高帆帆，王莉，2，楊思培，高榕，2，吳志斌，2，方俊，2，梁運姍，2*

（1.湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，洞庭湖區(qū)農村生態(tài)系統(tǒng)健康湖南省重點實驗室，長沙 410128；2.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南省豬場廢棄物無害化處理與資源化利用工程研究中心，長沙 410128）

重金屬污染一直受到國際、國內社會的高度關注。重金屬沿著食物鏈，通過生物積累對生物體造成嚴重的健康威脅[1]。我國南方地區(qū)有色金屬開采和冶煉活動的快速擴張導致鎘、銅及其他金屬污染嚴重，其中稻田鎘污染導致稻米中鎘含量超過食品安全標準限值[2]。不同重金屬種類、有效性、存在形態(tài)及含量對生物體產生的毒害效果不同[3-5]。大多數金屬陽離子會與蛋白質有效絡合，從而形成不同的金屬離子-有機絡合物[6]，而目前有關金屬和其他物質聯(lián)合暴露對生物體的毒性研究較為匱乏。因此探究重金屬與其他物質聯(lián)合暴露對生物體的毒性，可以更好地了解重金屬對生物體的毒性行為。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，其分泌的結晶蛋白（如Cry1Ab 和Cry1Ac）可通過復雜的毒性機制控制鱗翅目昆蟲[7]。Bt 轉基因作物被大規(guī)模商業(yè)化推廣種植，從而導致大量Bt毒素蛋白通過植物根系分泌、秸稈還田和花粉飄落的方式進入土壤和水生生態(tài)系統(tǒng)[8-10]，Bt蛋白進入土壤初期會對土壤酶活性產生影響[11]。研究表明Bt毒素進入土壤環(huán)境后會與其他污染物，如殺蟲劑、抗生素、重金屬等相互結合[12-13]。Bt蛋白因富含酸性氨基酸結構而具有較強的金屬絡合能力，其傾向與過渡金屬離子形成復合物[14]，目前關于Bt抗蟲蛋白和重金屬聯(lián)合暴露對微生物的毒理作用研究較少。因此，評估兩者聯(lián)合暴露對微生物活性的影響具有重要意義[15]。

本研究以Cry1Ac 蛋白作為Bt 蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作為重金屬代表，以大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為受試模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨及聯(lián)合暴露對兩種細菌的毒性作用，以期為重金屬與Bt 毒素聯(lián)合暴露對微生物的生態(tài)安全風險進行有效評估。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基配制

1.1.1 菌種來源

大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Ba?cillus subtilis）由湖南農業(yè)大學微生物實驗室提供；發(fā)光細菌為費氏弧菌（Vibrio fischeri），購自浙江清華長三角研究院。

1.1.2 LB培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、121 ℃滅菌25 min。

固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超純水1 L、加入1.5%瓊脂、121 ℃滅菌25 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的生長曲線實驗

將1 mL 不同濃度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac 蛋白單一及復合體系分別與1 mL 菌懸液和8 mL 液體培養(yǎng)基混合，最終Zn2+濃度為2、4、8、12、16、20 μg?mL-1，Cd2+濃度為2、4、6、8、10 μg?mL-1，Cry1Ac 蛋白濃度為0.2、0.8、1、2、4 μg?mL-1，復合體系的濃度配比為1∶1，濃度為0.2、1、2、4 μg?mL-1，培養(yǎng)24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的對照組加入1 mL蒸餾水。

B2C企業(yè)技術能力包括核心技術水平和技術創(chuàng)新能力兩個方面。核心技術水平主要由信息技術水平和物流技術水平等構成。信息技術水平指B2C企業(yè)的網站系統(tǒng)建設、信息化水平的建設等；物流技術能力是指物流軟技術，包括系統(tǒng)工程技術、價值工程技術、配送技術等。技術創(chuàng)新能力是引領市場需求、減少成本、增大企業(yè)市場規(guī)模的物質基礎，B2C企業(yè)的信息技術和物流技術的學習創(chuàng)新在優(yōu)化企業(yè)產品/服務組合、降低企業(yè)成本、提升企業(yè)主營業(yè)務的異質性、獨特性方面發(fā)揮重要作用。

1.2.2 平板計數

在固體LB 培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 復合體系（Zn2+：4、8、12、16、20 μg?mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10 μg?mL-1；復合體系：2、4 μg?mL-1）溶液，將對數期的E.coli和B.subti?lis 菌液稀釋6 倍，分別取100 μL 均勻涂布于各平板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后進行活菌計數。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白培養(yǎng)的細菌菌落數作為對照活菌數（CK），用平板計數器對活菌進行計數，記錄各平板上的菌落數，選取菌落數在30~300 個之間的平板用于計算，求出同一處理組平板上生長的平均菌落數。由公式（1）計算存活率：1.2.3 細菌活性氧測定

按照1.2.2的步驟收集處理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL離心管，6 000 r?min-1離心10 min；用pH為7.02 的PBS 緩沖液洗滌，6 000 r?min-1離心5 min，渦旋去除殘留；取10 μL 的活性氧（ROS）熒光探針（濃度為10 mol ?L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37 ℃孵育30 min，每隔10 min 輕輕搖動；孵育結束用磷酸鹽緩沖液充分洗滌；用酶標儀在發(fā)射波長530 nm處檢測樣品的熒光強度。

1.2.4 急性毒性實驗

在超凈無菌工作臺內將-20 ℃保存的Vibrio fisch?eri 凍干粉西林瓶打開，取復蘇液1 mL 于室溫下平衡復蘇10 min，振蕩搖勻。吸取發(fā)光菌液1 mL，用2%NaCl 稀釋至40 mL。將不同濃度樣品（Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白和復合體系）溶液放在96孔板中，不同物質每個濃度設置3 個平行，第一行設置為陰性質控（2%NaCl），為初始發(fā)光強度，第二行為陽性質控（10 mg?L-1的ZnSO4溶液），為樣品發(fā)光強度。各孔中加入樣品液180 μL 和發(fā)光菌液20 μL，總體積200 μL，15 min 后放入檢測儀測定發(fā)光強度。根據Vibrio fischeri的熒光強度計算抑制率（RI，%），計算公式如下：

式中：C0為陰性質控初始發(fā)光強度；St為t時樣品的發(fā)光強度。

1.3 數據處理

每個實驗設置3 個重復，采用SPSS 22 進行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗差異的顯著性，采用Origin 9繪圖。

2 結果與討論

2.1 不同濃度Zn2+、Cd2+對細菌生長曲線的影響

重金屬對細菌生長會產生抑制作用，濃度愈高抑制作用愈強[16]。Zn2+、Cd2+濃度增加對B.subtilis 和E.coli 的抑制增強（圖1），E.coli 細胞壁具有帶負電荷的脂多糖，其可與更多的金屬陽離子結合[17-18]，B.subtilis耐性強于E.coli。不同金屬對生物體的毒性不同，Cd2+對B.subtilis 和E.coli生長的抑制作用大于Zn2+。Cd 是強毒性元素，低濃度就有很強的毒性；Zn 是生物體必需元素，低濃度Zn 可保護細胞免受傷害[19]。Zn2+和Cd2+的加入均對兩種細菌產生了不同程度的毒害，如圖1 所示，Cd2+對兩種細菌的生長抑制效果強于Zn2+。不同濃度的Zn2+和Cd2+脅迫培養(yǎng)細菌生長0~24 h 時，OD 值均低于對照組。隨著金屬濃度的增加，0~11 h 為B.subtilis 的生長期，此時生長曲線呈快速生長趨勢，吸光值增大，12~15 h 處于穩(wěn)定期，15 h 以后OD 值減弱，此時為衰亡期。Zn2+和Cd2+濃度分別在20 μg?mL-1和8 μg?mL-1時完全抑制E.coli生長。

圖1 不同濃度Zn2+、Cd2+對細菌生長曲線的影響Figure 1 Effects of different concentrations of metal ions on bacterial growth curve

2.2 Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露對細菌生長曲線的影響

圖2 為Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露條件下的細菌生長曲線。在0~16 h，各處理組細菌生長曲線的OD600值均低于對照組。在0~10 h 內細菌處于生長期，Cry1Ac 蛋白和Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 聯(lián)合暴露對B.subtilis 和E.coli 生長產生抑制，且隨濃度增加細菌生長受到的抑制作用增強，且E.coli 比B.subtilis 更為敏感。Cd2+單獨及復合體系對兩種細菌的毒性明顯強于Zn2+單獨及其復合體系，Zn在短期內的毒性可能與生物體內貯存濃度有關，當Zn 在生物體內積累到一定濃度就會啟動金屬硫蛋白，促使其與金屬硫蛋白結合而降低毒性[20]。同時Zn2+和Cd2+都會與Cry1Ac 蛋白結合，從而減輕重金屬對細菌的毒害[21]。

2.3 Cry1Ac 蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露下菌落平板生長狀況觀察

采用平板計數法檢測Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白聯(lián)合暴露時對E.coli和B.subtilis存活的影響，結果如圖3所示。隨著重金屬濃度的增加，細菌的存活率顯著降低（P<0.05）。重金屬會抑制細菌酶活性及其生長，高濃度重金屬甚至會導致細菌死亡[22]。Cd2+濃度為10 μg?mL-1時E.coli和B.subtilis的存活率均為0，表明Cd2+濃度為10 μg?mL-1時對兩種細菌的抑制率達到最大。當Zn2+濃度為16 μg?mL-1時，E.coli 的存活率為0，Zn2+濃度為20 μg?mL-1時，B.subtilis 的存活率為0，表明Zn2+濃度為16、20 μg?mL-1時分別對兩種細菌抑制率達到最大。當Zn2+-Cry1Ac 的濃度為4 μg?mL-1時，對E.coli 和B.subtilis 的存活率分別為74.7%和76.8%，當Cd2+-Cry1Ac濃度為4 μg?mL-1時，E.coli和B.subtilis的存活率分別為66.1%和71.2%，即Cd2+-Cry1Ac對兩種細菌生長的抑制效果強于Zn2+-Cry1Ac。

圖3 不同濃度Zn2+、Cd2+及其與Cry1Ac蛋白聯(lián)合處理的細菌存活菌落電鏡圖Figure 3 Electron microscopic images of different concentrations of Zn2+，Cd2+and their combined with Cry1Ac protein against bacteria

2.4 細菌ROS活性檢測

過量ROS 會造成細菌氧化損傷，甚至使細菌活性受到影響[23]。重金屬氧化損傷所產生的ROS 可攻擊膜脂，導致膜功能障礙，同時對蛋白質、DNA 和細胞內系統(tǒng)造成損害。圖4 為暴露于Zn2+和Cd2+后細菌體內的ROS 產生量變化。單一金屬對細菌毒性影響的結果表明：Zn2+濃度從2 μg?mL-1增加到20 μg?mL-1，E.coli 和B.subtilisti 產生的ROS 變化顯著（P<0.05）。Zn在酶催化反應、細胞代謝、信號傳遞等生理調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，有助于抑制自由基和ROS的產生，從而可增強蛋白質的穩(wěn)定性和抗氧化酶的活性[24]。然而過量的Zn 會起到毒性作用，Zn 會與其他金屬發(fā)生錯金屬化阻斷蛋白質硫醇表達，從而引發(fā)基本生物功能的破壞，導致細胞毒性[25]。Cd2+濃度從2 μg?mL-1增加到10 μg?mL-1，E.coli 和B.subtilisti 產生的ROS 變化顯著（P<0.05），雖然Cd2+濃度低，但其毒性很高[20]。Cd2+濃度的增加會誘導細菌產生過量的ROS，造成DNA 損傷，最后使生物體發(fā)生細胞凋亡[26]。此外，細胞內ROS 產生量的增加可能與金屬引起的抗氧化劑消耗（如谷胱甘肽）有關[27]。直接影響重金屬對生物體毒性效應的不是吸附金屬離子的數量，而是能夠與酶、蛋白質、DNA 以及其他細胞結構的功能基團反應的離子或分子的數量[28-30]。

圖4 Zn2+和Cd2+對兩種細菌ROS產生量的影響Figure 4 Effects of Zn2+and Cd2+on ROS production of two kinds of bacteria

細菌處于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白聯(lián)合暴露的條件下時，隨著濃度增加兩種菌體ROS 的產生量整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢（圖5），各處理組細菌ROS 產生量都低于對照組（除了濃度為2 μg?mL-1的Zn2+-Cry1Ac復合體對E.coli的ROS產生量為103.1%）。如圖5 所示，聯(lián)合暴露下E.coli 和B.subtilis 的ROS 產生量呈顯著性變化（P<0.05），這與單獨金屬離子暴露下細菌ROS 產生量呈現(xiàn)的趨勢不同，是與金屬離子與色氨酸的吲哚基團之間的N 配位有關。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac體系中，Zn2+和Cd2+對吲哚基團（色氨酸）中的N具有很強的結合能力，導致其對細菌的氧化損傷降低，從而進一步降低金屬毒性[31]。Zn2+-Cry1Ac 處理比Cd2+-Cry1Ac 處理下E.coli 體內ROS 產生量多：一方面，Cd2+會誘導細菌防御機制響應誘導谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和金屬硫蛋白（MT）等幾種保護酶的升高，這些酶能夠拮抗Cd 的毒性，更多的抗氧化酶能夠清除生物體中Cd脅迫產生的超氧陰離子和過氧化氫等[7]。另一方面，用純Cd2+溶液（如CdCl2）進行培養(yǎng)時，其對細菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac 較Zn2+-Cry1A對細菌的毒性低，這是因為Cd2+與其他物質（例如各種離子或有機成分）之間的相互作用通常會改變Cd2+的毒性，此時Zn2+-Cry1A 聯(lián)合暴露對細菌毒性更強[20]。

圖5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯(lián)合暴露對兩種細菌ROS產生量的影響Figure 5 Effects of combined exposure of Zn2+，Cd2+and Cry1Ac protein binary systems on ROS production of the two bacteria

2.5 發(fā)光細菌急性毒性檢驗

發(fā)光細菌的發(fā)光抑制率反映重金屬對細菌的毒性效應。有研究發(fā)現(xiàn)Zn 濃度大于1.2 mg?L-1時對發(fā)光細菌的發(fā)光強度有明顯抑制作用，Cd 和Pb 濃度改變對發(fā)光強度的影響不顯著[32]。如圖6 所示，不同濃度Zn2+、Cd2+均對Vibrio fischeri 產生抑制，且抑制率隨金屬濃度增加而變大（P<0.05）。Zn2+濃度從2 μg?mL-1增加到20 μg?mL-1，Zn2+對Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率由41%增加到85%；Cd2+濃度從2 μg?mL-1增加到10 μg?mL-1，Cd2+對Vibrio fischeri 的發(fā)光抑制率由39%增加到61%；即不同濃度金屬離子的毒性效果不同，濃度愈高，毒性愈強。相同濃度下Zn2+對Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+對Vibrio fischeri的毒性較大。青海弧菌Q67 和費氏弧菌的毒性實驗結果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+與硫的親和力強于Cd2+，導致其對發(fā)光細菌毒性較大[33]。

圖6 不同濃度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及復合體系對費氏弧菌生長抑制率的影響曲線Figure 6 Influence curves of different concentrations of Zn2+，Cd2+，Cry1Ac proteins and their complex systems on growth inhibition rate of Vibrio fischeri

從圖6（c）中可以看出，各處理對細菌作用15 min后，隨著Cry1Ac 蛋白濃度升高，Vibrio fischeri 的發(fā)光抑制率由負到正，這是由于Cry1Ac 蛋白本身含有具有內源熒光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸[34-35]。具有熒光特性的Cry1Ac 蛋白與Vibrio fischeri 結合導致熒光強度增強，因此抑制率為負，隨著Cry1Ac 蛋白濃度的增加，抑制率逐漸增大，但不會對細菌造成毒性影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉基因Bt 稻草（Cry1Ab 蛋白）在淹水條件下分解的Cry1Ab 蛋白對細菌不會造成毒害作用，即Bt蛋白不會對土壤微生物構成危害[15，36]。

Zn2+、Cd2+與Cry1Ac 聯(lián)合暴露下Vibrio fischeri 的生長抑制率也由負到正，這是由于發(fā)出熒光的Cry1Ac 蛋白和Zn2+、Cd2+結合使自身熒光強度有所減弱。研究表明，具有熒光特性的Cry1Ac 蛋白與不發(fā)光的金屬離子相互作用，降低了Vibrio fischeri 產生的熒光強度[37]，這與本實驗的結果一致。仇愛鋒等[38]的研究表明隨著Cd2+和Cu2+對費氏弧菌暴露時間的延長，菌體細胞膜通透性增強，毒性增大。本研究中，隨著濃度的升高各處理對Vibrio fischeri 的抑制效果增強，相同濃度下各處理對Vibrio fischeri 的抑制效果 表 現(xiàn) 為 Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。

3 結論

（1）高濃度的Zn2+、Cd2+會對E.coli、B.subtilis 生長產生抑制作用，細菌存活率也顯著降低（P<0.05），兩種細菌相比B.subtilis的耐受性強于E.coli。

（2）Cry1Ac 蛋白不會對細菌造成毒性損傷；二元體系聯(lián)合暴露時Zn2+、Cd2+均與Cry1Ac 蛋白（吲哚基團）結合，使得Zn2+、Cd2+對兩種細菌的毒性降低。

（3）兩種細菌活性氧產生量表明Zn2+和Cd2+對E.coli 和B.subtilis 造 成 了 嚴 重 損 傷，Zn2+-Cry1Ac 和Cd2+-Cry1Ac 聯(lián)合暴露對E.coli 和B.subtilis 沒有造成嚴重損傷。

（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白濃度增加對Vibrio fischeri的發(fā)光強度抑制增強，相同濃度下各處理體系的發(fā)光抑制效果為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。