高藝芹，王效科，萬五星，馮美琪，張丹紅，耿春梅，殷寶輝，張楠，宋蕊，劉穎

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016；2.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085；3.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012）

對流層臭氧（O3）是由氮氧化物（NOX）、揮發(fā)性有機化合物（VOCS）等前體物質(zhì)通過一系列復(fù)雜的光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的二次污染物[1-2]。世界氣象組織（WMO）監(jiān)測O3發(fā)現(xiàn)，全球背景O3濃度年均增長0.15 nmol·mol-1，全 球 城市O3濃 度年 均 增 長0.31 nmol·mol-1[3]。生態(tài)環(huán)境部2022 年7 月31 日發(fā)布報告所示，O3已成為繼PM2.5后中國的另一項主要污染物。2022 年的調(diào)查表明中國O3污染最嚴(yán)重地區(qū)為華北平原，特別是京津冀城市及周邊地區(qū)[4]。O3污染呈現(xiàn)區(qū)域性、聚集性特征[5]。

O3作為一種強氧化性空氣污染物，會嚴(yán)重?fù)p害生物健康[6]。大量研究表明，O3污染會對植物形態(tài)、生理和生產(chǎn)等方面產(chǎn)生一系列負(fù)面效應(yīng)，如：葉片可見明顯傷害癥狀（包括斑塊、斑點等）[7-8]，氣孔阻力增加，氣孔傳導(dǎo)降低[9-10]，膜系統(tǒng)破壞，光合色素含量減少，光合速率下降；玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）等農(nóng)作物生物量減少[11]。已有研究證明，隨著O3濃度升高和O3暴露時間累積，植物受影響的程度會不斷加重[12-13]?；谏飳Νh(huán)境變化的響應(yīng)和適應(yīng)的復(fù)雜性，依據(jù)植物對環(huán)境因子的生態(tài)適應(yīng)規(guī)律并結(jié)合R 語言的統(tǒng)計分析結(jié)果可以得知植物對環(huán)境脅迫（包括空氣污染）的響應(yīng)程度（即敏感性），隨著暴露時間延長可能會出現(xiàn)3 種情況：不變、增強和減弱。到目前為止，小白菜對O3的敏感性隨暴露時間的變化方面的數(shù)據(jù)還比較缺乏[14-15]。

選取十字花科蕓薹屬栽培植物小白菜（Brassica pe?kinensis）“正旺達(dá)88”為研究對象，采用開頂式氣室（Open-Top-Chamber，OTC）開展O3熏蒸實驗，研究隨O3濃度升高和暴露時間延長小白菜葉片生理參數(shù)的變化情況，為科學(xué)估算O3對蔬菜的危害程度提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與實驗設(shè)計

研究地點位于山東淄博市（36°57'N，118°13'E），該地區(qū)屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，屬半濕潤氣候，氣候變化具有明顯的季節(jié)性。以小白菜“正旺達(dá)88”為實驗對象，“正旺達(dá)88”為雜交一代，速生，葉片油綠、平展、光滑，淡綠幫，生長勢旺，抗病能力強，特抗熱、耐濕、耐寒。

實驗采用圓柱形OTC 對小白菜進(jìn)行O3熏氣實驗（圖1），氣室高2 m，底外切圓直徑3 m，體積約10 m3。為減少外部氣體對室內(nèi)氣體的影響，OTC 頂端增設(shè)45°收縮口（高0.8 m）。本研究中的O3以環(huán)境大氣作為氣源，由O3發(fā)生器（3S-A3，北京同林高科科技有限公司）發(fā)生不同濃度O3，通過控制高壓空氣流量來控制O3產(chǎn)生量。布?xì)夤苡梢桓睆綖? m、兩端密封的PVC 管加工而成，管路上分布等距離且與水平成45°夾角的小孔，滿足：①小孔總面積≥立管的橫截面積，以減少動壓損失；②根據(jù)作用力與反作用力原理，與水平成45°夾角的小孔噴出的氣體為布?xì)夤芴峁┬D(zhuǎn)的推動力；③從布?xì)夤苤行闹羶啥?，小孔開孔直徑逐漸增加以保證在水平截面上布?xì)獾木鶆蛐裕虎懿細(xì)饪撞捎猛鈴酱笥趦?nèi)徑的喇叭型開口，以降低對農(nóng)作物的直吹。PVC氣管與立管連接部分采用密封軸承，確保布?xì)夤苻D(zhuǎn)動自如，且氣體沒有泄漏。此外，立管高度可隨作物株高調(diào)整，且保持布?xì)夤芟戮壘嚯x作物冠層≥50 cm。

圖1 O3熏蒸系統(tǒng)實景圖和通氣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Real picture of O3 fumigation system and structure picture of ventilation system

OTC 中加入不同濃度O3以獲得不同實驗組，實驗共設(shè)4 個O3濃度，分別為環(huán)境濃度（NF）、環(huán)境濃度+40 nmol·mol-1（NF40）、環(huán)境濃度+80 nmol·mol-1（NF80）、環(huán)境濃度+120 nmol·mol-1（NF120）。每個濃度設(shè)3 個重復(fù)，共計12 個OTC。2021 年8 月5 日—9月1 日，小白菜進(jìn)行O3熏蒸。累積熏氣天數(shù)28 d，每天熏氣8 h（北京時間9：00—17：00），陰雨天（8 月20日、8 月25 日、9 月1 日共計3 d）不熏氣。O3濃度日變化特征如圖2所示。熏氣期間NF、NF40、N80和N120處理的實際O3濃度平均分別為49.13、90.81、124.78 nmol·mol-1和151.68 nmol·mol-1。

圖2 O3日平均濃度變化Figure 2 Variation of daily average concentration of O3

2021 年7 月18 日，將小白菜種子人工播種在不同處理的OTC 地面土壤內(nèi)。土壤0~20 cm 的有機質(zhì)含量為21.35 g·g-1，水解性氮、速效磷、速效鉀含量分別為126.2、30.0、316 mg·kg-1。在播種前，對土壤進(jìn)行統(tǒng)一殺菌和均勻施農(nóng)家肥（主成分為牛糞）處理，種植期間不再施加肥料。出苗后首先以漫灌方式將土壤澆透，然后以噴灌形式，約4 d 灌溉一次（雨天除外）。小白菜生長出第2片真葉時開始間苗。

1.2 試驗方法

小白菜生長出第一片完全成熟葉片標(biāo)記為第1葉位，按生長先后順序標(biāo)記至第10葉位。小白菜首次出現(xiàn)O3癥狀后，每隔7 d采集植株的第5~7葉位葉片作為樣本（5~7葉位為開始熏氣時完全展開的葉），進(jìn)行生理生化實驗。每株采集2~3片葉片，每次每處理共計15片葉片，其中包含3個重復(fù)。全生育期4次采樣日期（4期）依次為8月12日、8月19日、8月25日和9月1日。

葉綠素（Chlorophyll，Chl）和類胡蘿卜素（Caro?tene，Car）含量的測定：95%乙醇提取色素，充足時間暗處理后，測定470、664、649 nm 處吸光度，根據(jù)Li?chtenthaler[16]的修正公式計算Chl與Car含量。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的測定：采用硫代巴比妥酸法[17]。

抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）含量的測定：采用Okamura（1980）還原Fe3+的方法測定還原型抗壞血酸（還原型AsA）與總抗壞血酸（總AsA）含量[18]。

可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量的測定：采用蒽酮比色法。使用Solarbio公司生產(chǎn)的植物可溶性糖含量檢測試劑盒（BC0035）檢測樣品[19]。

可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量的測定：在酸性乙醇溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250 與蛋白結(jié)合后顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，在595 nm 有最大吸收值。使用上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的Bradford 蛋白定量試劑盒（R-21252）檢測樣品[20]。

總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）的測定：酸性條件下，樣品中的抗氧化物質(zhì)還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生Fe2+-TPTZ，呈現(xiàn)出明顯藍(lán)色，于593 nm處有最大吸光度。使用上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的總抗氧化能力檢測試劑盒（R-24147）檢測樣品[21]。

還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量的測定：谷胱甘肽與5，5'-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-巰基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物。2-硝基-5-巰基苯甲酸為黃色產(chǎn)物，在波長412 nm 處具有最大吸光度。使用Solarbio公司生產(chǎn)的還原型谷胱甘肽含量檢測試劑盒（BC1175）檢測樣品[22]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性（Phosphoenolpyr?uvate carboxylase activity，PEPC）的測定：PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO2-4，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH 生成蘋果酸和NAD+，在340 nm 處測定NADH 減少速率，計算PEPC 活性。使用Solarbio 公司生產(chǎn)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性檢測試劑盒（BC2195）檢測樣品[23]。

生物量的測定：每隔10 d 采樣測定植株各器官（根、莖、葉）生物量并計算總生物量。隨機選取3 株新鮮植株樣品，將各器官分開測定鮮質(zhì)量，然后分別于烘箱105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

O3暴露劑量AOT40（小時O3濃度大于40 nmol·mol-1的累積O3暴露值）的計算公式如下：

式中：CO3為太陽總輻射大于50 W·m-2時的小時平均O3濃度。

利用R 語言lm（）函數(shù)建立各次測定的Chl、Car、SS、SP、PEPC、MDA、GSH、AsA、T-AOC 與O3暴露劑量AOT40的線性模型。根據(jù)線性模型得到截距、截距標(biāo)準(zhǔn)差，斜率、斜率標(biāo)準(zhǔn)差，分別估算截距的95%置信區(qū)間（截距CI，截距-截距標(biāo)準(zhǔn)差×1.96，截距＋截距標(biāo)準(zhǔn)差×1.96）和斜率的95%置信區(qū)間（斜率CI，斜率-斜率標(biāo)準(zhǔn)差×1.96，斜率＋斜率標(biāo)準(zhǔn)差×1.96）。截距代表非脅迫下小白菜生長過程中的生理指標(biāo)變化。斜率代表小白菜生長過程中的生理指標(biāo)對O3暴露的響應(yīng)敏感性。采用GraphPad Prism 9.3.1 軟件的Forest plot 分別繪制各次采集的葉片生理指標(biāo)的截距和斜率置信區(qū)間。

利用R4.2.1 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），在分析之前使用as.matrix（）函數(shù)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為矩陣，然后使用scale（）函數(shù)將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，通過Factomine R 程序包中的PCA（）函數(shù)，將主成分分析應(yīng)用于選定的AOT40 和生理指標(biāo)（Chl、Car、SP、SS、MDA、GSH、AsA和T-AOC），并通過Factoextra 程序包的fviz_pca_ind與fviz_pca_var函數(shù)進(jìn)行可視化圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白菜形態(tài)和生物量對O3濃度升高及暴露時間延長的響應(yīng)

實驗中，小白菜在不同濃度O3熏蒸下表現(xiàn)出不同程度的傷害癥狀，且隨著時間的延長可見傷害癥狀加劇。在O3熏蒸3 d 時，NF120 組小白菜局部可觀測到受害癥狀，首先出現(xiàn)葉邊緣褪綠及黃化斑點。隨著O3熏蒸的累積，可見傷害癥狀由葉邊緣擴散到葉中部區(qū)域乃至整個葉片。O3熏蒸累積28 d時，熏氣處理的葉片O3可見傷害癥狀占據(jù)葉片的大部分表面（圖3）。小白菜葉片黃化干枯且老化脫落葉片增多，說明高濃度O3熏蒸、積累對小白菜葉片造成了傷害，加速了植株衰老的進(jìn)程。

隨著O3濃度升高，小白菜的各器官生物量和總生物量都呈現(xiàn)下降趨勢（圖4）。熏氣28 d時，NF組與NF40、NF80、NF120 組的葉生物量與總生物量存在顯著性差異（P<0.05）；與NF 組相比較，NF40 組小白菜根、莖、葉和總生物量分別減少了30.23%、62.91%、94.71% 和124.28%，NF80 組 分 別 減 少 了20.93%、33.73%、101.68%和133.32%，NF120 組分別減少了41.86%、140.86%、137.91%和185.01%。

圖4 小白菜各器官生物量隨O3濃度和熏蒸時間的變化Figure 4 Changes of organ biomass of Brassica pekinensis with O3 concentration and fumigation time

2.2 小白菜生理指標(biāo)對O3濃度升高及暴露時間延長的響應(yīng)

2.2.1 光合生理相關(guān)參數(shù)

從不同采樣日期的葉片光合色素（Chl 和Car）含量和光合作用PEPC 活性與AOT40 線性模型參數(shù)（圖5 中a、b、c、d、e、f）可以看出，模型截距從熏氣第7 天到第28 天呈先略微增加后減少的趨勢，說明隨小白菜生長，葉片光合色素含量和PEPC 活性先增后減。但各期測定得到的模型截距CI 重疊，說明隨小白菜生長，葉片光合色素含量和PEPC 活性沒有發(fā)生顯著變化。光合色素含量的模型斜率CI 小于0 且與0 不重疊，說明O3脅迫造成葉片光合色素含量顯著降低。光合色素含量的模型斜率CI 在熏氣前3 期逐步增加后減少，且斜率CI 在第1 期和第3 期存在不重疊現(xiàn)象，說明葉片光合色素含量對O3的敏感性隨O3暴露時間延長會顯著減弱，至第28 天時敏感程度不存在顯著差異。PEPC 活性的模型斜率CI 與0 重疊，說明O3對PEPC活性沒有產(chǎn)生顯著影響。

圖5 光合生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型的截距和斜率的95%置信區(qū)間（CI）Figure 5 The 95%confidential interval of intercept and slope of the linear model between photosynthetic physiological indicators and O3exposure dose（AOT40）

從葉片SS 和SP 含量與AOT40 線性模型參數(shù)（圖5 中g(shù)、h、i、j）可以看出，模型截距CI 從熏氣第7 天到第28 天呈逐漸減少趨勢，并且SP 后兩期的模型截距CI 與前兩期不重疊，說明SP 含量隨小白菜生育進(jìn)程推移明顯減少。SS模型斜率CI大于0且與0不重疊，說明隨O3暴露劑量AOT40 增加，葉片SS 含量顯著增加。SS 模型斜率CI 在熏氣前期較大而后期明顯變小，但各次模型斜率CI 存在重疊，說明葉片SS 對O3的敏感性隨暴露時間無顯著變化。SP模型斜率CI小于0 且不與0 重疊，說明隨O3暴露劑量AOT40 增加，葉片SP含量顯著減少。SP模型斜率CI從熏氣第7天后一致增加，且后3 期與第1 期不重疊，說明葉片SP對O3的敏感性隨暴露時間延長顯著減少。

2.2.2 抗氧化生理相關(guān)參數(shù)

由葉片MDA、還原型AsA、總AsA 和T-AOC 與AOT40 線性回歸模型參數(shù)（圖6 中a、b、c、d、e、f、g、h）分析得知，模型截距CI 在熏氣周期內(nèi)呈先略增加后減少的趨勢，說明隨小白菜生長，葉片MDA、還原型AsA、總AsA 及T-AOC 先增后減。且還原型AsA 含量的前兩期模型截距CI 不存在重疊，MDA 和總AsA含量及T-AOC 各期測定得到的模型截距CI 存在重疊，說明隨小白菜生長，葉片還原型AsA 含量前兩期出現(xiàn)顯著增加，葉片MDA、總AsA和T-AOC含量不存在顯著性變化。

圖6 抗氧化生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型的截距和斜率的95%置信區(qū)間（CI）Figure 6 The 95%confidence interval of intercept and slope of linear model of plant antioxidant physiological index and ozone exposure dose（AOT40）

MDA含量的模型斜率CI大于0并且不與0重疊，說明隨著O3暴露劑量AOT40增加MDA含量會顯著增加（P<0.05）。MDA 含量的模型斜率CI 在熏氣前3 期呈先減少后略增加趨勢。后3 期測定得到的模型斜率CI 與第1 期不存在重疊現(xiàn)象，說明葉片MDA 含量隨著暴露時間延長對O3的敏感性顯著下降。還原型AsA、總AsA 和T-AOC 的模型累積熏蒸7 d 時存在斜率CI 與0 重疊的情況，說明O3脅迫對還原型AsA、總AsA 和T-AOC 的影響隨著暴露時間延長不存在顯著性變化。

從葉片GSH 含量與AOT40線性模型參數(shù)（圖6中i、j）可以看出，GSH 模型截距CI在熏氣期間呈增加趨勢。O3暴露20 d后，GSH模型截距CI與無效線0不重疊，說明GSH含量在生長后期發(fā)生了顯著增加。GSH模型斜率CI大于0且與0不重疊，說明隨著O3暴露劑量AOT40 增加，葉片GSH 含量顯著增加。GSH 模型斜率CI 在熏氣前期大而后期明顯變小，但各期模型斜率CI 存在重疊，說明O3對葉片GSH 的敏感度隨暴露時間沒有顯著變化。

2.3 小白菜生理指標(biāo)對O3濃度升高及暴露時間延長響應(yīng)的綜合分析

采用主成分分析對O3濃度升高與暴露時間延長時各生理指標(biāo)的響應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，從主成分分析的二序圖（圖7b 和圖7d）可以看出，Dim1 和Dim2 共同解釋了小白菜生理指標(biāo)值總方差的64.4%。Dim1 解釋了方差的37.3%（圖7d），反映了O3暴露濃度越高，處理組與NF 組離散程度越高，說明O3暴露濃度對小白菜的影響越大。Dim2 解釋了方差的26.9%（圖7b），反映了暴露時間延長對小白菜生長的影響，其中7~14 d 離散程度最大，與后兩期離散程度減少，說明隨著O3暴露時間延長，小白菜對O3脅迫的敏感度有所減小。指標(biāo)變量間夾角越小，表示變量間相關(guān)性越高（圖7 中a、c）。由圖可將研究指標(biāo)分成3 組：第1 組為Chl、Car 和SP，與光合作用和營養(yǎng)有關(guān)；第2 組為MDA、SS 和GSH，與細(xì)胞膜透性、能量供應(yīng)和抗氧化能力有關(guān)；第3 組為PEPC、T-AOC 和AsA，與光合作用和抗氧化能力有關(guān)。MDA 和SS與Dim1夾角很小，說明這兩個指標(biāo)與Dim1 的關(guān)系比較密切，即與O3暴露濃度的關(guān)系比較密切。而其他指標(biāo)與Dim1 和Dim2 的夾角幾乎相等，說明這些指標(biāo)同時受到O3暴露濃度和暴露時間的影響。

圖7 O3濃度與熏蒸時間對小白菜生理指標(biāo)影響的主成分分析Figure 7 Principal component analysis of the effects of O3 concentration and fumigation time on physiological indexes of Brassica pekinensis

3 討論

3.1 小白菜生理指標(biāo)隨生長的變化

本研究自然狀態(tài)下（即沒有接受O3暴露），在小白菜的生長過程中，其葉片內(nèi)Chl、Car 含量先增加后減少，PEPC 活性在初期小幅增長然后下降，SS 含量總體呈下降趨勢，SP 含量在初期略增長后顯著降低。這可能是因為小白菜生長期間需要合成大量光合色素進(jìn)行光合作用并積累有機物，生長后期植株衰老、葉片枯黃、色素降解，并且小白菜自然衰老會促進(jìn)SP分解[24]。葉片內(nèi)MDA 含量、T-AOC 初期增加后期減少，還原型AsA與總AsA在初期呈動態(tài)平衡至后期總體減少，GSH含量增加。這可能是因為面對其他環(huán)境脅迫，小白菜膜系統(tǒng)受損，抗氧化物質(zhì)增加[24]。

3.2 O3濃度升高對小白菜生理特征的影響

本研究表明，高濃度O3會導(dǎo)致葉片產(chǎn)生褪綠、黃化斑點等傷害癥狀，O3傷害癥狀首先出現(xiàn)在葉片葉肉部分，主葉脈與小葉脈沒有出現(xiàn)受害癥狀。O3對于作物葉片的解剖學(xué)影響首先表現(xiàn)為危害柵欄組織，使其質(zhì)壁分離，細(xì)胞內(nèi)含物受到破壞且分散[25-26]。隨著O3暴露時間延長，葉片光合色素減少，上表皮的壞死斑點變大，互相融合，最后傷害到海綿組織，形成兩面壞死斑，同時葉肉組織減少，葉片變薄，葉邊卷曲[27-29]。本研究中高濃度O3脅迫下，小白菜葉片受傷害面積逐漸增大，葉片變黃、脫落，最終導(dǎo)致生物量降低。同時傷害癥狀對生理指標(biāo)光合色素的下降做了進(jìn)一步驗證。已有研究表明，O3濃度升高可以顯著誘導(dǎo)濕地松（Pinus elliottii）針葉凋落，使葉面積減小，最終抑制濕地松的生長[30]。

根據(jù)研究小白菜生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型斜率的正負(fù)及是否與0重疊的結(jié)果顯示，O3濃度升高顯著降低了小白菜的光合生理特性（P<0.05），顯著增加了小白菜生理參數(shù)（P<0.05），而小白菜的PEPC 活性略微升高但沒有產(chǎn)生顯著影響，說明高濃度O3脅迫破壞了葉片光合組織，減少了色素含量，改變了色素組成，使光合膜系統(tǒng)受損，導(dǎo)致小白菜光合反應(yīng)速率下降[31]。O3誘導(dǎo)葉片Chl 和Car 含量的減少與已有文獻(xiàn)中報道的結(jié)果相同[32-33]。SS、SP是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，高濃度O3脅迫下SS 含量增加可防止細(xì)胞失水過多，從而減少脅迫對細(xì)胞的傷害。O3脅迫下的小白菜葉片SS 含量增加與莊明浩等[34]對毛竹（Phyllostachys edulis）和四季竹（Oligostachyum lubricum）的研究結(jié)果相似。而隨著AOT40 增加，小白菜葉片SP 含量顯著降低，這可能是因為大多數(shù)SP 含量下降而氨基酸增加[35]。逆境脅迫下，光抑制現(xiàn)象在C3植物中普遍存在。本研究中PEPC 活性升高，說明O3濃度升高誘導(dǎo)了PEPC 活性增加，從而增強小白菜對高濃度O3的抗性。本研究PEPC 活性升高的結(jié)果與前人研究中菜豆（Phaseolus vulgaris）和濕地松（Pinus elliottii）的PEPC 活性上升的結(jié)果相似[36-37]。

O3具有強氧化性，其進(jìn)入植物細(xì)胞后會進(jìn)行氧化分解產(chǎn)生過氧化氫（H2O2）、氣態(tài)O2、活性氧（ROS）、自由基等產(chǎn)物[38-40]，這些活性氧、自由基等產(chǎn)物使植物葉片細(xì)胞中多種功能膜和酶系統(tǒng)被破壞，產(chǎn)生葉片傷害[41]，誘發(fā)膜脂過氧化[42]。MDA 為膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA 含量顯著增加，代表膜受損程度增大，這與前人研究矮化自根砧木M9T337 的結(jié)果相同[43]。AsA與GSH是細(xì)胞內(nèi)的一種抗氧化劑[44]，GSH能幫助植物保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，主要在AsA-GSH 循環(huán)中起主要作用[45]。小白菜體內(nèi)GSH 含量和T-AOC 增加，以清除植物各項代謝過程中產(chǎn)生的自由基，緩解膜脂過氧化傷害[46]，這與前人研究甜菜（Beta vulgaris）和菠菜（Spina?cia oleracea）的相關(guān)結(jié)果基本一致[47-48]。

綜上，在高濃度O3脅迫下，小白菜光合生理指標(biāo)含量下降，整體光合效率降低，以致小白菜生物量受損嚴(yán)重。因此，O3污染可能會對小白菜類葉菜的生長及其經(jīng)濟價值帶來不利影響。

3.3 小白菜生理指標(biāo)對O3污染的敏感性隨暴露時間延長的變化

根據(jù)小白菜生理指標(biāo)與O3暴露劑量（AOT40）線性模型斜率在不同觀測時間是否存在顯著性差異，可以看出小白菜生理指標(biāo)敏感性（即指標(biāo)對單位O3暴露劑量變化的響應(yīng)大?。┦欠耠S暴露時間延長而發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明隨著O3暴露時間的延長，初期Chl、Car、SP、MDA 的斜率參數(shù)顯著降低，熏氣28 d 時略有上升。綜上說明小白菜葉片Chl、Car、SP、MDA含量對O3影響的敏感性會隨著暴露時間延長整體下降。這是因為隨著O3熏蒸時間延長，小白菜會產(chǎn)生一定的適應(yīng)能力和抗性，以致光合生產(chǎn)能力（Chl 含量）和氧化能力（MDA 含量）對O3暴露劑量的敏感性變?nèi)酰琌3對小白菜葉片的生理影響并沒有出現(xiàn)快速惡化的現(xiàn)象。已有研究報道，對于高濃度O3處理的銀杏（Ginkgo biloba），隨著暴露時間的延長，其葉片光合參數(shù)對O3脅迫的敏感性下降[49]；油松（Pinus tabuliformis）針葉的膜脂過氧化程度隨暴露時間延長，高濃度O3引起的MDA增加量（相對于對照）會變大[50]，但如果考慮熏蒸時間延長的O3累積因素，單位暴露累積劑量引起的光合作用下降幅度并不會明顯增加，同樣單位暴露累積劑量引起的MDA增加幅度也不會明顯增加。

在其他環(huán)境脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫暴露時間的延長，植物生理指標(biāo)對脅迫暴露累積劑量的敏感性下降。例如高粱（Sorghum bicolor）Moench H21 幼苗Chl對長時間低溫脅迫的敏感性降低[51]。隨著低溫脅迫時間延長，油菜（Brassica napus）葉片SP、MDA 對長時間干旱脅迫敏感度整體呈下降趨勢[52]。隨著高溫脅迫時間延長，蝴蝶蘭（Phalaenopsis sp.）幼苗葉片Chl、SP、MDA 對長時間高溫脅迫敏感性整體下降[53]。這也意味著單采用線性的O3暴露劑量響應(yīng)關(guān)系，有時會高估O3暴露對小白菜一些生理指標(biāo)的影響，因此需結(jié)合O3熏蒸累積，進(jìn)一步驗證植物對O3脅迫的敏感性。

由主成分分析可知，O3濃度越高，小白菜植株生理指標(biāo)受O3脅迫的影響越大（圖7b、圖7d），說明O3對小白菜葉片生理指標(biāo)的影響是同時受到O3暴露濃度和時間的影響。不同生理指標(biāo)受O3暴露濃度和熏蒸時間延長的影響程度存在差異（圖7a、圖7c）。反映細(xì)胞膜透性（MDA）和能量供應(yīng)（SS）的2 個指標(biāo)與O3暴露水平的關(guān)系更加密切。

4 結(jié)論

（1）隨著O3濃度升高，小白菜葉片的葉綠素（Chl）、類胡蘿卜素（Car）和可溶性蛋白（SP）含量減少（P<0.05），丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）以及總抗氧化能力（TAOC）增加，表明O3濃度升高會造成小白菜葉片中光合色素下降和生理傷害增加，并誘使小白菜抵御O3脅迫的抗氧化能力增強。

（2）隨著O3暴露時間延長，葉片中Chl、Car、SP、MDA 對O3的敏感性減弱（P<0.05），而SS、GSH、AsA、T-AOC 對O3敏感性沒有顯著變化，表明O3對小白菜葉片生理特征的影響強度會隨暴露時間延長而下降，小白菜對O3脅迫的敏感性隨時間延長表現(xiàn)出下降的特征。

（3）通過主成分分析，將受O3影響的小白菜葉片的指標(biāo)按相關(guān)性劃分成三類，分別是：Chl、Car 和SP；MDA、SS 和GSH；PEPC、T-AOC 和AsA。這些指標(biāo)的變化與O3暴露水平和暴露時間有關(guān)，其中反映細(xì)胞膜透性（MDA）和能量供應(yīng)（SS）的2 個指標(biāo)與O3暴露水平的關(guān)系更加密切。