陳華璋，鄭蘋(píng)，田旭，汪漢成，向立剛，李文紅

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550081；3.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434000；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

昆蟲(chóng)體內(nèi)微生物與其生命活動(dòng)密切相關(guān)，影響昆蟲(chóng)的交配[1]、對(duì)寄主植物的選擇[2]、昆蟲(chóng)壽命[3]以及對(duì)病原菌的抵抗力[4]等。 小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]是危害十字花科作物最為嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，常導(dǎo)致甘藍(lán)、西蘭花、芥菜、油菜、蘿卜和花菜等多種重要蔬菜嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。腸道是其重要的生命器官，棲息著大量的微生物，其中細(xì)菌的豐富度和多樣性較高。 目前，已報(bào)道的小菜蛾腸道細(xì)菌有蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、肉桿菌(Carnobacterium maltaromaticum)等[6-8]。 這些腸道細(xì)菌對(duì)食物的消化、宿主的生長(zhǎng)發(fā)育與環(huán)境適應(yīng)性均起著積極作用[6，8]。 相較而言，有關(guān)小菜蛾腸道真菌群落的研究較少。

當(dāng)前，化學(xué)方法是防控小菜蛾最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。 溴氰蟲(chóng)酰胺為雙酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，以昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體為靶標(biāo)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)限制釋放鈣離子，使其肌肉麻痹、癱瘓、停止取食，最終死亡[9，10]。 該藥劑自2012 年上市以來(lái)便被廣泛應(yīng)用于小菜蛾的防治，且效果良好[11]。 殺蟲(chóng)劑在發(fā)揮其作用的同時(shí)也影響著昆蟲(chóng)腸道微生物的組成和生理代謝活動(dòng)[12，13]；同時(shí)部分腸道微生物也影響著宿主對(duì)包括農(nóng)藥在內(nèi)的有害物質(zhì)的降解[14]、抗藥性的產(chǎn)生[15]以及抵御病原微生物的入侵[16]等。 前期研究發(fā)現(xiàn)溴氰蟲(chóng)酰胺浸葉飼喂小菜蛾，其腸道厚壁菌門(mén)和腸球菌屬相對(duì)豐度均顯著降低，而藍(lán)細(xì)菌門(mén)和血桿菌屬相對(duì)豐度均顯著增加，同時(shí)小菜蛾腸道細(xì)菌群落多樣性、均勻度和豐富度整體呈增加趨勢(shì)，且多樣性和豐富度增幅顯著(待發(fā)表)。 但該藥劑是否對(duì)小菜蛾腸道真菌群落結(jié)構(gòu)存在影響尚不清楚。 微生物純培養(yǎng)方法為傳統(tǒng)研究技術(shù)，能順利獲得后續(xù)研究的微生物菌株材料[17]，高通量測(cè)序技術(shù)雖不能獲得活的菌株材料，但能夠較為全面了解腸道微生物菌群組成與多樣性特征[18]。 將兩種技術(shù)相結(jié)合用于小菜蛾腸道真菌的研究可以更全面地了解小菜蛾腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性特征，從而深入探尋溴氰蟲(chóng)酰胺浸葉飼喂處理對(duì)其腸道真菌群落的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小菜蛾為溴氰蟲(chóng)酰胺敏感品系，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所昆蟲(chóng)研究室長(zhǎng)期室內(nèi)飼養(yǎng)。 97%溴氰蟲(chóng)酰胺(cyantraniliprole)原藥由美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)。 PDA 培養(yǎng)基(HB0233-12，青島海博生物技術(shù)有限公司)，DNA 提取試劑盒(DP307，TIANGEN)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法的小菜蛾腸道真菌群落研究 前期研究發(fā)現(xiàn)溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)小菜蛾的半致死濃度(LC50)為0.143 mg/L。 本研究用含0.1% Triton X-100(T8200，Solarbio)的無(wú)菌水配制1 mg/L 溴氰蟲(chóng)酰胺藥液，浸泡新鮮甘藍(lán)葉片30 s后取出晾干至表面無(wú)水痕，放入小菜蛾飼養(yǎng)盒中，并接入生長(zhǎng)一致的3 齡小菜蛾幼蟲(chóng)，以相同體積的含0.1% Triton X-100 無(wú)菌水處理甘藍(lán)葉片飼喂的小菜蛾幼蟲(chóng)作為對(duì)照。 12 h 后，從對(duì)照組和溴氰蟲(chóng)酰胺處理組中分別隨機(jī)挑選健康且大小一致的小菜蛾幼蟲(chóng)100 頭，饑餓4 h 后置于75%乙醇中體表消毒90 s，再用0.8%生理鹽水沖洗3 次，最后在超凈工作臺(tái)上解剖挑取腸道。 腸道組織放入2 mL 無(wú)菌離心管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向離心管中加入1 mL PBS 緩沖液(P1022，Solarbio)后使用組織研磨器進(jìn)行充分研磨，隨后用PBS 緩沖液將研磨液分別稀釋成10-1、10-2、10-3。 分別取50 μL 上述不同濃度稀釋液均勻涂布于含1%硫酸鏈霉素(S8290，Solarbio)和氨芐青霉素鈉(A8180，Solarbio)的PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3 次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d。 期間每天觀(guān)察培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況，一旦有新菌落出現(xiàn)，便從菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。 對(duì)純化后的菌株進(jìn)行編號(hào)，并接種于PDA 斜面培養(yǎng)基上，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

使用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取純化菌株的DNA，基因組經(jīng)稀釋后，以ITS1/ITS4 為引物擴(kuò)增其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS 區(qū)，PCR 反應(yīng)條件及體系參考吳燕燕等[17]的方法。 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn 比對(duì)分析。

1.2.2 基于高通量測(cè)序技術(shù)的小菜蛾腸道真菌群落研究 按1.2.1 方法處理小菜蛾，對(duì)照組和溴氰蟲(chóng)酰胺處理組分別隨機(jī)挑選小菜蛾幼蟲(chóng)200頭，收集腸道組織。 采用土壤基因組DNA 提取試劑盒(DP336，TIANGEN)提取小菜蛾幼蟲(chóng)腸道微生物總DNA，每樣品取100 頭幼蟲(chóng)腸道，每組重復(fù)2 次(對(duì)照組:SCK1、SCK2；溴氰蟲(chóng)酰胺處理組:SJY1、SJY2)。 隨后采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量與濃度。 以檢測(cè)合格的DNA 為模板，采用ITS1F 和ITS2 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與程序參考蘇日娜等[19]的方法。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送至北京諾禾致源生物科技有限公司，采用PacBio Sequel 平臺(tái)進(jìn)行三代擴(kuò)增子測(cè)序。

首先通過(guò)QIIME2(2019.4)軟件qiime cutadapt trim-paired 程序切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；DADA2 進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體；采用classify-sklearn 算法[20]將過(guò)濾后的序列與UNITE 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)皇褂胵iime feature-table rarefy 功能，對(duì)樣品中的序列進(jìn)行抽平，用于后續(xù)Alpha、Beta 多樣性分析等；運(yùn)用R 語(yǔ)言和ggplot2 包計(jì)算樣品微生物群落香 農(nóng)( Shannon)[21]、 辛 普 森( Simpson)[22]、Chao1[23]、測(cè)序深度指數(shù)(Observed species)、皮諾(Pielou)[24]和覆蓋度(Good’s coverage)[25]等Alpha 多樣性指數(shù)；通過(guò)R 語(yǔ)言、ape 包等基于Bray-Curtis距離[26]進(jìn)行Beta 多樣性分析及主坐標(biāo)分析(PCoA)；使用FunGuild 對(duì)真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)腸道可培養(yǎng)真菌的影響

由表1 可知，溴氰蟲(chóng)酰胺處理顯著增加了小菜蛾腸道可培養(yǎng)真菌種類(lèi)，但明顯降低了真菌總數(shù)。 對(duì)照組共獲得57 株真菌，溴氰蟲(chóng)酰胺處理組共獲得22 株真菌。 根據(jù)真菌的形態(tài)及分子鑒定，對(duì)照組的57 株真菌分別為青霉菌(Penicilliumsp.，42 株)和盾殼霉菌(Coniothyriumsp.，15 株)；溴氰蟲(chóng)酰胺處理組的22 株真菌分別屬于曲霉菌(Aspergillussp.，4 株)、青霉菌(Penicilliumsp.，8株)、盾殼霉菌(Coniothyriumsp.，6 株)和黃瓜織球殼菌(Plectosphaerella cucumerina，4 株)。

表1 小菜蛾腸道可培養(yǎng)真菌分類(lèi)及統(tǒng)計(jì)

2.2 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)小菜蛾腸道真菌群落的影響

2.2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU 聚類(lèi) Illumina NovaSeq測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)拼接和質(zhì)控處理之后，溴氰蟲(chóng)酰胺處理組2 個(gè)樣本共得到93 616 條高質(zhì)量序列，25 595 467 個(gè)堿基，序列平均長(zhǎng)度分別為266、280 bp，序列中GC 含量分別為50.48%、50.68%，測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的92.32%、86.13%和91.73%、85.23%。 對(duì)照組中2 個(gè)樣本共得到131 208 條高質(zhì)量序列，35 074 595 個(gè)堿基，序列平均長(zhǎng)度分別為277、259 bp，序列中GC含量分別為51.79%、51.81%，測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的93.55%、87.87%和95.17%、90.51%(表2)。

表2 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

在97%的相似度水平下對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，如表3 所示，溴氰蟲(chóng)酰胺處理組中2 個(gè)樣本共鑒定得出真菌10 門(mén)，33 綱，80 目，159 科，271 屬，380 種；對(duì)照組中2 個(gè)樣本共鑒定得出真菌10 門(mén)，35 綱，82 目，163 科，279 屬，397 種。

表3 各樣本真菌群落不同分類(lèi)水平下數(shù)目

2.2.2 ITS 序列測(cè)序深度分析 稀釋曲線(xiàn)(rarefaction curve)是描述組內(nèi)樣本多樣性的重要工具，可以直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本的物種豐富程度。 本試驗(yàn)中兩組共4 個(gè)樣品在測(cè)序數(shù)據(jù)為33 000 時(shí)曲線(xiàn)趨于平緩(圖1)，說(shuō)明此次測(cè)序數(shù)據(jù)深度已經(jīng)足夠，能夠反映樣品中大多數(shù)的真菌多樣性信息，進(jìn)一步測(cè)序?qū)π翺TU 的產(chǎn)生貢獻(xiàn)不大。 因此，本研究測(cè)序量能反映小菜蛾腸道真菌群落的組成情況。

圖1 OTU 水平稀釋曲線(xiàn)

2.2.3 小菜蛾腸道真菌群落組成 在門(mén)水平上溴氰蟲(chóng)酰胺處理組和對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)(Ascomycota)，其次是擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)；經(jīng)溴氰蟲(chóng)酰胺處理后的小菜蛾腸道上擔(dān)子菌門(mén)豐度顯著低于未處理組，其他真菌種類(lèi)無(wú)顯著性差異(圖2)。 溴氰蟲(chóng)酰胺處理組和對(duì)照組中相對(duì)豐度前10 的菌門(mén)分別是子囊菌門(mén)(80%/77%)、擔(dān)子菌門(mén)(4%/18%)、毛霉門(mén)(Mucoromycota，0.04%/0.27%)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota，0.25%/0.17%)、 羅 茲 菌 門(mén)(Rozellomycota，0.10%/0.06%)、油壺菌門(mén)(Olpidiomycota，0.05%/0.08%)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota，0.05%/0.04%)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota，0.03%/0.02%)、捕蟲(chóng)霉門(mén)(Zoopagomycota，＜0.01%)和Aphelidiomycota(＜0.01%)。

圖2 小菜蛾腸道真菌門(mén)水平群落組成

在屬水平上，平臍蠕孢屬(Bipolaris)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，其次為鐮刀菌屬(Fusarium)和散尾鬼筆屬(Lysurus)。 溴氰蟲(chóng)酰胺處理組和對(duì)照組相對(duì)豐度前10 的真菌屬中平臍蠕孢屬(66%/41%)、鐮刀菌屬(3.9%/18%)、散尾鬼筆屬(2.9%/16%)、枝孢屬(Cladosporium，0.6%/3.5%)、赤霉菌屬(Gibberella，0.5%/2.3%)、鏈格孢屬(Alternaria，0.8%/1.7%)、曲霉屬(Aspergillus，0.3%/0.9%)和Pseudopithomyces(0.1%/0.9%)為二者共有菌屬；Archaeorhizomyces和伊薩酵母屬(Issatchenkia)僅存在于溴氰蟲(chóng)酰胺處理組中，相對(duì)豐度分別為2.9%和0.5%，帚枝霉屬(Sarocladium)和畢赤酵母屬(Pichia)僅存在于對(duì)照組中，相對(duì)豐度分別為1.1%和0.7%(圖3)。

圖3 小菜蛾腸道屬水平真菌群落組成

2.2.4 小菜蛾腸道真菌群落Alpha 多樣性 由表4 可知，溴氰蟲(chóng)酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落的豐富度(Chao1、ACE 指數(shù))、測(cè)序深度指數(shù)(Observed species)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(PD wholetree)均增加，除PD whole tree 指數(shù)外，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，Simpson 指數(shù)和Good’s coverage指數(shù)均有所下降。 對(duì)照組中小菜蛾腸道真菌群落Shannon、Simpson 指數(shù)分別為3.9±0.2、0.82±0.04，Chao1、ACE 指數(shù)分為980±88、993±46，Observed species 指數(shù)為830±13，PD whole tree 指數(shù)為473±14，Good’s coverage 指數(shù)為0.995±0.001；溴氰蟲(chóng)酰胺處理組中小菜蛾腸道真菌群落Shannon、Simpson 指數(shù)分別為3.9±0.7、0.67±0.09，Chao1、ACE 指數(shù)分別為1 505±561、1 324±287，Observed species 指數(shù)為1 096±129，PD whole tree 指數(shù)為745±64，Good’s coverage 指數(shù)為0.993±0.003。

表4 真菌群落Alpha 多樣性指數(shù)

2.2.5 小菜蛾腸道真菌群落Beta 多樣性 PCoA主坐標(biāo)分析表明，對(duì)照組2 個(gè)樣品與溴氰蟲(chóng)酰胺處理組2 個(gè)樣品距離較遠(yuǎn)，真菌群落組成差異較大；對(duì)照兩樣品間距離較小，真菌組成差異較小，而溴氰蟲(chóng)酰胺處理組的SJY1 和SJY2 樣品之間距離較遠(yuǎn)，表明其真菌群落組成差異較大(圖4)。

圖4 基于Weighted Unifrac 距離PCoA 分析

2.2.6 小菜蛾腸道真菌FunGuild 功能預(yù)測(cè) 真菌FunGuild 功能預(yù)測(cè)(圖5)表明:溴氰蟲(chóng)酰胺處理組和對(duì)照組小菜蛾腸道真菌群落的主要功能包括植物病原菌(Plant Pathogen，67%/45%)、未指定的(Unassigned，17%/7%)、植物病原-土壤腐生微生物-木材腐生微生物(Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，4%/18%)、糞便腐生微生物-土壤腐生微生物(Dung Saprotroph-Soil Saprotroph，3%/16%)、未定義的腐生微生物(Undefined Saprotroph，3%/5%)、內(nèi)生植物病原(Endophyte-Plant Pathogen，0.6%/3.6%)、動(dòng)物病原-內(nèi)生菌-植物病原-木材腐生菌(Animal Pathogen-Endophyte - Plant Pathogen - Wood Saprotroph，0.8%/1.7%)。

圖5 FunGuild 功能注釋相對(duì)豐度柱形圖

3 討論與結(jié)論

腸道中真菌群落相比細(xì)菌群落所占比例較小，但其對(duì)于腸道菌群穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[27]。 本研究通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)從未經(jīng)溴氰蟲(chóng)酰胺處理的小菜蛾腸道中分離出了青霉屬和盾殼霉屬真菌，而從溴氰蟲(chóng)酰胺處理的小菜蛾腸道中還分離出了曲霉屬真菌和黃瓜織球殼菌。 江宇航等[28]從云南松毛蟲(chóng)腸道中也分離出了曲霉菌屬和青霉菌屬，但其分離到的根霉菌、鐮刀菌和念珠菌等本試驗(yàn)未獲得，而高通量測(cè)序結(jié)果表明小菜蛾腸道中存在相關(guān)菌屬，可能由于分離培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的差異未能分離出純菌株。 青霉菌作為常見(jiàn)的產(chǎn)纖維素酶菌株[29]，可幫助宿主更好地消化植物組織。 研究表明青霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬均可作為昆蟲(chóng)腸道共生真菌，為宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[30]。 黃瓜織球殼菌可導(dǎo)致甘藍(lán)[31]、土豆[32]、番茄[33]等作物發(fā)生萎蔫。 此次在小菜蛾腸道中檢測(cè)到黃瓜織球殼菌可能是因?yàn)槠渥鳛椴≡街诟仕{(lán)葉上，最后因取食進(jìn)入腸道。

高通量測(cè)序結(jié)果表明，平臍蠕孢屬、鐮刀菌屬、散尾鬼筆屬、枝孢屬、赤霉菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬和Pseudopithomyces為腸道中優(yōu)勢(shì)真菌屬。其中平臍蠕孢屬可引起玉米[34]、水稻[35]和狗尾草[36]等禾本科植物的葉斑病，但尚未有其導(dǎo)致甘藍(lán)感病的報(bào)道；鐮刀菌屬作為一種常見(jiàn)菌屬，可以是有益菌、病原菌以及中性菌；散尾鬼筆屬是可形成大型子實(shí)體的真菌；枝孢屬、赤霉菌屬和鏈格孢屬中均包含大量植物病原菌。 食物是腸道微生物的重要來(lái)源，因此小菜蛾腸道中包含了大量植物病原菌菌屬，雖然多數(shù)并非甘藍(lán)病原菌，但由于降雨和風(fēng)力等自然因素也會(huì)導(dǎo)致其它植物的病原菌散播到甘藍(lán)葉上，最終進(jìn)入到小菜蛾腸道中。 功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明小菜蛾腸道中真菌群落主要為植物病原菌，其次為土壤木材腐生微生物以及植物內(nèi)生菌，這也印證了小菜蛾腸道中的真菌多來(lái)自食物和土壤等。

溴氰蟲(chóng)酰胺處理后小菜蛾腸道平臍蠕孢屬的相對(duì)豐度顯著增加，鐮刀菌屬、散尾鬼筆屬相對(duì)豐度顯著降低。 物種群落方面，溴氰蟲(chóng)酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落豐富度指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)等均有不同程度的上升。 PCoA 的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，經(jīng)溴氰蟲(chóng)酰胺處理后不同小菜蛾腸道真菌群落樣本距離較遠(yuǎn)，物種組成差異較大。這可能是由于溴氰蟲(chóng)酰胺作用使得小菜蛾的防御機(jī)能降低，環(huán)境中的大量微生物群落進(jìn)入到了小菜蛾腸道中，相關(guān)假設(shè)將在后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究檢測(cè)了溴氰蟲(chóng)酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示溴氰蟲(chóng)酰胺處理后小菜蛾腸道真菌群落數(shù)量和多樣性均有不同程度的增加。 研究結(jié)果為小菜蛾腸道微生物功能的研究提供了借鑒，同時(shí)也為溴氰蟲(chóng)酰胺與小菜蛾的互作研究提供了參考。