胡賽賽，萬磊，劉健，黃傳兵，李方澤，陳瑩瑩，程靜

1 安徽中醫(yī)藥大學 安徽合肥 230031

2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種較為復雜的自身免疫性疾病，可能會累及到身體的多個臟器和系統(tǒng)，常見的有腎臟、心臟、肺部、腦、皮膚和血液等[1]。目前較常見的治療手段主要是糖皮質激素聯(lián)合免疫抑制劑，近些年來生物制劑的應用也逐漸廣泛起來[2]。目前患者的生存率已有大幅度的升高[3]，但SLE患者臨床表現(xiàn)多樣，部分病人無法耐受糖皮質激素的治療，且其不良反應令人聞之色變，西醫(yī)治療目前可選擇的藥物還十分有限。SLE患者的臨床表現(xiàn)差異明顯，臨床表現(xiàn)各異也是其漏診率、誤診率高的一個原因，而這正與中醫(yī)學所遵循的“辨證論治”相呼應。中醫(yī)治療可以根據(jù)病人相應的癥狀提供個體化的治療方案，改善其癥狀，減輕西藥的不良反應，協(xié)助減少西藥用量等，最終達到提高生活質量的目的[4]。知母、牡丹皮在治療SLE中應用廣泛，但目前知母-牡丹皮治療SLE尚缺乏依據(jù)合理解釋其作用機制[5]，本文基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接方法分析“知母-牡丹皮”治療 SLE 的有效成分及目標靶點，以期更好的探討知母-牡丹皮治療SLE的作用機制。

資料與方法

1 知母-牡丹皮有效成分及靶點的篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP，輸入知母、牡丹皮為關鍵詞進行檢索，制定篩選標準：口服生物利用度（OB）≥30%、化合物類藥性（DL）≥0.18，篩選出知母-牡丹皮的有效成分，并統(tǒng)計其相應的靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點轉化為基因靶點，得到知母-牡丹皮有效成分及其相應靶點。

2 SLE疾病靶點的篩選

以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及DisGeNE數(shù)據(jù)庫檢索SLE的疾病靶點。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖以及構建“中藥—有效成分—靶點”網(wǎng)絡

使用Draw Venn Diagram 工具，將SLE疾病靶點與知母-牡丹皮相關基因靶點導入，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖。將SLE疾病靶點與知母-牡丹皮有效成分及其相關信息導入Cytoscape3.9.1構建“中藥—有效成分—靶點”網(wǎng)絡。

4 “SLE—知母-牡丹皮”的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建

取SLE疾病靶點與知母-牡丹皮蛋白靶點的交集，將其導入String平臺，選擇 “Multiple proteins”，選擇物種為人類，構建其PPI圖，再將分析結果導入Cytoscape3.9.1，進一步對信息進行分析，篩選出關鍵基因。

5 交集基因的富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的交集基因進行分析，使用ChiPlot繪制出富集分析的氣泡圖，以探討知母-牡丹皮對SLE在基因及信號通路中起關鍵作用的信息。

6 知母-牡丹皮主要有效成分與目標靶點進行分子對接驗證

通過UniProt數(shù)據(jù)庫得到目標靶點對應的PDB ID，通過其ID號在PDB數(shù)據(jù)庫下載目標靶點的蛋白結構，使用PyMol軟件去除蛋白結構外的其他小分子，再將其導入AutoDock Tools處理后設置為受體蛋白。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載有效成分的小分子結構，使用AutoDock Tools處理后設置為配體小分子。再進一步進行分子對接，將結合能最低的構象導出作為最佳結合構象，保存后用PyMol軟件對其進行可視化處理。

結 果

1 知母-牡丹皮有效成分及靶點的篩選

在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中分別搜索知母、牡丹皮，設置OB≥30%和 DL≥0.18作為篩選條件進行篩選，檢索出知母-牡丹皮中化合物共有16個，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫導出其相應靶點，其中知母168個、牡丹皮200個。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫標準化命名后刪除其中的重復項，最終共獲得靶點193個。

2 SLE疾病靶點的篩選

以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank和DisGeNET數(shù)據(jù)庫查詢疾病靶點，分別得到4906、112、30、226、33個基因。對 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中得到的結果以Gifts大于等于平均值（≥29）進行篩選得到基因3147個，將得到的所有基因進行匯總，經(jīng)去重后共得到SLE相關疾病基因3224個。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖以及構建“中藥—有效成分—靶點”網(wǎng)絡

將SLE疾病靶點與知母-牡丹皮相關基因靶點導入Draw Venn Diagram 工具，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖，得到交集靶點共127個（圖1）。將SLE疾病靶點與知母-牡丹皮有效成分及其相關信息導入Cytoscape3.9.1，結果顯示知母-牡丹皮中的16種活性化合物與127個疾病基因相互作用，共同構建“中藥—有效成分—靶點”網(wǎng)絡（圖2）。分析計算得到degree值排名前五的活性化合物（表1），表明知母-牡丹皮中對SLE起主要治療作用的有效化合物主要為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、淫羊藿苷元（Anhydroicaritin）、豆甾醇（Stigmasterol）和薯蕷皂苷元（diosgenin）等。

表1 “知母-牡丹皮”主要活性化合物

圖1 “知母-牡丹皮”藥對與系統(tǒng)性紅斑狼瘡Venn圖

圖2 “中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖

4 “SLE—知母-牡丹皮”的PPI網(wǎng)絡構建

取SLE靶點與知母-牡丹皮靶點的交集，127個潛在靶點，將其導入String平臺，選擇 “Multiple proteins”，選擇物種為人類，構建其PPI初步圖，再將分析結果導入Cytoscape 3.9.1，使用Tools中的Analyze Network對信息進行分析作圖，根據(jù)其Degree值進行排序，并篩選出關鍵基因，構建PPI網(wǎng)絡（圖3），圖中degree值越大，則節(jié)點越大，顏色越深，靶點之間聯(lián)系越密切。排名前五的基因分別為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53；這5個核心靶點蛋白間互作影響力最強，能在復雜的疾病調節(jié)網(wǎng)絡中直接或間接影響其他大部分靶點通路，可能是研究藥物治療SLE的關鍵。

圖3 知母-牡丹皮治療SLE潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖

5 “SLE—知母-牡丹皮”交集基因的富集分析結果

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對篩選出來的交集基因進行KEGG、GO富集分析，結果顯示KEGG共獲得194條富集結果，GO共獲得1877條富集結果，其中GO生物過程（biological process，BP）1646條；GO分子功能（molecular function，MF）150條；GO細胞組分（cellular components，CC）81條。選取具有代表性的集群的富集結果進行可視化分析，使用ChiPlot繪制出KEGG分析圖和GO分析圖（圖4、圖5），其中橫坐標為GeneRatio，縱坐標為富集到的結果名稱。這進一步解釋了知母-牡丹皮治療SLE的潛在機制，幫助我們進一步了解知母-牡丹皮治療疾病時參與的調節(jié)方式。

圖4 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點”的KEGG富集分析

圖5 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點”的GO富集分析

6 知母-牡丹皮主要活性成分與核心靶點分子對接

利用分子對接技術進一步對得到的結果進行分析，選擇篩選后得到的有效成分和目標靶點進行對接，對知母-牡丹皮中有效成分治療SLE的能力進行評估。根據(jù)表1得到的結果，選擇來自知母-牡丹皮的槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元這5個活性成分作為對接配體。根據(jù)PPI網(wǎng)絡篩選出的關鍵基因，選取排名前5的核心靶點：AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53作為對接受體。通過結合能（Affinity）來評估有效成分與目標靶點結合的緊密程度，結合能越低表明配體與受體之間的結合越緊密。表2列舉出了排名前15的對接結果。使用Pymol軟件對部分結果進行進一步處理（圖6），其中淺藍色為受體蛋白，深藍色為配體小分子，紅色為配體與受體結合的氨基酸殘基，黃色虛線為配體與受體之間形成的氫鍵。分子對接結果顯示有效成分與目標靶點之間可以較好的結合。

表2 主要有效成分與目標靶點對接結果

圖6 部分分子對接結構圖

討 論

在本文所示的研究中，通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選出了16個知母-牡丹皮藥對的活性成分和127個與SLE相關的基因靶點。結果表明，知母-牡丹皮藥對在多組分和多目標組合治療SLE中發(fā)揮一定的作用，對治療SLE具有潛在優(yōu)勢。有醫(yī)家認為SLE在急性活動期的主要證型多為熱毒熾盛證，其治法多以清熱為主[6]。知母和牡丹皮同屬清熱藥，知母有清熱潤燥之效，牡丹皮有清熱涼血之效。本研究選取degree值排名前5的活性成分和排名前5的核心基因進行分子對接，有效成分分別為槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元，主要起到抗炎和免疫調節(jié)等作用；核心基因為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA和TP53，主要在調節(jié)免疫、炎癥、調控細胞生長、血管內皮細胞增殖等方面起作用。

槲皮素廣泛存在于多種植物中，實驗研究表明槲皮素具有降血糖、抗過敏、抗炎、抗腫瘤等作用[7]。有研究表明槲皮素具有腎臟抗炎活性，主要通過抑制腎臟中的巨噬細胞極化抑制腎小管間質損傷并且能夠減少機體中的炎癥因子[8]。槲皮素可以通過調節(jié)自身免疫，減少機體中的炎癥因子，改善患者的腎臟功能，對狼瘡腎炎有一定的指導意義[9]。山奈酚及其衍生物可以減少人體內的脂質氧化，防止器官和細胞結構惡化，具有抗菌、抗癌、保護神經(jīng)和保護肝臟等作用[10]。淫羊藿苷元是一種主要來自中藥淫羊藿的化合物，研究表明淫羊藿苷元可以通過調節(jié)功能，進一步調節(jié)炎癥因子的釋放，從而恢復異常信號通路[11]。淫羊藿苷元可以抑制調節(jié)T細胞活性，從而抑制SLE患者免疫細胞的過度活化。且實驗證實其治療小鼠腎臟損傷有一定療效[12]。豆甾醇是一種植物甾醇，具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，但其機制尚未明確。有研究表明，豆甾醇可以顯著抑制促炎介質的表達，促進抗炎細胞因子的表達，從而改善機體的炎癥狀態(tài)[13]。薯蕷皂苷元已被證實具有抗氧化，抗炎和抗癌等的作用。薯蕷皂苷元可以明顯抑制巨噬細胞的活化，抑制CD4+T細胞增殖，阻礙Th1/Th17細胞分化[14]。AKT1在蛋白質合成和細胞凋亡過程中起到重要作用，AKT1的表達增加，會使促炎細胞因子表達增加，進而Treg相關基因表達增加，提示存在與炎癥活動相反的調節(jié)反饋[15]。TNF與自身免疫性疾病的易感性相關，有研究表明SLE的疾病活動評分與TNF-α水平呈現(xiàn)正相關[16]。IL-6由多種免疫細胞產生，有調節(jié)免疫應答等作用[17]，有研究表明IL-6水平在SLE患者中顯著高于健康人，在SLE患者中，活動期高于非活動期。靶向調節(jié)IL-6的表達，有望改善SLE患者的臨床癥狀[18]。VEGFA是一種多功能的細胞生長因子，能夠促進新生毛細血管的生成，并且其是腎小球濾過屏障的關鍵調節(jié)因子，可能對治療狼瘡腎炎具有指導意義[19]。TP53是一種腫瘤抑制基因，具有調節(jié)細胞生長、凋亡和DNA修復的作用，有研究表明TP53與SLE發(fā)病之間存在顯著關聯(lián)[20]。通過以上作用機制的分析，為進一步預測知母-牡丹皮對SLE的治療機制，我們對GO和KEGG進行了富集分析。結果表明，知母-牡丹皮在治療SLE中參與了生物過程中的細胞對脂質、無機物、脂多糖、激素、氮化合物的反應，對細胞外刺激的反應等；分子功能中的轉錄因子結合、細胞因子受體結合、蛋白激酶活性等；細胞組分中的轉錄調節(jié)劑復合物、膜筏、囊泡腔等。KEGG顯示知母-牡丹皮治療SLE涉及的通路主要有鈣信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、cAMP信號、松弛素信號通路及Apelin信號通路等。這些通路在免疫調節(jié)、炎癥反應、調節(jié)血流、信號傳導等方面有重要意義。

本文綜合了網(wǎng)絡藥理學和分子對接，初步從分子水平上展示了知母-牡丹皮的多組分、多靶點、多通道治療SLE的現(xiàn)代應用價值，從而為知母-牡丹皮臨床治療SLE提供指導意義。