于金慧，劉炳福，劉超，3，馬德源，4，馬云飛，陳高，韓福文，尤升波，畢玉平，3

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃河三角洲現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，山東 東營 257300；5.濟(jì)寧市糧食和物資儲備保障中心，山東 濟(jì)寧 272000)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)屬薔薇科草莓屬漿果類多年生草本植物，富含維生素、蘋果酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)及多酚、黃酮、花青素等生物活性成分，因其果肉香氣濃郁、風(fēng)味獨特而備受消費者青睞。 我國已成為世界草莓生產(chǎn)和消費第一大國[1]。 據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)顯示:2011—2020年期間，我國草莓種植面積及產(chǎn)量整體均呈上升趨勢，種植面積由7.81 萬公頃增至13.16 萬公頃，產(chǎn)量由200.9 萬噸增至344.9 萬噸。 我國草莓表觀需求量由2014 年的248.5 萬噸增至2020 年的344.3 萬噸，年復(fù)合增長率為5.6%。 2020 年出口量達(dá)5 815.6 噸，出口金額為1 531.0 萬美元。 由此可見，草莓具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，大力發(fā)展草莓種植業(yè)是“農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收”的有效途徑之一。

隨著人們生活水平的不斷提高，消費者的食品質(zhì)量安全意識逐步增強(qiáng)。 然而，在主要追求產(chǎn)量的目標(biāo)下，化肥、農(nóng)藥過度使用導(dǎo)致土壤養(yǎng)分不平衡、產(chǎn)品品質(zhì)下降的問題普遍存在，嚴(yán)重制約著草莓種植業(yè)的有序、良性發(fā)展。 海藻肥和微生物菌肥是應(yīng)用較廣且具有多重優(yōu)勢的生物肥料，可調(diào)節(jié)土壤微生物群落、提升土壤肥力、提高植株抗逆力及改善產(chǎn)品品質(zhì)等[2-5]。 研究表明，由海藻與酵母菌提取物制備的生物刺激劑可顯著提高番茄果實大小和產(chǎn)量并改善其品質(zhì)[6]，海藻肥與微生物菌劑聯(lián)用可替代10%～30%的化肥[7]，而EM菌發(fā)酵的海藻肥可顯著提高水稻的株高和分蘗數(shù)[8]，可見二者聯(lián)合具有很好的應(yīng)用潛力。 然而，目前尚未見益生菌與海藻多糖聯(lián)合應(yīng)用于草莓肥效的研究報道，關(guān)于二者聯(lián)用對草莓生長及果實品質(zhì)的影響還未可知。 基于以上問題，本研究以實驗室分離篩選的功能乳酸菌為主，分別制備益生菌發(fā)酵液和海藻多糖發(fā)酵液，比較海藻多糖、益生菌發(fā)酵液、益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖及海藻多糖發(fā)酵液對草莓植株生長、葉片生理特性和果實營養(yǎng)活性成分等指標(biāo)的影響，并對處理后的土壤微生物多樣性進(jìn)行初步分析，以期為研發(fā)提升草莓綜合品質(zhì)的新型生物肥料提供技術(shù)支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試乳酸菌為本實驗室自行分離的菌種，包括植物乳桿菌DY-1(Lactiplantibacillus plantarumDY-1)、嗜酸乳桿菌KDB-03(Lactibacillus acidophilusKDB-03)、發(fā)酵乳桿菌KDB-08(Limosilactobacillus fermentum KDB-08)。 海藻多糖購自青島海大生物集團(tuán)有限公司，純度為45%。 供試草莓品種為天仙醉和越秀。

1.1.1 培養(yǎng)基的制備 MRS 培養(yǎng)基:牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蛋白胨10.0 g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉18.0 g，蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨2.0 g、酵母粉2.0 g、紅糖60.0 g(海藻多糖250.0 g)，蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌鍋115℃滅菌20 min。

1.1.2 益生菌發(fā)酵液的制備 將-80℃保藏的乳酸菌在MRS 平板上劃線，35℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落繼代培養(yǎng)2 次后，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，作為種子液。 在含和不含海藻多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種以上乳酸菌種子液，接種密度為1%，置于35℃發(fā)酵箱中發(fā)酵24 h 后備用。 發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量＞108CFU/mL。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2021 年11 月中旬至2022 年2 月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽基地(36°58′34″N，116°59′01″E)溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。 栽培草莓土壤為基質(zhì)土＋當(dāng)?shù)剞r(nóng)田土，試驗期間供試大棚內(nèi)草莓統(tǒng)一肥水管理。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置5 個施肥處理(表1)，分別為清水對照(A)、海藻多糖(B)、益生菌發(fā)酵液(C)、海藻多糖＋益生菌發(fā)酵液復(fù)配(D)和海藻多糖發(fā)酵液(E)。 重復(fù)5 次，每重復(fù)10 株。 采用澆灌方式施肥，約兩周沖施一次。 試驗周期自11 月中旬至次年2 月上旬，各處理澆灌量按照每公頃15 kg 計算實際用量。

表1 試驗施肥處理方式

1.3 樣品采集

于草莓盛果期(2 月上旬)采集草莓植株及其果實、葉片樣品，每重復(fù)隨機(jī)選取5 棵植株混合采樣。 果實樣品隨機(jī)采集，每重復(fù)10 顆。 葉片樣品采集從植株內(nèi)向外數(shù)第3 ～5 片展開葉，每重復(fù)6片。 樣品采集后快速放入低溫保存盒并帶回實驗室，果實稱重后液氮速凍；葉片分別用自來水和去離子水清洗6 次，用紙巾拭干后液氮速凍；速凍后的樣品置于-20℃冰箱并盡快測定相關(guān)指標(biāo)。 土壤樣品采自于不同處理組的植株周邊距地表5 cm 以下土層，多點均勻采集，去除殘葉、石子等，快速放入低溫保存盒并帶回實驗室后直接寄送至青島擎科生物技術(shù)有限公司。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 植株生長性狀指標(biāo) 草莓植株葉片、株高、根莖、冠徑(南北、東西)、葉片長寬、花萼直徑、果重等指標(biāo)以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。

1.4.2 植株葉片生理指標(biāo) 葉片葉綠素含量參考文獻(xiàn)[9]、丙二醛含量參考文獻(xiàn)[10]的方法測定。

1.4.3 果實品質(zhì)指標(biāo) 可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定[11]，可溶性固形物含量參考NYT2637—2014 的方法測定，可滴定酸含量參考GB 5009.239—2016 中的酚酞指示劑法測定。 糖酸比為可溶性固形物與可滴定酸的比值。 VC 含量參考GB 5009.86—2016 中抗壞血酸檢測的方法測定，總花青素含量采用pH 示差法測定[12]，總酚含量采用Folin-Ciocalteu 法測定，總黃酮含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[13]測定。

1.4.4 土壤微生物多樣性分析 提取天仙醉草莓土壤DNA 并建庫，在IlluminaHiSeq 平臺測序，使用Trimmomatic 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，然后使用Cutadapt 進(jìn)行引物序列的識別與去除，其后使用USEARCH 對雙端reads 進(jìn)行拼接并去除嵌合體，最終得到高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析。 使用USEARCH 在相似性97%水平上對序列進(jìn)行聚類，以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTUs。 利用Mothur 進(jìn)行Alpha 指數(shù)分析，基于R語言平臺進(jìn)行Beta 多樣性分析。 組間的物種豐度數(shù)據(jù)采用Metastats 分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，其中植株表型數(shù)據(jù)各處理8～10 個，其他數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)。采用Microsoft Excel 2019 整理數(shù)據(jù)及繪圖，采用SPSS Statistics 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。 不同處理間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan’s 法(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對草莓植株生長及果實表型的影響

試驗結(jié)果表明，施肥前期兩品種草莓不同處理間的表型指標(biāo)相當(dāng)。 從生長狀態(tài)來看，施肥期間表現(xiàn)出較好的生長態(tài)勢，進(jìn)入盛果期后，部分生長指標(biāo)略有下降。 施肥末期，各施肥處理的葉片數(shù)(管理期間會定期打掉外周狀態(tài)不好的葉片)、根徑、冠幅、葉片大小等總體上較對照有明顯提升(表2)。

表2 施肥末期草莓植株生長表型

不同施肥處理對草莓果實表型有明顯影響(圖1A、B)。 由圖1C、D 可以看出，兩品種的單果重對各施肥處理的響應(yīng)有顯著差異，其中天仙醉以海藻多糖發(fā)酵液處理效果最佳，較對照提高57.2%；而越秀以益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖處理效果最佳，較對照提高40.3%。 兩品種單純海藻多糖處理的單果重與對照均無顯著差異。

圖1 不同施肥處理下兩品種草莓果實形態(tài)及單果重

2.2 不同施肥處理對草莓植株葉片生理指標(biāo)的影響

由圖2 可以看出，與對照相比，施肥后兩品種葉片丙二醛含量均有不同程度降低，而葉綠素含量則均有不同程度增加，說明不同施肥處理均可增強(qiáng)植株的抗氧化水平，且能促進(jìn)植株生長。 但是，不同品種葉片中的丙二醛和葉綠素含量對各處理的響應(yīng)略有不同，其中天仙醉以海藻多糖發(fā)酵液處理的葉片丙二醛含量最低，越秀以益生菌發(fā)酵液處理的最低，均顯著低于對照，降幅分別為51.04%和39.75%。 天仙醉各處理的葉綠素含量均顯著高于對照，而越秀各處理的葉綠素含量較對照雖有增加但差異均不顯著。

圖2 不同施肥處理下兩品種草莓葉片丙二醛和葉綠素含量

2.3 不同施肥處理對草莓果實營養(yǎng)功能成分的影響

不同施肥處理均可提高草莓果實中可溶性蛋白含量(圖3A)，其中益生菌發(fā)酵液和海藻多糖發(fā)酵液處理可顯著提高天仙醉果實的可溶性蛋白含量，分別較對照提高72.9%和88.4%，而越秀各處理果實中可溶性蛋白含量差異不顯著，但顯著高于天仙醉(益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖處理除外)。 對天仙醉而言，益生菌發(fā)酵液處理可滴定酸含量最高，各施肥處理均顯著提高其可溶性固形物含量，糖酸比則以益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖最高，較對照顯著提高27.6%；對越秀而言，各施肥處理顯著降低可滴定酸含量，對可溶性固形物含量影響不顯著，但提高糖酸比值，其中益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖增幅最高，達(dá)71.9%(圖3B～D)。

圖3 不同施肥處理兩品種草莓營養(yǎng)成分含量

從表3 看出，不同施肥處理對天仙醉活性成分含量影響較大，其中海藻多糖顯著增加果實中花青素和總黃酮含量，較對照分別提高9.94%和18.32%；益生菌發(fā)酵液顯著增加果實中VC、花青素和總黃酮的含量，較對照分別提高13.95%、36.56%和21.17%；益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖顯著增加果實中VC、總酚和總黃酮含量，較對照分別提高21.57%、15.02%和23.70%；而海藻多糖發(fā)酵液僅顯著提高果實VC 含量，且花青素和總黃酮含量顯著降低。 相對而言，越秀果實中的活性成分含量多數(shù)顯著高于天仙醉，且各施肥處理對其影響大多不顯著。

表3 不同施肥處理草莓果實中活性成分含量 (mg/kgFW)

2.4 不同施肥處理對草莓種植土壤微生物多樣性的影響

從以上指標(biāo)來看，不同草莓品種對施肥處理的響應(yīng)差異較大，其中天仙醉的施肥效果較佳。因此，對天仙醉不同施肥處理的土壤微生物多樣性進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確其發(fā)揮作用的相關(guān)機(jī)理。由圖4A、B 可見，不同處理之間微生物組成有明顯差異。 5 個樣本共檢測出2 013 個OTUs，不同組間共有44 個OTUs，特有數(shù)量各異(圖4C)，經(jīng)統(tǒng)計分屬32 個門，75 個綱，190 個目，331 個科和557 個屬。從微生物所在目水平看，對照組和海藻多糖組的物種豐度相對較低，而含有益生菌的3 個處理組相對較高(圖4D)。 含益生菌的施肥處理均可顯著增加土壤微生物Shanpon 指數(shù)(圖5A)、Simpson 指數(shù)(圖5B)、Chao1 指數(shù)(圖5C)和PDwhole-tree 指數(shù)(圖5D)。 其中，益生菌發(fā)酵液組及益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖組對土壤微生物α多樣性的改善效果最佳，海藻多糖發(fā)酵液組次之。

圖4 不同施肥處理下草莓土壤的微生物多樣性分析

圖5 不同施肥處理下土壤Alpha 多樣性指數(shù)

3 討論

微生物菌劑和海藻肥具有種類繁多、施用方式多樣化等特點[14，15]，二者在改良土壤、促進(jìn)作物生長發(fā)育、增強(qiáng)植株抗逆性、改善產(chǎn)品品質(zhì)等方面的作用已被得到廣泛認(rèn)可。 盡管部分海藻肥生產(chǎn)過程中需要褐藻膠降解菌的參與，且部分產(chǎn)品復(fù)配了微生物菌劑，然而鑒于二者各自的特點，微生物菌劑與海藻肥聯(lián)合使用的方式、功效等仍是綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中亟待解決的問題。 本研究選用的菌劑為實驗室自行分離的功能菌株發(fā)酵液和提取自滸苔的海藻多糖(純度45%)，聯(lián)合方式包括復(fù)配和直接發(fā)酵。 試驗結(jié)果表明，不同施肥處理均可在一定程度上提高單果重，這與前人研究結(jié)果一致[16，17]。 其中天仙醉以海藻多糖發(fā)酵液處理最佳，而越秀以二者復(fù)配效果最佳。 本研究中單用海藻多糖效果不佳，可能與施用濃度及方式等因素有關(guān)[14]，還需在生產(chǎn)實踐中進(jìn)一步摸索最佳施用方式。

海藻肥富含多糖、多酚等活性物質(zhì)以及有機(jī)質(zhì)、大量和微量元素，可激活土壤中各類有益菌，改善土壤微生物結(jié)構(gòu)和多樣性，間接影響植株對營養(yǎng)成分的攝取；所含的生長素、細(xì)胞分裂素、甜菜堿等生長調(diào)節(jié)物質(zhì)能直接調(diào)控植株生理狀態(tài)[14]。 微生物菌劑中的各種微生物還可以改善植物根際土壤性質(zhì)，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量和根際有益微生物數(shù)量，這些根際微生物通過固定氮元素、溶解磷元素、分泌抗生素與植物激素等物質(zhì)而發(fā)揮積極作用[3]。 此外發(fā)酵液本身也富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸及抑菌物質(zhì)和酶類[18]，均利于植株生長發(fā)育。 丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，能夠反映植株抗氧化潛力，而葉綠素主要負(fù)責(zé)光能的捕獲、吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，葉綠素含量降低不利于葉綠體發(fā)育，可導(dǎo)致葉色發(fā)黃、光合效率降低、生長遲緩等。 本研究結(jié)果表明，海藻多糖和益生菌發(fā)酵液均可不同程度地促進(jìn)植株生長，降低葉片中丙二醛含量，提高葉綠素含量，這與前人研究結(jié)果一致[2]。 兩品種均以益生菌發(fā)酵液處理效果最佳，海藻多糖及其與益生菌不同形式聯(lián)合處理效果相當(dāng)。 然而，益生菌及二者復(fù)配處理組的土壤微生物多樣性改善情況顯著優(yōu)于海藻多糖。 可見，微生物多樣性的改善僅是不同施肥處理發(fā)揮作用的原因之一，可能還涉及其他相關(guān)機(jī)制。

果實品質(zhì)作為主要經(jīng)濟(jì)性狀之一，當(dāng)前在人們對品質(zhì)要求越來越高的情況下其重要性更加突出，尤其是內(nèi)在品質(zhì)。 草莓的內(nèi)在品質(zhì)不僅局限于蛋白質(zhì)、糖、酸含量及糖酸比等，還包括酚類、黃酮等生物活性成分[19，20]。 姜潔等[16]的研究表明，海藻肥可顯著增加草莓中的可溶性固形物、總糖、總酸含量，提高糖酸比，但是對抗壞血酸、總酚等抗氧化物質(zhì)的影響較小。 Rahman 等[21]的研究表明，益生菌菌劑可有效提高果實中酚類、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素含量。 本研究中，不同施肥處理明顯提高兩種草莓的可溶性蛋白含量和糖酸比值，顯著降低越秀的可滴定酸含量，其中益生菌發(fā)酵液提高可溶性蛋白的效果最佳，而益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖則更有利于增加糖酸比值。 與越秀相比，天仙醉的VC、花青素和總黃酮含量較低，但是對不同施肥處理的響應(yīng)較強(qiáng)，其中以益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖處理提升幅度最高，說明即便是同種作物但不同品種之間對肥料養(yǎng)分的需求和響應(yīng)也存在差異。 這與前人的研究結(jié)果一致[22]，但是因品種差異導(dǎo)致的內(nèi)在響應(yīng)機(jī)制較為復(fù)雜，還需通過后續(xù)研究進(jìn)一步明確。

此外，微生物發(fā)酵過程涉及生物轉(zhuǎn)化[23]，海藻發(fā)酵后的營養(yǎng)和活性物質(zhì)會發(fā)生顯著變化[24]。Prasedya 等[8]的研究表明，EM 菌發(fā)酵海藻肥可顯著改善土壤微生物多樣性，提高水稻株高和分蘗數(shù)，但是未對籽實品質(zhì)進(jìn)行評價。 Mannino 等[6]研究采用的是海藻與酵母菌提取物制備的商業(yè)化生物刺激劑，該制劑可顯著改善番茄果實品質(zhì)。本研究對比分析了益生菌發(fā)酵液復(fù)配海藻多糖和海藻多糖直接發(fā)酵兩種方式，從植株生長、單果重、葉片生理和果實營養(yǎng)等指標(biāo)來看，兩種方式均表現(xiàn)良好，但是直接發(fā)酵型肥料顯著降低天仙醉的花青素、總酚和總黃酮含量，推測這可能與海藻多糖經(jīng)益生菌發(fā)酵后形成的物質(zhì)參與果實次生代謝活動所致，但是海藻多糖發(fā)酵后具體成分的變化情況及影響果實次生代謝的作用機(jī)制也需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

益生菌發(fā)酵液及其與海藻多糖聯(lián)合施用對提高草莓綜合品質(zhì)具有協(xié)同增效作用，尤其是對天仙醉而言，不僅促進(jìn)植株生長、顯著改善果實品相，還顯著提高果實營養(yǎng)和活性成分含量，這可能與土壤微生物結(jié)構(gòu)的改善有關(guān)。 考慮到草莓品種的差異及肥料的最佳作用濃度、劑量和施用方式，還需通過后續(xù)試驗進(jìn)一步相關(guān)數(shù)據(jù)優(yōu)化以期研發(fā)效果最佳的新型生物肥及提供更加科學(xué)的施肥方案。 此外，益生菌發(fā)酵液及其與海藻多糖協(xié)同作用機(jī)制也有待于進(jìn)一步深入探究。