國 鴿，劉春蕾

中國人民解放軍總醫(yī)院 醫(yī)學創(chuàng)新研究部 轉化醫(yī)學研究中心，北京 100853

蛋白質磷酸化的發(fā)現(xiàn)至今已有百年歷史,這種蛋白質的修飾形式能夠關鍵性的調節(jié)蛋白質的多種功能,例如控制細胞的增殖、分化及對外界刺激的反應。組氨酸的磷酸化由組氨酸激酶(histidine kinase)催化完成,其去磷酸化的過程由組氨酸磷酸酶(histidine phosphatase)介導。1962年首次在牛線粒體中發(fā)現(xiàn)組氨酸磷酸酶,但直到2000年左右研究人員才重新重視起磷酸組氨酸的生物學功能。對磷酸組氨酸的文獻研究也逐漸從原核生物、真菌和植物過渡到哺乳動物的信號傳導過程。組氨酸磷酸酶參與調控多種生物學過程,其水平異常也會導致許多臨床疾病的發(fā)生。本文將分別從組氨酸磷酸酶的組成、組氨酸磷酸酶與臨床疾病的聯(lián)系,以及新建立的組氨酸磷酸酶活性檢測技術作一簡要綜述。

1 組氨酸磷酸酶

組氨酸磷酸酶共有3種, 分別是磷酸化磷酸組氨酸無機焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistid-ine inorganic pyrophosphate phosphatase, LHPP)、14 ku磷酸組氨酸磷酸酶(phosphohistidine phosphatase 1,PHPT1)和磷酸甘油酸變位酶家族5(phosphoglyce-rate mutase family 5, PGAM5)。LHPP主要在大腦、腎臟和肝臟中表達,其特異性底物尚未確定[1];PHPT1是一種胞質蛋白,主要在心臟和骨骼肌中的表達量高,其磷酸酶底物包括四聚體鈣激活鉀通道(Ca2+-activated K channels, KCa3.1)、新型Ca通道(transient receptor potential vanilloid 5,TRPV5)、ATP-檸檬酸裂解酶(ATPcitrate lyase, ACL)、鳥嘌呤核苷酸的調節(jié)蛋白β-亞單位(β-subunit of heterotrimeric G protein, Gβ);PGAM5是一種線粒體膜蛋白磷酸酶,定位于線粒體的內膜、外膜和細胞質中,其唯一底物是核苷二磷酸激酶B (nucleoside diphosphate kinase B,NDPK-B)。

2 組氨酸磷酸酶與疾病

組氨酸的磷酸化改變參與多種生物學過程調控。組氨酸磷酸酶的表達或活性異常會引發(fā)生物功能紊亂,進而引起相關的疾病。

2.1 組氨酸磷酸酶與腫瘤

LHPP是一種腫瘤抑制因子,其表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。宮頸癌是常見的直接影響女性健康的惡性腫瘤[2],與相鄰正常組織相比,人宮頸癌腫瘤組織中LHPP表達顯著降低。LHPP高表達有助于降低宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。不僅是宮頸癌,在多種腫瘤疾病中,LHPP均可減緩癌細胞的轉移和侵襲。胰腺癌是最常見的胰腺腫瘤,惡性程度極高。在胰腺癌中,LHPP能夠抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲并增加細胞凋亡,LHPP表達下調具有致癌作用[4]。肝癌的發(fā)病率和病死率都很高。在肝癌中,LHPP高表達降低了腫瘤負荷,并同時降低肝臟損傷相關的血清學指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的表達。LHPP在腫瘤中的保護作用機制,主要涉及Akt, TGF-β等相關信號通路。LHPP通過抑制TGF-β/smad信號通路抑制肝內膽管癌的發(fā)生[5]。在膠質母細胞瘤中,LHPP通過下調Akt和Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮腫瘤抑制作用[6],并且LHPP的表達量與患者的中位生存期相關,LHPP高表達有助于改善膠質母細胞瘤患者的預后。在膀胱癌中,LHPP通過滅活的AKT/p65信號通路抑制膀胱癌細胞增殖[7]。

PHPT1對維持正常細胞穩(wěn)態(tài)起重要作用,它的表達失調與疾病的發(fā)生密切相關。PHPT1在肝癌細胞中表達量升高,利用特異性小干擾RNA抑制PHPT1后,部分抑制細胞的增殖。PHPT1對HepG2和SMMC7721細胞的刺激作用表明PHPT1基因可能是直接或間接控制細胞增殖的生長啟動子基因,這些基因的產(chǎn)物調控細胞的增殖和分化,從而促進腫瘤的發(fā)展,說明PHPT1在肝細胞癌中可能起到腫瘤啟動子的作用。PHPT1異常表達參與腫瘤細胞的運動和腫瘤的轉移。在肺癌細胞中,干擾PHPT1后抑制腫瘤的遷移和侵襲。PHPT1對腫瘤細胞運動的影響與細胞運動的一種重要結構細胞層狀偽足形成密切相關,通過調節(jié)肌動蛋白介導細胞骨架重排,從而影響肺癌細胞的遷移和侵襲[8]。另外,在腎透明細胞癌患者中,PHPT1高表達與腫瘤大小的增加及患者的預后不良相關[9]。

PGAM5是線粒體自由基線粒體降解的調節(jié)因子[10]。結直腸癌患者的PGAM5表達水平顯著降低[11],而活化PGAM5則可抑制結直腸癌細胞凋亡,進而抑制結直腸癌[12]。在前列腺癌患者中,PGAM5以復合物Bax-PGAM5-LDrp1的形式存在,通過增加癌細胞凋亡,抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PGAM5誘導細胞抑癌因子Bax激活和Drp1去磷酸化,若將PGAM5敲除后抑制Bax向線粒體的易位和降解,進而抑制前列腺癌細胞的凋亡。

2.2 組氨酸磷酸酶與代謝疾病

棕色脂肪細胞因含有大量線粒體,以產(chǎn)熱的形式消耗能量[13],是預防和治療肥胖癥的重要靶標,PHPT1參與調控棕色脂肪細胞的分化過程。在棕色細胞分化的早期PHPT1迅速降低并在后期恢復,PHPT1降低促進棕色脂肪細胞的分化,PHPT1增加抑制棕色脂肪細胞的分化。這一作用使其有望成為治療肥胖等相關代謝病的治療靶點[14]。另外,PGAM5可通過抑制解偶聯(lián)蛋白1的表達抑制棕色脂肪細胞的能量消耗[15]。PGAM5敲除會刺激脂質消耗,抑制棕色脂肪細胞中脂質積累。

組氨酸磷酸酶可促進脂肪細胞葡萄糖氧化,適當水平的組氨酸磷酸酶可維持血糖穩(wěn)定。胰島素是人體內唯一能降低血糖的激素,由胰島β細胞分泌。胰島β細胞的生物學調控在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。PHPT1 在正常胰島β細胞中有調節(jié)血糖的作用,胰島β細胞中PHPT1表達水平改變與血糖異常有關,Phpt1敲除小鼠表現(xiàn)出新生兒高胰島素血癥性低血糖。Phpt1敲除小鼠中,其激活瞬時受體電位通道受損,Ca2+內流減少,AMPK下游激活受損,使KATP通道到質膜的轉移受損,胰島β細胞中KATP通道缺陷誘導小鼠新生兒低血糖。與PHPT1作用不同,Pgam5敲除小鼠對嚴重的代謝性疾病具有抵抗性,抑制PGAM5能夠改善糖尿病損傷[16]。

2.3 組氨酸磷酸酶與心臟疾病

組氨酸激酶NDPK-B與組氨酸磷酸酶PHPT1共同調節(jié)組蛋白磷酸化,是一種類似蹺蹺板的動態(tài)過程,與調節(jié)心肌收縮力相關。NDPK-B /PHPT1能夠調節(jié)底物KCa3.1、TRPV5、Gβ相關組氨酸殘基(His)的磷酸化和去磷酸化,磷酸化組氨酸通過影響心肌細胞中cAMP的形成,參與心臟收縮力的調節(jié)。在新生大鼠心肌細胞中穩(wěn)定過表達NDPK-B可以使Gαs-腺苷酰環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)依賴性激活增強,進而增加心肌細胞的收縮力。另外,NDPK-B/Gβγ復合物通過His266處G蛋白亞基磷酸化,使G蛋白受體非依賴性激活,對胚胎早期心臟收縮力的形成至關重要。心力衰竭時心肌細胞中發(fā)生復雜的重塑過程,G蛋白信號傳導的變化是這種重塑過程的標志。心力衰竭中NDPK-B /PHPT1調節(jié)異常,使Gα介導的AC活化降低,cAMP信號傳導的改變導致關鍵心臟Ca2+處理蛋白的磷酸化減少,是心衰疾病中心室收縮性降低的重要原因。另外,PHPT1能夠將KCa3.1通道中His358位點去磷酸化[17]。KCa3.1通道中His358的磷酸化對血管平滑肌細胞增殖至關重要。血管平滑肌細胞增殖是動脈粥樣硬化和血管再生的重要標志。因此,通過激活PHPT1抑制KCa3.1,可能在血管增生性疾病中提供有意義的臨床效果[18]。此外,PHPT1還與調節(jié)心律失常相關,在心律失常性右心室心肌病患者中發(fā)現(xiàn)NDPK-B和KCa3.1通道表達上調,細胞自律性增加,心律失常發(fā)生率增加。重組NDPK-B心肌干細胞可增強 KCa3.1通道電流、細胞自律性和心律失常的發(fā)生,PHPT1阻止了NDPK-B的效應,單獨使用PHPT1能夠減少心律失常疾病的發(fā)生[19]。

此外,LHPP與嚴重抑郁障礙、酒精依賴和危險行為有關[20]。PGAM5是實驗性肺纖維化中線粒體功能障礙的關鍵驅動因素,在肺纖維化形成過程中起重要作用[21]。在神經(jīng)退行性疾病帕金森病模型中,STAT5-PGAM5-Drp1信號傳導破壞,導致線粒體受損、ATP 產(chǎn)生不足和過度氧化應激積聚。STAT5- PGAM5- LDrp1復合物激活神經(jīng)元中的線粒體裂變以穩(wěn)定線粒體平臺,是構成神經(jīng)保護的重要機制[22]。PGAM5還可通過調節(jié)線粒體動力學來調節(jié)細胞衰老[23]。

3 組氨酸磷酸酶活性相關的檢測新技術

磷酸化組氨酸在相對溫和條件下不穩(wěn)定性,而且缺乏特異性抗體和保存、檢測方法導致對組氨酸磷酸化酶的研究嚴重滯后。近年來,隨著相應的檢測技術逐漸增多,對組氨酸磷酸酶研究的越來越多。目前新建立的檢測磷酸酶活性的技術主要包括:1)利用小分子底物來監(jiān)測體外磷酸酶的活性。小分子底物常被用來監(jiān)測體外磷酸酶的活性。雖然不能像磷酸化組氨酸的蛋白質或者多肽那樣代表組氨酸磷酸酶的生物底物,但它們能夠提供更簡便和靈敏的方法。6,8-二氟-4-甲基傘形基磷酸酯(6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate,DiFMUP)是一種磷酸酪氨酸模擬分子,其熒光在磷酸化后會淬滅。去磷酸化后,DiFMUP變?yōu)閺姛晒狻Ｒ虼?DiFMUP可作為監(jiān)測組氨酸磷酸酶活性的底物,用于測定組氨酸磷酸酶的活性。2)設計熒光探針用于檢測組氨酸磷酸酶。最新發(fā)現(xiàn)設計合成熒光探針可用于檢測組氨酸磷酸酶的活性。Sox-H4P探針的合成方法為Sox修飾后獲得Sox-H4修飾肽,將Sox-H4與合成氨基磷酸鉀在pH8的磷酸緩沖液中共孵育獲得Sox-H4P。隨后通過HPLC純化,LCox-MS/MS分析驗證Sox和磷酸化組氨酸的有效性。利用這個探針,可連續(xù)測量細胞裂解物中組氨酸磷酸酶活性,探針對PHPT1表現(xiàn)出極好的敏感性和特異性。此方法較過去更靈敏,可以更方便的獲得組氨酸磷酸酶朝向磷酸化組氨酸底物的動力學參數(shù)[24]。另外,正在開發(fā)新的方法用來探測組氨酸磷酸化蛋白質組并確定其功能結果,包括負離子模式質譜分析和非天然氨基酸摻入等。這些新的工具和策略有可能克服細胞生物學中對磷酸化組氨酸理解的阻礙。

4 問題與展望

組氨酸磷酸化在疾病中的作用已逐漸得到重視。組氨酸磷酸酶的異常表達在腫瘤、代謝性疾病中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用。一方面,可作為疾病診斷的指標,對臨床疾病的預防和診斷起到提示作用。另一方面,可為相關疾病干預提供新思路。由于影響疾病發(fā)生發(fā)展的因素眾多,未來研究還需要聚焦組氨酸磷酸化與臨床疾病的關聯(lián),特別是明確其中關鍵的通路和靶點,以利于更好的靶點治療,開發(fā)相關酶與蛋白的抑制劑或激動劑以更好的為臨床轉化服務。同時,還要積極研究未知的組氨酸磷酸酶、創(chuàng)新相關檢測技術,開發(fā)更為快捷的磷酸酶活性檢測技術。相信隨著對組氨酸磷酸酶開展研究的增加,對組氨酸磷酸酶作用機制的進一步探索,對組氨酸磷酸酶檢測技術的更新,組氨酸磷酸酶在將來的一系列醫(yī)學未知領域中將會有新的應用前景。