許薇，陳振林，劉英健，勞琪珍，宋慕波

(1.賀州學院食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；2.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034)

三華李(Prunus salicinaLindl.cv.Sanhua)屬于薔薇科李亞科，是華南地區(qū)著名特色水果，原產(chǎn)自廣東翁源縣，后逐漸擴展至南方各省份[1，2]。三華李果實為圓形或近圓形，果肉紫紅色，肉質(zhì)爽脆，酸甜可口，營養(yǎng)價值高[3]。 三華李成熟果實中富含花青素，這是其重要特點[4]；有研究表明三華李中總花青素含量僅次于黑布李，花青素主要成分為矢車菊素[5]。 目前針對三華李果實花青素合成的相關(guān)研究較少。

花青素是植物中廣泛存在的一種水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，在新鮮的蔬菜和水果中大量存在，使其呈現(xiàn)出明亮的顏色，從而吸引消費者；同時，花青素類物質(zhì)也具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性功能[6-9]。 花青素的合成主要分3 個階段:第一階段是苯丙氨酸經(jīng)過多步反應(yīng)生成4-香豆酰CoA；第二階段是4-香豆酰CoA在系列酶的催化作用下生成黃酮類物質(zhì)(二氫槲皮素、二氫楊梅素)和黃酮醇；第三階段是二氫槲皮素、二氫楊梅素和黃酮醇這三類物質(zhì)在二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)的作用下生成無色的花青素(無色矢車菊素、無色天竺葵素和無色翠雀素)，然后花青素合成酶(ANS)將無色的花青素轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的花青素類物質(zhì)(矢車菊素、天竺葵素和翠雀素)，再經(jīng)過糖基化、?；⒓谆冗^程的修飾作用，最終形成穩(wěn)定可見的花青素[10]。 可見，ANS 是花青素生物合成途徑后期的關(guān)鍵酶，能催化無色花青素脫水氧化形成有色花青素。 編碼ANS 的基因首先在紫蘇中被克隆[11]，在多數(shù)植物中，ANS由一個小基因家族所編碼。 已有研究發(fā)現(xiàn)，在參薯[12]、紫色不結(jié)球白菜[13]、蘋果梨[14]和鳳丹牡丹[15]中ANS基因的表達與組織中花青素含量呈正相關(guān)。 然而，草莓果實從轉(zhuǎn)紅到完全成熟的過程中，雖然花青素含量呈上升趨勢，但ANS基因表達量卻有所下降[16]。 葡萄果實經(jīng)乙醇處理后花青素含量增加，但基因表達水平?jīng)]有變化[17]。 由此可見，花青素的生物合成存在復雜的調(diào)控機制。

三華李屬呼吸躍變型果實，后熟過程中花青素快速積累，但目前尚未有針對三華李花青素合成基因的系統(tǒng)研究。 雖然三月李的基因組測序工作已由國內(nèi)課題組完成，為李屬果樹的分子生物學研究奠定了基礎(chǔ)[18]，但仍未有針對三華李A(yù)NS基因的相關(guān)研究。 本研究從三華李果實中克隆獲得ANS基因，對其序列進行生物信息學分析，并研究其在三華李不同組織和果實后熟過程中的表達模式，為進一步探究三華李花青素合成途徑及其調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試三華李植株種植于廣西賀州市賀街鎮(zhèn)三華李驛站果園。 2021 年6 月1 日(花后約130天)采集七八成熟的果實及莖、葉。 果實采后立即運回實驗室，挑選大小均一、無病害及機械損傷的果實，分為兩組，分別作為對照組和乙烯處理組，分別用自來水和5 mL/L 乙烯利溶液浸泡1 min，撈出晾干后自封袋密封24 h，之后打開自封口通風透氣，于25℃下貯藏；每兩天取樣一次，放入-80℃超低溫冰箱保存。 莖、葉及果皮和果肉各組織用液氮速凍，-80℃保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 的提取與cDNA 合成 利用華越洋植物RNA 提取試劑盒提取三華李不同組織和不同后熟階段的總RNA，具體操作方法依照說明書進行。 得到總RNA 后通過超微量分光光度計測定其濃度。 以提取的總RNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成方法參照試劑盒說明書，保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)實驗。

1.2.2PsANS基因的克隆 從三華李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得ANS 序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。 以三華李不同后熟階段的cDNA 為模板，克隆PsANS基因的CDS 序列，進行PCR 擴增。 PCR 反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min，于4℃保存。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，鑒定陽性克隆后測序。 引物合成和基因測序全部交由上海生物科技有限公司完成。

表1 三華李A(yù)NS 基因克隆和表達所用引物

1.2.3PsANS基因生物信息學分析 利用NCBI中的BLASTN、BLASTP 進行基因和蛋白序列比對；通過Expasy-ProtParam Tool 在線軟件對蛋白的基本理化性質(zhì)進行預(yù)測，初步分析目的基因的功能；親疏水性利用ProtScale 以Hphob./Kyte ＆Doolittle 算法進行預(yù)測；采用TMHMM 2.0 進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；采用SignalP-5.0 預(yù)測蛋白質(zhì)有無信號肽；采用ProtComp Version 9.0 進行蛋白亞細胞定位預(yù)測；采用NCBI 的Conserved Domains 分析功能結(jié)構(gòu)域；使用SMART 在線數(shù)據(jù)庫分析蛋白結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)采用ExPaSy-SOPMA在線軟件進行分析；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)采用SWISSMODEL 進行在線預(yù)測。 利用在線軟件STRING預(yù)測ANS 與其他蛋白之間的互作情況(以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參考)；蛋白序列和同源比對分別使用DNAMAN 和ClustaX 軟件。 采用MEGA 5 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4PsANS表達分析 根據(jù)獲得的PsANS基因cDNA 序列設(shè)計熒光定量PCR 特異引物(表1)。 以三華李莖、葉、果皮、果肉不同組織以及三華李后熟過程中的樣品cDNA 為模板，參考TaKa-Ra 公司的SYBR Green qPCR Master Mix 說明書進行熒光定量PCR 擴增。 試驗設(shè)置3 個生物學重復，用2-ΔΔCt方法計算PsANS的相對表達量，采用SPSS 26 軟件進行LSD 方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三華李A(yù)NS 基因的克隆

三華李果實二代有參轉(zhuǎn)錄組參考物種為三月李(Prunus salicina)，參考基因組版本為GCA_014863905.1_SCAU_Psal_1.0。 在三華李果實二代有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選初步注釋為ANS基因的轉(zhuǎn)錄本，其在轉(zhuǎn)錄組中的編號為evm.TU.UTG5995.3；在NCBI 中的比對結(jié)果表明，該片段與其他物種ANS基因的蛋白序列同源性在80%以上，其中與日本裸櫻(Prunus yedoensisvar.nudiflora， PQQ12998) 和 歐 洲 李(Prunus domestica，AHZ30597)ANS的蛋白序列同源性最高。 參考轉(zhuǎn)錄組中該基因序列設(shè)計引物，以三華李的cDNA為模板進行特異性PCR 擴增，獲得ANS基因的CDS 序列(圖1)；將獲得的目的片段與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。 經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)該片段長度為1 074 bp，可編碼357 個氨基酸，將其命名為PsANS，GenBank登錄號為OP131916。 將該cDNA 片段與三月李基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的DNA序列在510～726 bp 間有1 個長度為217 bp 的內(nèi)含子，其基因結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖1 三華李A(yù)NS 基因cDNA 片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 三華李A(yù)NS 基因DNA 結(jié)構(gòu)圖

2.2 PsANS 蛋白理化性質(zhì)分析

通過在線軟件Expasy-ProtParam Tool 分析，該蛋白質(zhì)的分子式為C1901H3048N508O566S19，分子量為40 401.37，總原子數(shù)為5 717。 組成PsANS 蛋白的氨基酸中占比最多的是谷氨酸(Glu)，達10.9%，其次為亮氨酸(Leu)，占比10.1%。 PsANS蛋白的理論等電點為5.46，不穩(wěn)定系數(shù)為47.96，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.3 PsANS 蛋白親疏水性分析

預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖3)，PsANS 的氨基端和羧基端表現(xiàn)出疏水性，親水性大部分集中在中心區(qū)域；疏水出現(xiàn)在第191 位的氨基酸殘基，親水出現(xiàn)在第65 位氨基酸殘基。 PsANS 蛋白的親水性總平均值(GRAVY)為-0.371，預(yù)測該蛋白屬于親水性蛋白。 PsANS 蛋白不存在跨膜區(qū)，無信號肽，為非分泌蛋白。 通過ProtComp Version 9.0 在線軟件預(yù)測PsANS 蛋白在植物細胞中可能定位在細胞質(zhì)。

圖3 PsANS 蛋白疏水/親水性預(yù)測

2.4 PsANS 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

在線軟件ExPaSy-SOPMA 預(yù)測PsANS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖4)表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(h)占35.29%，β-折疊(t)占5.32%，無規(guī)則卷曲(c)占41.18%，延伸鏈(e)占18.21%。 利用SWISS-MODEL 以擬南芥ANS 蛋白為模板構(gòu)建PsANS 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖5)。 以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參考，通過STRING 預(yù)測PsANS 潛在的互作關(guān)系，結(jié)果(圖6)表明，ANS 蛋白主要與TT8(LDOX，無色花青素雙加氧酶)、TT4(CHS，查爾酮合成酶)、DFR(二氫黃酮醇-4-還原酶)、UF3GT(類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)等存在互作關(guān)系。

圖4 PsANS 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 PsANS 編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)模型

圖6 ANS 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測

2.5 蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域、同源比對和系統(tǒng)進化分析

利用NCBI-CDD 對PsANS 蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析，顯示PsANS 為PLN03178(花青素合成酶)多域蛋白，有1 個保守結(jié)構(gòu)域，屬于2-酮戊二酸-Fe2＋-雙加氧酶家族[2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy，第216 ～311位]；該保守結(jié)構(gòu)域含有與2-酮戊二酸特異性結(jié)合的精氨酸Arg(R293，302)和絲氨酸Ser(S240，270，283，289，304)位點7 個，與Fe2＋結(jié)合具有雙加氧功能的組氨酸His(H236，238，247，274，292)和天冬氨酸Asp(D277)位點6個，這些位點在不同物種的ANS 序列中高度保守。通過與其他12 種植物的ANS 蛋白進行同源性多重比對發(fā)現(xiàn)，ANS 氨基酸序列較為保守(圖7)，PsANS 與同為薔薇科的歐洲李更近源(圖8)

圖7 PsANS 與其他已知ANS 蛋白的同源性比較

圖8 三華李與其他植物ANS 蛋白系統(tǒng)進化樹

2.6 PsANS 在三華李不同組織中的表達分析

植物次生代謝合成相關(guān)基因往往具有特異性的時空表達模式，即在代謝旺盛的組織中，相關(guān)基因的表達水平較高[10]。 由圖9 可見，PsANS在三華李的4 個不同組織中均有表達，其表達量在三華李果肉中最高，其余依次是果皮、葉、莖，各組織間存在顯著的表達差異。

圖9 PsANS 在三華李不同組織中的表達

2.7 PsANS 在三華李果實后熟過程中的表達分析

利用熒光定量PCR 技術(shù)分析PsANS在三華李后熟過程中的表達變化，結(jié)果(圖10)顯示，對照組和乙烯處理組PsANS表達量在后熟過程中都增加，貯藏6 d 的表達量分別是0 d 的3.6 倍和6.2 倍。 與對照組相比，乙烯處理組PsANS表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。 貯藏4 d 時，乙烯處理組的PsANS達到表達高峰，是0 d 的8.9 倍。

3 討論與結(jié)論

三華李因富含花青素等抗氧化活性物質(zhì)深受廣大消費者喜愛和科研工作者關(guān)注[7]。 研究三華李果實花青素合成關(guān)鍵基因可為培育具有優(yōu)良外觀品質(zhì)的李子品種提供理論依據(jù)。 花青素合成酶(ANS)是花青素合成通路末端的酶，參與花青素的合成和累積，在果實著色及花色形成中具有重要作用[12]。

本研究首次從三華李果實中克隆獲得ANS基因，并將其命名為PsANS，該序列的編碼區(qū)長度為1 074 bp，可編碼一個由357 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)；與同屬薔薇科的蘋果梨[14]ANS基因長度一致。 本研究發(fā)現(xiàn)ANS 的氨基酸序列在不同植物中具有較高的保守性，都具有典型的2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy 家族保守結(jié)構(gòu)域和花青素合成酶催化位點Arg、Ser、His、Asp。 PsANS 與其他植物ANS蛋白性質(zhì)相似，為無跨膜區(qū)、無信號肽的不穩(wěn)定親水性蛋白，是一種非分泌性蛋白[19]。 花青素主要貯藏于植物細胞的液泡中，但其合成主要在細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面進行，需經(jīng)各種修飾后才被運至液泡等部位儲存[20]，因此，包括ANS 在內(nèi)的一系列酶集中形成多酶復合體在細胞質(zhì)中催化花青素的合成[21]。 本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)PsANS 也定位于細胞質(zhì)中。

以往研究發(fā)現(xiàn)ANS基因表達具有明顯的組織特異性，在植物體的各個組織中均有表達，但表達量存在差異[12，22，23]。 本研究發(fā)現(xiàn)，PsANS基因在三華李不同組織中均有表達，果肉中的表達量最高，莖中最低，暗示PsANS在三華李果肉花青素合成過程中扮演重要角色。 花青素含量是判斷三華李果實成熟度的顯著標志，在成熟過程中快速上升。 三華李是呼吸躍變型果實，后熟過程中果肉的花青素快速合成，而外源乙烯處理能促進果實快速軟化和轉(zhuǎn)紅。 以往研究表明外源乙烯對果實花青素合成有顯著影響，例如乙烯處理可上調(diào)桑椹ANS的表達并促進果實花青素合成[24]；但紅梨和桃果實的花青素合成受乙烯處理顯著抑制[25，26]。 可見，乙烯對不同植物花青素合成的影響較為復雜。 本研究發(fā)現(xiàn)，三華李果實后熟過程中PsANS表達呈上升趨勢，外源乙烯處理進一步促進其表達，表明PsANS響應(yīng)乙烯信號，在李果實后熟轉(zhuǎn)色過程中起重要作用。 但乙烯信號途徑和花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子間的作用機制還需進一步研究。

本研究首次克隆得到三華李果實花青素合成酶基因PsANS全長cDNA，該序列長度為1 074 bp，編碼357 個氨基酸。 PsANS 蛋白具有花青素合成酶的典型結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列與日本裸櫻和歐洲李的ANS 氨基酸序列相似度高；三華李花青素合成酶基因的表達存在組織器官差異性，果肉中表達量最高，莖中最低；三華李后熟轉(zhuǎn)色過程中PsANS表達呈上升趨勢，乙烯處理進一步上調(diào)了PsANS的表達，表明其對三華李果實發(fā)育和后熟過程中花青素的合成起著重要作用。