房 麗, 葉 婷, 劉 睿

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)多發(fā)于女性,是一種以機(jī)體多組織、多器官損傷為特征的自身免疫性疾病,其主要病理特征為B細(xì)胞異?；罨⒆陨砜贵w過度產(chǎn)生以及免疫復(fù)合物沉積[1]。目前,SLE主要根據(jù)患者臨床癥狀、體征、血清學(xué)指標(biāo)等進(jìn)行診斷,但SLE臨床表現(xiàn)復(fù)雜,早期診斷困難。深入研究SLE的發(fā)生機(jī)制,探尋能夠早期、快速診斷SLE并能夠評估SLE疾病活動度的客觀指標(biāo),對SLE的臨床診治具有重要意義[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種非編碼RNA分子,參與胚胎發(fā)育和分化、衰老和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程[3]。AC007278.2是近年發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其可通過順式和(或)反式調(diào)節(jié)方式參與Ⅰ型干擾素等細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控,影響SLE的發(fā)生、發(fā)展[4]。MX動力蛋白樣GTP酶2(MX dynamin-like GTPase 2,MX2)蛋白是動態(tài)蛋白GTP酶家族的成員,定位于核膜下方的異染色質(zhì)區(qū)域。研究表明,MX2能夠通過激活Toll樣受體,促進(jìn)炎癥相關(guān)通路的活化,在SLE的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。另外,鑒于補(bǔ)體C3、C4是評估SLE疾病發(fā)生和疾病活動度的重要生物標(biāo)志物[6],本研究通過檢測外周血AC007278.2、MX2表達(dá)水平,探討兩者與SLE疾病活動度及補(bǔ)體水平的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2018年11月至2020年2月武漢亞心總醫(yī)院及中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的SLE患者168例(SLE組)。其中男14例,女154例;年齡20～68(37.85±7.54)歲;體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)17.1～28.6(22.95±2.63)kg/m2。根據(jù)病史及體格檢查,合并口腔潰瘍48例,光過敏70例,漿膜炎44例。參考2002年干燥綜合征國際分類標(biāo)準(zhǔn)[7],繼發(fā)干燥綜合征41例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合SLE的診斷、分類標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)首次診治;(3)年齡>18歲;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性干燥綜合征等其他自身免疫性疾病;(2)合并感染、腫瘤等疾病;(3)近3個月有糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療史;(4)妊娠期或哺乳期婦女。選取同期于我院進(jìn)行健康體檢的健康人群80名作為對照組,其中男10名,女70名;年齡23～66(38.19±8.35)歲;BMI 18.3～28.8(23.14±2.54)kg/m2,均排除風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病及惡性腫瘤等。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)(批號:M201804-F027)。

1.2外周血AC007278.2、MX2 mRNA水平檢測 研究對象入院后次日抽取清晨空腹靜脈血5 ml,EDTA-K2抗凝劑抗凝。采用密度梯度法分離外周血單個核細(xì)胞:將3 ml淋巴細(xì)胞分離液加入到15 ml離心管中,加入全血后以1 000 r/min條件離心25 min。液體由上而下分為4層,即血漿層、單個核細(xì)胞層、中性粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞沉淀層。小心吸取單個核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入1 ml磷酸緩沖鹽溶液,反復(fù)吹打混勻待測。Trizol法提取外周血單個核細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用Narodrop2000(美國賽默飛)檢測RNA濃度和純度。通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法檢測AC007278.2、MX2 mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海華大公司設(shè)計、合成,引物序列見表1。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,70 ℃延伸30 s,變性退火延伸共40個循環(huán)。反應(yīng)體系:SYBR Premix 10 μl,上、下游引物各1 μl,cDNA 1 μl和雙蒸水7 ml。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算AC007278.2、MX2 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3臨床資料收集 (1)一般資料:性別、年齡、臨床表現(xiàn)等,通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集。(2)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):白細(xì)胞(white blood cells,WBC)、淋巴細(xì)胞、血小板(platelets,PLT)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4等。WBC、淋巴細(xì)胞、PLT及Hb采用日本希森美康公司Sysmex-XS-800i全自動血液分析儀進(jìn)行檢測。補(bǔ)體C3、C4水平采用Cobas e411全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套的試劑盒進(jìn)行測定。

1.4SLE疾病活動度判斷 于患者入院24 h內(nèi)進(jìn)行SLE疾病活動指數(shù)-2000(SLE disease activity index-2000,SLEDAI-2000)評分[9],以評估患者就診前10 d的疾病情況,內(nèi)容包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、關(guān)節(jié)、皮膚、漿膜、血液、全身癥狀等9個器官系統(tǒng)的共24項臨床指標(biāo),總分105分,分值越高提示疾病活動度越重。SLEDAI-2000評分≤4分為基本無活動(無活動組,n=42);5～9分為輕度活動(輕度活動組,n=45);10～14分為中度活動(中度活動組,n=42);≥15分為重度活動(重度活動組,n=39)。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較 SLE組AC007278.2、MX2水平高于對照組,補(bǔ)體C3、C4及WBC、淋巴細(xì)胞、PLT、Hb水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2不同SLE活動度組的臨床資料比較 四組AC007278.2、MX2,以及補(bǔ)體C3、C4水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SLE疾病活動度越重,AC007278.2、MX2水平越高,補(bǔ)體C3、C4水平越低。見表3。

表3 不同SLE活動度組的臨床資料比較

2.3SLE患者AC007278.2、MX2與補(bǔ)體C3、C4及SLEDAI-2000評分的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,SLE患者AC007278.2與補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.624,P<0.001;r=-0.712,P<0.001);MX2與補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.656,P<0.001;r=-0.723,P<0.001);AC007278.2、MX2與SLEDAI-2000評分呈正相關(guān)(r=0.662,P<0.001;r=0.789,P<0.001)。

2.4SLE疾病活動度影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果 以SLEDAI-2000評分為因變量,以AC007278.2、MX2、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析,結(jié)果顯示,AC007278.2、MX2與SLE疾病活動度呈正關(guān)聯(lián)(P<0.05),補(bǔ)體C3、C4與SLE疾病活動度呈負(fù)關(guān)聯(lián)(P<0.05)。見表4。

表4 SLE疾病活動度影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果

2.5SLE患者外周血AC007278.2、MX2水平與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 有繼發(fā)干燥綜合征的SLE患者外周血AC007278.2、MX2水平高于無繼發(fā)干燥綜合征者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。外周血AC007278.2、MX2水平與口腔潰瘍、光過敏、漿膜炎發(fā)生情況無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表5。

表5 168例SLE患者外周血AC007278.2、MX2水平與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果相對表達(dá)量]

3 討論

3.1SLE的病因及機(jī)制尚不清楚,目前認(rèn)為與遺傳、免疫及環(huán)境等因素有關(guān)。研究表明,SLE患者存在自身免疫耐受缺失,自身抗體與自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物沉積在機(jī)體組織造成損傷的同時,激活補(bǔ)體系統(tǒng)造成低補(bǔ)體血癥,表現(xiàn)為血清補(bǔ)體C3、C4水平降低,這是反映SLE疾病活動的重要指標(biāo)。深入研究SLE自身免疫反應(yīng)啟動的分子機(jī)制,有助于發(fā)現(xiàn)新的SLE診斷和治療靶點(diǎn)。有學(xué)者對外周血單個核細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行高通量測序,發(fā)現(xiàn)SLE患者,特別是重度活動度患者存在多種lncRNA異常表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致補(bǔ)體、干擾素等細(xì)胞因子表達(dá)異常,在SLE疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。

3.2lncRNA是長度超過200個核苷酸的RNA分子,其可作為信號或誘餌分子,參與先天性免疫及適應(yīng)性免疫細(xì)胞的發(fā)育成熟,維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。研究表明,lncRNA可通過調(diào)控表觀遺傳,影響組蛋白修飾狀態(tài),參與SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。AC007278.2是近年新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,可通過促進(jìn)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的激活及細(xì)胞因子的分泌,對多發(fā)性硬化等自身免疫疾病的復(fù)發(fā)有促進(jìn)作用[10]。本研究結(jié)果顯示,SLE患者外周血AC007278.2水平升高,且其表達(dá)與SLE疾病活動度呈正相關(guān),提示AC007278.2參與SLE的發(fā)病及疾病活動。分析其機(jī)制,可能與AC007278.2促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。AC007278.2能夠通過抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到CC類趨化因子受體7(chemokine CC motif receptor 7,CCR7)基因的啟動子區(qū)域,進(jìn)而抑制CCR7的表達(dá)[4],而CCR7表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致輔助性濾泡T細(xì)胞分化障礙及B細(xì)胞成熟障礙,白介素21過度分泌,促進(jìn)SLE的發(fā)生和疾病活動[11]。本研究結(jié)果顯示,AC007278.2與補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān)。Chen等[12]研究表明,AC007278.2表達(dá)升高會激活Th1細(xì)胞,促進(jìn)干擾素γ的分泌,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化,促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生獨(dú)特性自身抗體,包括IgG2a和IgG3等,進(jìn)一步激活補(bǔ)體系統(tǒng),參與促進(jìn)狼瘡性腎炎的發(fā)生。因此認(rèn)為AC007278.2可能是通過補(bǔ)體系統(tǒng)參與SLE的發(fā)生和進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,SLE患者外周血AC007278.2水平與繼發(fā)干燥綜合征發(fā)生有關(guān)。分析原因可能是AC007278.2表達(dá)升高下調(diào)CCR7表達(dá),導(dǎo)致唾液腺體中趨化因子配體19高表達(dá)而激活B淋巴細(xì)胞,從而促進(jìn)干燥綜合征等自身免疫性疾病的發(fā)生[13]。

3.3MX2編碼基因位于21q22.3,編碼蛋白位于細(xì)胞核,屬于GTP酶的動態(tài)蛋白樣家族成員,是一種對多種RNA和DNA病毒具有抑制活性的干擾素刺激基因,參與病毒感染及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生、發(fā)展[5,14]。本研究結(jié)果顯示,SLE患者外周血MX2水平升高,且與SLE疾病活動度呈正相關(guān)。分析其機(jī)制,可能是MX2表達(dá)升高通過激活NOD樣受體信號通路促進(jìn)SLE的發(fā)生和進(jìn)展。Meng等[5]研究顯示,MX2高表達(dá)的SLE患者存在NOD樣受體信號通路過度激活的現(xiàn)象。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3過度激活可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中NOD樣受體2的表達(dá),促進(jìn)白介素10、白介素4等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,加重SLE的病情[15-16]。也有研究發(fā)現(xiàn),MX2主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞中,通過增加組織中性粒細(xì)胞浸潤和過度活化,導(dǎo)致活性氧、顆粒蛋白酶等細(xì)胞毒內(nèi)容物釋放到宿主組織,造成血管等局部組織損害,促進(jìn)SLE進(jìn)展[5,17]。本研究中,MX2與補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān),提示MX2表達(dá)升高可能與補(bǔ)體系統(tǒng)激活有關(guān)。SLE患者存在Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)的現(xiàn)象,干擾素γ1b與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合,不僅能夠上調(diào)MX2等干擾素刺激基因的表達(dá),還能夠激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng),造成自身免疫性病理損傷[18]。研究表明,活動性SLE患者中Ⅰ型干擾素能夠誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞中MX2表達(dá),而MX2通過與寡腺苷酸合成酶2相互作用促進(jìn)SLE的發(fā)生和進(jìn)展[5,19]。本研究結(jié)果還顯示,SLE患者M(jìn)X2的表達(dá)水平與繼發(fā)干燥綜合征發(fā)生有關(guān)。分析其原因認(rèn)為,MX2能夠與干擾素調(diào)節(jié)因子7相互作用,促進(jìn)唾液腺導(dǎo)管中巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中Toll樣受體7的激活,導(dǎo)致繼發(fā)干燥綜合征的發(fā)生[20-21]。本研究多元線性回歸分析結(jié)果顯示,血清補(bǔ)體C3、C4是影響SLE疾病活動度的獨(dú)立因素,與既往研究結(jié)論相似[22],提示檢測SLE患者血清補(bǔ)體C3、C4有助于評估SLE疾病活動度。

綜上所述,SLE患者外周血AC007278.2、MX2水平升高,與SLE患者的疾病活動度及補(bǔ)體C3、C4水平存在相關(guān)性,可用于評估SLE的進(jìn)展情況,但其作用的具體分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。