蔬中重要的成分,其與果蔬的成熟衰老、組織褐變、抗逆性等密切相關,酚類化合物具有抗氧化活性,可以阻止氫過氧化物轉化為自由基或滅活脂質自由基,同時多酚物質還是酶促褐變的關鍵底物[25-26]。貯藏過程中,扁豆組織中總酚的含量逐漸增加,且SNP組的總酚含量始終高于CK組(圖5A)。第2天時,CK組的總酚含量略微下降,較初始值下降了2.98%,2~4 d總酚含量上升的趨勢相對穩(wěn)定,而第8天時總酚增加量(與0 d相比)只有0.19 OD280nm/g;SNP組的總酚含量在0~4 d增加較為緩慢,只從初始值的2.15 OD280nm/g增加到2.21 OD280nm/g,4 d后總酚的含量則迅速上升,終點的總酚含量達到2.71 OD280nm/g,與初始值相比增加了26.41%。SNP處理顯著提高了扁豆總酚的含量(P<0.05,P<0.01)。
圖5 SNP處理對扁豆總酚(A)和類黃酮(B)含量的影響Fig.5 Effect of SNP treatment on the total phenol (A) and flavonoid (B)contents of hyacinth bean
類黃酮屬于酚類物質廣泛存在許多植物組織中。如圖5B所示,貯藏前期CK組的類黃酮含量高于SNP組,CK組的類黃酮含量在整個貯藏期不是很穩(wěn)定,第2天時有小幅度的增加,第4天時類黃酮含量與第2天相比有下降趨勢,之后的兩個貯藏時間點又出現(xiàn)較明顯的上升和下降;2 d之后,SNP組的類黃酮含量快速增加,且含量一直高于CK組,至貯藏末期,類黃酮的含量與初始值(1.70 OD325nm/g)相比增加了55.65%。整個貯藏期內,SNP處理扁豆類黃酮含量總體極顯著高于對照組扁豆(P<0.01)。
PPO和POD作為苯丙烷代謝途徑末端的兩個氧化酶,參與果蔬酶促褐變反應,可以氧化果蔬中酚類物質形成褐色物質。如圖6A所示,在貯藏期間,兩組PPO活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在0~2 d時,CK組和SNP組的PPO活力緩慢上升,兩組的變化趨勢相近且差異不顯著,在貯藏至第4天,扁豆的PPO活力出現(xiàn)峰值,此時對照組和SNP組PPO活力分別為14.40 U/(g·min)和9.13 U/(g·min)。如圖6B所示,CK組的POD活力一直處于上升趨勢,而SNP組的POD活力呈先升后降的趨勢,CK組在4 d之后上升速率加快,第8天時POD的活力由初始值的14.42 U/(g·min)達到28.47 U/(g·min),SNP組貯藏前6 d POD活力呈上升趨勢,但變化不明顯,第8天時有小幅度的下降,且整個貯藏期間SNP處理極顯著抑制了扁豆POD活力(P<0.01)。
圖6 SNP處理對扁豆貯藏過程中PPO(A)、POD(B)、APX(C)、CAT(D)和PAL(E)活力的影響Fig.6 Effect of SNP treatment on the PPO (A),POD (B),APX (C),CAT (D) and PAL (E) activities of hyacinth bean during storage
APX和CAT是果蔬體內重要的抗氧化酶類,可以有效地清除果實代謝過程中產生的活性氧,使活性氧維持在一個較低的水平,從而防止活性氧引起的膜脂過氧化及其他損傷,延緩果蔬的成熟衰老[27-28]。貯藏期間扁豆的APX活力先升后降(圖6C),CK組扁豆的APX活力在第2天就開始下降,峰值為0.045 U/(g·min),2 d之后APX活力迅速下降,貯藏終點值較峰值下降了41.06%,SNP組的APX活力則是緩慢上升到第6天才開始下降,在峰值時的APX活力達到0.05 U/(g·min)。CAT活力呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(圖6D),在貯藏前兩天CK組和SNP組的CAT活力都大幅度下降,分別下降了29.68%和15.25%,CK組從第2天開始上升,SNP組則是從第4天開始呈上升趨勢,第8天時兩組CAT活力的上升都趨于平緩。綜上,SNP處理能夠很好地維持APX和CAT活力。
PAL參與類黃酮的合成,在植物生長發(fā)育、果色形成、抗病、抗逆等方面發(fā)揮著重要作用,此外,PAL還可以誘導苯丙烷的生物合成,以應對生物和非生物脅迫,如病原體攻擊、機械損傷、紫外線照射和光照等[29]。貯藏期間扁豆的PAL活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(圖6E),在貯藏前兩天,對照組和SNP組的PAL活力略微下降,CK組和SNP組PAL活力最低時分別為0.166 U/(g·min)和0.176 U/(g·min),隨后的貯藏期PAL活力開始逐漸上升,第8天時CK組和SNP組較最低值分別上升了14.55%和14.42%。貯藏期間,SNP組的PAL活力始終極顯著高于對照組(P<0.01),說明SNP浸泡處理能夠很好地維持PAL活力。
扁豆是呼吸躍變型蔬菜,采后貯運過程中容易出現(xiàn)成熟衰老現(xiàn)象嚴重影響了扁豆的市場價值。目前已經有許多研究表明NO可以通過調控抗氧化酶活性來達到延緩果蔬成熟衰老的目的,從而改善采后品質、延長貨架期。本研究發(fā)現(xiàn),與CK相比,SNP處理顯著降低了腐爛率和銹斑率(圖1),對色澤和葉綠素含量(圖2)、硬度(圖3b)、TSS質量分數(shù)(圖4)都有較好的保持效果,這與范林林[15]、王云香[30]、Zhang Ruining[31]等的研究結果基本一致。腐爛和銹斑是豆類蔬菜最明顯的外觀劣變特征,其中銹斑的產生與PPO和POD密切相關。PPO和POD協(xié)同參與果蔬的酶促褐變反應,對扁豆莢面銹斑的產生有一定的影響,Zhang Ruining等[31]認為PPO和POD是與酚類代謝和水果褐變有關的重要酶,它們能夠催化水果中的酚類氧化并將其轉化為醌類,從而導致水果褐變,而NO可能抑制了PPO和POD的活性,這與本研究中PPO和POD活力(圖6A、B)的分析結果相符。PAL是一種與植物抗病相關的重要防御酶,PAL活性的增加可能會增強果蔬對病原體感染的抵抗力,這與延緩果蔬腐爛和衰老密切相關,同時PAL作為催化苯丙烷代謝第一步反應的酶,與酚類物質的合成密切相關[32]。而總酚和類黃酮作為果蔬中的非酶抗氧化成分,與果蔬的成熟衰老、組織褐變、抗逆性等密切相關,是酶促褐變的關鍵底物[6,33]。本研究中,SNP處理能顯著促進PAL活力(圖6E)和總酚、類黃酮(圖5)含量的增加,因此推測PAL活性的增強可以加速總酚、類黃酮等苯丙烷次生代謝產物產生,增強果實的抗逆性,進而抑制果實的褐變[34]。
有研究表明NO處理可以通過調節(jié)酶活性清除果蔬體內的活性氧(reactive oxygen species,ROS)來延緩其成熟衰老進程、抑制乙烯的生物合成[35]。CAT和APX是果蔬體內重要的抗氧化酶,可以參與ROS的代謝過程或者直接作為ROS清除劑,對果蔬的生理代謝起到調節(jié)的作用,從而達到延緩果蔬成熟衰老的目的。Zhao Yating等[28]采用NO處理延緩冬棗采后衰老,結果表明NO處理可通過維持較高水平的CAT和APX等相關ROS清除酶活性來提高ROS清除能力,從而抑制膜脂過氧化以及膜功能的喪失,最終延緩果實衰老過程,這與本實驗中SNP處理扁豆所得到的結果一致(圖6C、D)。細胞膜完整性和功能的喪失是脂質過氧化的結果,也是導致果實采后衰老的主要因素,而衰老應激下的結構和功能障礙及ROS過度積累與MDA有關[28,36]。脂質過氧化反應會產生MDA,而MDA的積累又會促進這一進程,從而破壞膜的正常功能,Shabanian等[37]研究SNP處理菊花得到了類似的結果。此外,因為細胞膜結構的破壞會導致PPO和POD更容易氧化處于液泡中的酚類物質,因此推測,MDA含量的變化與果實褐變和果實硬度也有一定的關聯(lián)[34]。本研究中,SNP處理扁豆中MDA的積累受到抑制,這與前人的研究結果相符合。
本實驗采用外源NO處理扁豆,結果發(fā)現(xiàn)外源NO處理可以有效抑制扁豆的腐爛和銹斑產生,對扁豆的色澤和葉綠素含量有較好的保持作用,一定程度上可以抑制MDA的積累從而保持豆莢的硬度,對TSS的降解有一定的抑制作用,經SNP處理的扁豆類黃酮和總酚的含量也相對較高,此外,SNP處理還抑制了POD和POD活性,對PAL、CAT和APX活性則起到提升作用(圖7)。綜上,0.2 mmol/L SNP處理10 min可以有效延緩扁豆的成熟衰老,延長其貨架期。
圖7 外源NO影響扁豆采后生理特性的總結Fig.7 Summary diagram of effects of exogenous NO on postharvest physiological characteristics of hyacinth bean