趙鴻彬，白雪，范宇鳳，張曉馥，張濤，李淑芬,3

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古高校麥類作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018

光是生物鐘基本架構(gòu)中的第一環(huán)，光受體作為生物鐘分子基礎(chǔ)中的輸入途徑和核心振蕩器，通過轉(zhuǎn)錄以及翻譯，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的輸出信號(hào)，從而在時(shí)間維度上調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝，并且在外界脅迫時(shí)起到應(yīng)答的作用（Johansson et al.，2015）。植物光受體通過感知光的種類、強(qiáng)弱、照射時(shí)間調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)和光形態(tài)建成。通過對(duì)不同植物光受體的研究，發(fā)現(xiàn)三類光受體分別通過感知紅光、藍(lán)光和紫外光進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中包括5 個(gè)紅光受體光敏色素（PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE）（Cashmore et al.，1999）、7 個(gè)藍(lán)光受體（CRY1、CRY2、PHOT1、PHOT2、FKF1、LKP2、ZTL）和1 個(gè)UV-B（UVR-8）受體（Smith，2000；馬朝峰等，2019）。

目前的研究認(rèn)為在植物花期、光周期等的調(diào)控過程中，發(fā)揮最大作用的藍(lán)光受體為隱花色素。最早發(fā)現(xiàn)的隱花色素Cry1（cryptochromes1）于1990年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)（Lin et al.，1995），其突變體在藍(lán)光生長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)為下胚軸伸長(zhǎng)，隨后，Cry1 同源蛋白Cry2 也相繼被發(fā)現(xiàn)（Lin et al.，1996），隱花色素CRY1、CRY2 由輔酶基團(tuán)和脫輔酶基團(tuán)兩大功能基團(tuán)構(gòu)成。輔酶基團(tuán)感受外部環(huán)境中的光信號(hào)；脫輔酶基團(tuán)傳遞由輔酶基團(tuán)感受的光信號(hào)給下游信號(hào)通路蛋白，從而引發(fā)植物相應(yīng)生理反應(yīng)（Yang et al.，2000；Wang et al.，2001）。脫輔酶基團(tuán)包含N 端PHR 和C 端CCE 兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，因其在不同生物中都存在保守性較高的DAS 基序，因此在不同植物中都具有相同或相似的功能（王紅霞等，2017）。

隱花色素在光形態(tài)建成具有重要作用，主要參與下胚軸伸長(zhǎng)（Yu et al.，2010）、植物開花（王紅霞等，2017）、氣孔開放（張麗等，2021）等生理過程。在藍(lán)光條件下，植物COP1 是光形態(tài)建成的中心抑制因子，SPA1 與COP1 結(jié)合增強(qiáng)COP1 活性，抑制光形態(tài)建成（Liu et al.，2011）。CRY1 可以通過與SPA1 作用，使SPA1 與COP1 相互作用被打斷，失去活性的COP1 不能降解HY5/HYH 等轉(zhuǎn)錄因子，下胚軸伸長(zhǎng)受到抑制（Liu et al.，2016）。CRY2 與調(diào)節(jié)下胚軸伸長(zhǎng)基因PIF4/PIF5 處于同一位點(diǎn)，二者結(jié)合可調(diào)控低光照度藍(lán)光下擬南芥下胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)（Zuo et al.，2011）。

擬南芥的隱花色素通過參與開花途徑調(diào)控開花，隱花色素CRYs 與光敏色素PHYs 共同調(diào)控CO的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響開花關(guān)鍵基因FT的表達(dá)（Zuo et al.，2011）。通過對(duì)CRY 突變體的研究，發(fā)現(xiàn)cry1cry2 雙突變體在藍(lán)光下使葉片氣孔開度增加，過表達(dá)CRY1 的植株在藍(lán)光下則使葉片氣孔開度減?。↙iu et al.，2011）。除去上述CRY1 參與SPA1-COP1 調(diào)控途徑，隱花色素還作為光與光依賴蛋白間的調(diào)控因子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如CRY2 與CIB1直接結(jié)合激活FT轉(zhuǎn)錄（Liu et al.，2013）、CRY1通過對(duì) H2A.Z 促進(jìn)作用抑制下胚軸的伸長(zhǎng)等（Zlatanova et al.，2008）。

此外，植物還通過CRY1、CRY2基因表達(dá)調(diào)控生物鐘，以適應(yīng)周圍環(huán)境的改變，使植物自身生長(zhǎng)繁殖不受影響，并且在極端環(huán)境下的植物的適應(yīng)中，這兩個(gè)基因更是起到關(guān)鍵作用（Yan et al.，2022）。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)CRY 蛋白降解的E3泛素連接酶LRB，揭示了環(huán)境溫度與光照變化下CRY 蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)制，二者互作調(diào)節(jié)CRY蛋白穩(wěn)定性進(jìn)而響應(yīng)環(huán)境溫度變化，促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)等表型改變（Ma et al.，2021）。

對(duì)于大多數(shù)植物而言，全球變暖會(huì)導(dǎo)致其春季早花、秋季晚花，延長(zhǎng)生殖生長(zhǎng)期（Sherry et al.，2007）等物候上的改變，同樣，由此導(dǎo)致的氮沉降對(duì)也會(huì)對(duì)不同植物物候產(chǎn)生不同影響（Galloway et al.，2003；李元恒等，2014）。短花針茅為多年生叢生型旱生草本植物，是亞洲中部暖溫帶荒漠草原的代表植株，因荒漠草原生態(tài)環(huán)境脆弱，易受溫度、水分等環(huán)境因子的影響，生態(tài)穩(wěn)定性較差，作為內(nèi)蒙古荒漠草原的主要優(yōu)勢(shì)物種對(duì)荒漠草原生態(tài)穩(wěn)定性有著重要的作用，它返青早，是早春促進(jìn)家畜恢復(fù)體況的優(yōu)等牧草，具有十分重要的生態(tài)和飼用價(jià)值。因其生長(zhǎng)環(huán)境較為苛刻，對(duì)環(huán)境溫度、土壤可利用養(yǎng)分（氮素）等的變化敏感。在放牧等人為因素影響下，荒漠草原部分優(yōu)勢(shì)種如短花針茅（Stipabreviflora）、克氏針茅（Stipakrylovii）等優(yōu)勢(shì)度下降（黃琛，2015）。因此探究短花針茅生長(zhǎng)和發(fā)育過程對(duì)氣候變化及人為擾動(dòng)等因素響應(yīng)的分子機(jī)制尤為重要。通過前期對(duì)短花針茅響應(yīng)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，CRY基因家族在短花針茅生殖生長(zhǎng)過程中可能參與了對(duì)逆境的響應(yīng)，但仍缺乏有力的證據(jù)。本文通過對(duì)CRY基因克隆和表達(dá)規(guī)律的分析，來探究不同生態(tài)環(huán)境因子影響下隱花色素CRY1、CRY2 在短花針茅生長(zhǎng)發(fā)育中的響應(yīng)規(guī)律，以期為短花針茅生殖生長(zhǎng)對(duì)逆境響應(yīng)的分子機(jī)制研究提供有用的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)材料短花針茅取自內(nèi)蒙古四子王旗荒漠草原農(nóng)牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地（41°46′44″N，111°53′42″E），基地試驗(yàn)區(qū)土壤貧瘠，降雨少，晝夜溫差大，為典型的中溫帶大陸季風(fēng)氣候。本實(shí)驗(yàn)對(duì)野外長(zhǎng)期放牧處理下及增溫與施氮交互處理下的短花針茅進(jìn)行了取樣。增溫施氮樣地設(shè)置24 個(gè)小區(qū)，分對(duì)照（Ck）、施氮（N）、增溫（W）、增溫×施氮（WN）4 組。施氮組為每年降雨時(shí)期內(nèi)人工施加10 g·m?2·a?1NH4NO3，增溫處理通過在樣地上空2.25 m 處懸掛2 kW 紅外線輻射器實(shí)現(xiàn)，增溫施氮處理是在增溫小區(qū)內(nèi)同時(shí)進(jìn)行施氮處理。根據(jù)對(duì)短花針茅花發(fā)育各時(shí)期的觀察，于2022年4 月下旬至2022 年5 月下旬采集放牧處理和增溫施氮處理下短花針茅穎片突起期（YPQ）、小花突起期（XHQ）、授粉期（SFQ）生殖枝及葉片。剪取不同處理組中生長(zhǎng)良好的短花針茅生殖枝10支和10 叢短花針茅地上部分全部葉片，每種處理下3 次重復(fù)，分別用無(wú)菌水沖洗，錫箔紙包裹，液氮中速凍后保存于?80 ℃冰箱中。野生煙草種子由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 短花針茅總RNA 提取及StbCRY1和StbCRY2基因克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有增溫施氮處理下短花針茅花期差異基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，篩選到StbCRY1和StbCRY2基因的cDNA 序列片段設(shè)計(jì)引物，采用北京全式金植物總RNA 提取試劑盒提取短花針茅生殖枝總RNA，利用其反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 第一鏈合成，以短花針茅生殖枝的cDNA 為模板，用基因開放閱讀框特異性引物StbCRY1-F1/StbCRY1-R1和StbCRY2-F1/StbCRY2-R1（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用RACE 試劑盒的反應(yīng)體系進(jìn)行第一鏈的合成。取2 μL RNA 樣品、5′CDS Primer A/3′CDS Primer A 1.5 μL、SMART II.A oligo 1.5 μL 置于掌上離心機(jī)的離心管中，混合均勻；70 ℃水浴2 min；在冰上冷卻2 min；加入10×Buffer 1 μL、DTT（10 mmol·L?1）2.5 μL、dNTPMix（2.5 mmol·L?1）3.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL 混合均勻，在42 ℃ PCR 儀中放置1.5 h后取出，再加入EDTA Buffer 20 μL，在72 ℃ PCR儀中放置7 min，?20 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。以合成的5′RACE 第一鏈cDNA 為模板，利用StbCRY1和StbCRY2的5′-GSP1（表1）和試劑盒自帶的UPM引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將其擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍，以稀釋后的PCR 產(chǎn)物為模版，以試劑盒自帶引物UPM 以及StbCRY1和StbCRY2的5′-GSP2為引物（表1）進(jìn)行第2 次PCR 擴(kuò)增，以RACE 試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。目的片段和Blunt Simple克隆載體進(jìn)行連接，測(cè)序后，通過DNAMAN 軟件分析將5′和3′端的測(cè)序結(jié)果拼接在一起，并去除重疊的核苷酸堿基，獲得完整的短花針茅基因全長(zhǎng)序列。以反轉(zhuǎn)的5′RACE cDNA 為模板，用ORF 特異性 引 物StbCRY1-F/StbCRY1-R和StbCRY2-F/StbCRY2-R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，接著切膠回收純化，連接克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最后經(jīng)菌液PCR 檢測(cè)后將陽(yáng)性克隆送測(cè)序。

表1 擴(kuò)增引物序列及用途Table 1 The sequence and usages of the primers

1.2.2 StbCRY1、StbCRY2 序列分析

使用NCBI 在線ORF finder（https://www.ncbi.Nlm.nih.gov/orffinder/）工具將StbCRY1、StbCRY2核苷酸序列翻譯成氨基酸序列、用 Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白基本性質(zhì)分析、利用Sopma（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html ） 和Swiss-Mode（swissmodel.expasy.org/）在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析、利用MAGA6 構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 融合表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)StbCRY1和StbCRY2ORF 引物，引物序列StbCRY1-GFP-F/StbCRY1-GFP-R和StbCRY2-GFPF/StbCRY2-GFP-R見表1。根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：Biorun Pfu PCR Mix 25 μL，模板1 μL，Nuclease-free Water 20 μL；PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃32 s，循環(huán)數(shù)30；延伸：72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。測(cè)序無(wú)誤后用BsaI/Eco31I 內(nèi)切酶分別酶切目的序列和pBWA(V)HS 載體，之后將載體酶切物和目的序列酶切產(chǎn)物合并，一起用PCR 純化試劑盒純化，最后用T4 DNA 連接酶連接，獲得pBWA(V)HSStbCRY1-GFP 和pBWA(V)HS-StbCRY2-GFP 融合表達(dá)載體。將表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，于28 ℃培養(yǎng)2 d，將農(nóng)桿菌接于10mL YEB 液體培養(yǎng)基中，180 r·min?1培養(yǎng)1 h。后用4 000 r·min?1，離心4 min，將農(nóng)桿菌聚集在離心管底部，去上清，后用10 mmol·L?1MgCl2懸重懸菌體，調(diào)OD600 至0.6 左右。挑選生長(zhǎng)狀況良好的煙草植株，用1 mL 注射器從煙草葉片下表皮注射，培養(yǎng)2 d 后在激光共聚焦顯微鏡于488 nm 激發(fā)光下觀察。

1.2.4 熒光定量PCR

以克隆獲得的短花針茅StbCRY1和StbCRY2基因 cDNA 序列為模板設(shè)計(jì)引物StbCRY1-F2/StbCRY1-R2和StbCRY1-F2/StbCRY2-R2，利用短花針茅TLF基因?yàn)閮?nèi)參基因TLF-F/TLF-R（趙鴻彬等，2022）（表1）。

參照試劑盒說明書對(duì)不同處理的StbCRY1和StbCRY2基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表達(dá)分析。具體步驟為：模板是稀釋20 倍后的cDNA 第一鏈，PCR 體系10 μL，包括模板1 μL、Tip Green qPCR SuperMix 5 μL、Rnase-free Water 3.4 μL，冰上配制成混合液后混勻，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System）中反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)表達(dá)量計(jì)算方法（Livak et al.，2001）計(jì)算結(jié)果，每個(gè)樣品做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 StbCRY1 和StbCRY2 基因序列分析

StbCRY1和StbCRY2基因編碼蛋白ORF 框長(zhǎng)分別為2 695 bp 和2 176 bp（圖1、2），一級(jí)結(jié)構(gòu)特征見表2，二者編碼酸性蛋白質(zhì)，皆是親水蛋白質(zhì)。StbCRY1和StbCRY2蛋白保守結(jié)構(gòu)域，StbCRY1蛋白具有PhrB 結(jié)構(gòu)域和Cry-C 結(jié)構(gòu)域。StbCRY2蛋白具有PhrB 結(jié)構(gòu)域。

圖1 StbCRY1 基因ORF 及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 1 The ORF and deduced protein sequence of StbCRY1

圖2 StbCRY2 基因ORF 及推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 2 The ORF and deduced protein sequence of StbCRY2

表2 StbCRY1 和StbCRY2 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征Table 2 Structural characteristics of proteins encoded by StbCRY1 and StbCRY2 genes

利用Sopma 在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)StbCRY1和StbCRY2編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可知StbCRY1 出現(xiàn)α 螺旋結(jié)構(gòu)占比為40.49%、出現(xiàn)β 轉(zhuǎn)角為4.58%、出現(xiàn)無(wú)規(guī)線團(tuán)的占比為45.64%、出現(xiàn)伸展鏈的占比為9.30%?？芍猄tbCRY2 出現(xiàn)α 螺旋結(jié)構(gòu)可占比為36.45%、出現(xiàn)β 轉(zhuǎn)角占比為4.44%、出現(xiàn)無(wú)規(guī)線團(tuán)的占比為47.93%、出現(xiàn)伸展鏈的占比為11.18%。StbCRY1 和StbCRY2 編碼蛋白的空間構(gòu)象預(yù)測(cè)見圖3。

圖3 StbCRY1 和StbCRY2 蛋白的空間構(gòu)象預(yù)測(cè)Figure 3 Prediction of the soatial conformation of StbCRY1 and StbCRY2 proteins

2.2 StbCRY1 和StbCRY2 基因編碼蛋白進(jìn)化分析

為了解CRY1、CRY2 蛋白的進(jìn)化關(guān)系，將StbCRY1、StbCRY2 蛋白的氨基酸序列與大麥（Hordeuminnermongolicum）、小麥（Triticum aestivum）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）等植物蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明短花針茅CRY1 蛋白與野生二粒小麥（Triticumdicoccoides）和普通小麥（Triticumaestivum）處于同一分支，即三者CRY1 進(jìn)化關(guān)系較為相近，短花針茅CRY2 蛋白與大麥CRY2 蛋白親緣關(guān)系相近（圖4）。

圖4 StbCRY1、StbCRY2 與其他物種CRY 蛋白進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree of StbCRY with CRY1, StbCRY2 proteins from other plants species

2.3 StbCRY1 和StbCRY2 基因亞細(xì)胞定位分析

利用SoftBerry 在線預(yù)測(cè)StbCRY1、StbCRY2蛋白，結(jié)果表明StbCRY1 蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；StbCRY2 蛋白同樣定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。為了驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性，進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。利用轉(zhuǎn)入pBWA(V)HS-CRY1-Glosgfp 和pBWA(V)HS-CRY2-Glosgfp 的農(nóng)桿菌將StbCRY1、StbCRY2基因?qū)氲綗煵萑~片中進(jìn)行翻譯表達(dá)，后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。觀察結(jié)果如圖5、6所示，短花針茅StbCRY1 和StbCRY2 蛋白均定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖5 488 nm 激發(fā)光下StbCRY1 蛋白在煙草葉片中的表達(dá)情況Figure 5 Expression of StbCRY1 protein in tobacco leaves under 488 nm excitation light

圖6 488 nm 激發(fā)光下StbCRY2 蛋白在煙草葉片中的表達(dá)情況Figure 6 Expression of StbCRY2 protein in tobacco leaves under 488 nm excitation light

2.4 增溫施氮處理?xiàng)l件下StbCRY1 和StbCRY2 花期時(shí)空表達(dá)差異

2.4.1 同一花發(fā)育時(shí)期不同增溫施氮條件下StbCRY1和StbCRY2時(shí)空表達(dá)差異

在長(zhǎng)期增溫施氮處理環(huán)境下，短花針茅生殖枝中StbCRY1和StbCRY2在不同處理下變化差異較大（圖7）。YPQ 期StbCRY1僅在N 處理下顯著上調(diào)，StbCRY2在N 處理下顯著上調(diào)，而在W 處理下顯著下調(diào)；在XHQ，StbCRY1和StbCRY2表達(dá)總體上均顯著下調(diào)，變化趨勢(shì)一致，在WN 交互作用下表達(dá)量下降之最低；SFQ 期中，StbCRY1和StbCRY2表達(dá)趨勢(shì)也較為一致，與Ck 相比，二者在N 和W處理下表達(dá)量均顯著提高，WN 處理表達(dá)量均下調(diào)但差異不顯著。同時(shí)，在處理間，StbCRY1、StbCRY2在不同處理間存在相同表達(dá)趨勢(shì)，在N 處理下表達(dá)量最高，W 條件下次之，在WN 條件下降至最低（圖7）。

圖7 不同增溫施氮條件下生殖枝StbCRY1 和StbCRY2 同一花期表達(dá)差異Figure 7 Expression differences of StbCRY1 and StbCRY2 in reproductive branches at the same flower development stage under different temperature and nitrogen application conditions

增溫施氮處理下短花針茅營(yíng)養(yǎng)枝葉片中的StbCRY1與StbCRY2的表達(dá)模式與生殖枝中完全不同（圖8）。在YPQ 期中，與Ck 相比StbCRY1僅在W 處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，在處理間WN 處理下StbCRY1表達(dá)與W 處理下相反，StbCRY2同樣在W 處理表達(dá)量顯著上調(diào)，但在WN 處理下表達(dá)量極顯著下調(diào)，表達(dá)量在處理間呈現(xiàn)先顯著上調(diào)后極顯著下調(diào)的趨勢(shì)；在XHQ，StbCRY1、StbCRY2表達(dá)量整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，StbCRY1在幾個(gè)處理下均顯著下調(diào)，其中N 處理下下調(diào)最顯著，其次是WN 處理，最后為W 處理，StbCRY2在W、WN 條件下表達(dá)水平一致，表達(dá)量顯著低于N 處理和Ck；在SFQ，StbCRY1僅在W 處理下表達(dá)量極顯著下調(diào)，在Ck、N 處理、WN 處理下表達(dá)差異不顯著；StbCRY2表達(dá)量在W、WN 處理下顯著上調(diào)，在N 處理下差異不顯著（圖8）。

圖8 不同增溫施氮條件下營(yíng)養(yǎng)枝葉片StbCRY1 和StbCRY2 同一花期表達(dá)差異Figure 8 Expression differences of StbCRY1 and StbCRY2 in vegetative branch leaves leaves at the same flower development stage under different temperature and nitrogen application conditions

2.4.2 同一增溫施氮條件下不同花發(fā)育時(shí)期StbCRY1和StbCRY2時(shí)空表達(dá)差異

在長(zhǎng)期增溫施氮處理環(huán)境下，短花針茅生殖枝中StbCRY1和StbCRY2在花期的3 個(gè)發(fā)育階段下變化差異較大（圖9）。Ck 中與YPQ 相比，短花針茅生殖枝StbCRY1表達(dá)量先顯著上調(diào)后顯著下調(diào)；StbCRY2表達(dá)量整體呈下調(diào)趨勢(shì)，在SFQ 下調(diào)顯著。W 處理下，StbCRY1僅在SFQ 顯著上調(diào)，XHQ 表達(dá)量變化不顯著；StbCRY2表達(dá)量雖然都顯著低于YPQ，但隨花發(fā)育的推進(jìn)，表達(dá)呈現(xiàn)極顯著下調(diào)（XHQ）再上調(diào)（SFQ）的趨勢(shì)。

圖9 同一增溫施氮條件下不同花發(fā)育時(shí)期生殖枝StbCRY1 和StbCRY2 表達(dá)差異Figure 9 Expression differences of StbCRY1 and StbCRY2 in reproductive branches at different flower development stages under the same temperature and nitrogen application conditions

N 處理下，StbCRY1表達(dá)量整體呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)，并隨著花發(fā)育時(shí)間的推移持續(xù)上調(diào)，在SFQ表達(dá)量最高；StbCRY2在XHQ 期極顯著下調(diào)，而在SFQ 表達(dá)量與XHQ 相比顯著上調(diào)，但與YPQ 相比不顯著。此外，WN 處理下，StbCRY1表達(dá)量在3 個(gè)花發(fā)育的時(shí)期呈顯著的先下調(diào)再上調(diào)趨勢(shì)；StbCRY2整體表達(dá)量顯著下調(diào)，隨時(shí)期變化呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的變化（圖9）。

短花針茅營(yíng)養(yǎng)枝葉片中StbCRY1和StbCRY2在不同花發(fā)育階段表達(dá)模式明顯區(qū)別于生殖枝（圖10）。Ck 中，StbCRY1表達(dá)量在XHQ、SFQ 期顯著上調(diào)，與YPQ 比較而言，表達(dá)趨勢(shì)呈上調(diào)-下調(diào)趨勢(shì)；StbCRY2僅在XHQ 表達(dá)顯著上調(diào)，其余時(shí)期沒有顯著差異。W 處理下，StbCRY1在SFQ 期表達(dá)量顯著低于其余兩個(gè)時(shí)期；StbCRY2表達(dá)水平在XHQ 和SFQ 均顯著下調(diào)，在XHQ 表達(dá)量最低。N處理下，StbCRY1表達(dá)量隨短花針茅花發(fā)育的持續(xù)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，在花發(fā)育后期表達(dá)量最低；StbCRY2與之相反，在XHQ、SFQ 期表達(dá)量皆高于YPQ 期。WN 條件下，兩個(gè)基因在XHQ 期和SFQ 期表達(dá)水平皆顯著上調(diào)，StbCRY2在SFQ 表達(dá)量最高。

圖10 同一增溫施氮條件下不同花發(fā)育時(shí)期營(yíng)養(yǎng)枝葉片StbCRY1 和StbCRY2 表達(dá)差異Figure 10 Expression differences of StbCRY1 and StbCRY2 in vegetative branch leaves leaves at different flower development stages under the same temperature and nitrogen application conditions

3 討論

3.1 StbCRY1 和StbCRY2 序列特征

隱花色素CRY1、CRY2 通過對(duì)不同種類光照的感知來感受外界環(huán)境狀況，并通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)荒漠草原植物光形態(tài)的建成（李仕銘等，2018）。CRY1、CRY2 調(diào)控引起植物在合適時(shí)間生長(zhǎng)繁殖，是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的方式之一（王紅霞等，2017）。本研究中利用5′RACE 與PCR 技術(shù)克隆了短花針茅StbCRY1和StbCRY2基因，通過對(duì)其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，二者皆為酸性蛋白質(zhì)，StbCRY1與StbCRY2基因編碼蛋白都含有PhrB 結(jié)構(gòu)域。表明短花針茅StbCRY1 和StbCRY2 與禾本科小麥或玉米親緣關(guān)系最近，存在共同的起源。有研究顯示小麥TaCRY1 在洋蔥表皮細(xì)胞中出現(xiàn)類似的核積累（徐沛，2008），由此可見StbCRY1 蛋白與小麥TaCRY1 一樣，為藍(lán)光依賴的核漿穿梭蛋白。此外，本文發(fā)現(xiàn)StbCRY1 定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，其定位與大豆CRY1 蛋白一致（熊璐，2008）。

3.2 禁放牧處理對(duì)StbCRY1 和StbCRY2 表達(dá)的影響

3.3 StbCRY1 和StbCRY2 表達(dá)對(duì)增溫和施氮處理的響應(yīng)

對(duì)于絕大部分生長(zhǎng)在荒漠草原的植被，增溫會(huì)導(dǎo)致春季早花、秋季晚花，延長(zhǎng)生殖生長(zhǎng)期；同時(shí)草原上大部分物種物候期會(huì)對(duì)土壤中氮素含量增加產(chǎn)生積極響應(yīng)，適宜的氮素含量和溫度是短花針茅在合適的時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵（白春利等，2013）。本研究結(jié)果表明，在人工模擬不同增溫施氮條件下，開花前期處理組營(yíng)養(yǎng)枝葉片與生殖枝StbCRY1和StbCRY2表達(dá)量高于Ck 組，這是因?yàn)槠渑c短花針茅營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變及下胚軸的伸長(zhǎng)過程有關(guān)（Lin et al.，1996；蔣瑋琳等，2014）。在擬南芥研究發(fā)現(xiàn)中CRY2 在低溫環(huán)境下表現(xiàn)出高泛素化修飾，通過26S 蛋白酶體途徑被降解（Ma et al.，2021），但CRY 本身是否受到溫度調(diào)節(jié)尚不清楚。本文在對(duì)短花針茅的開花基因研究中發(fā)現(xiàn)，開花時(shí)StbCRY1、StbCRY2在3 種處理下表達(dá)量均下調(diào)，這表明其在光周期調(diào)控開花的過程中與開花相關(guān)基因產(chǎn)生拮抗作用，受到開花下游基因的抑制。之后在雌雄蕊形成期抑制作用消失，體現(xiàn)為表達(dá)量上升。在生殖枝中，N、W 分別處理與WN 共同施加處理相比，前者StbCRY1和StbCRY2表達(dá)量較高，表明N 和W 條件下StbCRY1和StbCRY2的響應(yīng)模式的變化是通過晝夜節(jié)律鐘的改變來適應(yīng)和調(diào)節(jié)逆境對(duì)短花針茅生長(zhǎng)發(fā)育的影響，而WN 交互處理中這種影響的效應(yīng)減弱，N 減弱了W 處理對(duì)植物生殖枝StbCRY1、StbCRY2表達(dá)的影響，反之亦然。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)短花針茅中的兩個(gè)基因StbCRY1和StbCRY2的克隆和表達(dá)分析，獲得各包含2 695 bp 和2 176 bp 的開放閱讀框。StbCRY1、StbCRY2蛋白主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。StbCRY1和StbCRY2基因?qū)ㄆ诤驮鰷厥┑幚憝h(huán)境的響應(yīng)因處理和開花時(shí)期的不同而存在顯著的差異，短花針茅生殖枝StbCRY1和StbCRY2的表達(dá)水平受W 和WN 處理的影響較大，并且在WN 處理下二者表達(dá)水平受開花時(shí)期的影響較強(qiáng)；營(yíng)養(yǎng)枝葉片中StbCRY1和StbCRY2主要對(duì)W 處理有較強(qiáng)明顯的響應(yīng)，在W處理下開花的不同時(shí)期表達(dá)都與Ck 表現(xiàn)出顯著的不同。本研究通過隱花色素StbCRY1、StbCRY2基因在放牧、氣候等環(huán)境變化下的響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步探究荒漠草原短花針茅的生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)氣候變化及人為干擾的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。