祁江峽, 李海燕, 劉 洋, 陳 冬

腦卒中是全球第二大死亡原因和第三大殘疾原因[1],分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種亞型。其中急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是由于腦血管血栓形成導(dǎo)致腦缺血而發(fā)生,占腦卒中總發(fā)病率的87%[2]。重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)靜脈溶栓是目前臨床上實(shí)現(xiàn)AIS患者閉塞血管再通最有效的方法之一。然而,靜脈溶栓后的出血轉(zhuǎn)化可增加AIS患者的死亡風(fēng)險(xiǎn),病死率為8.5%～30.0%,其中2.1%～9.4%為癥狀性腦出血(symptomatic cerebral hemorrhage,sICH)[3-4]。sICH與患者較差的功能預(yù)后和殘疾風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5],因此,識(shí)別靜脈溶栓治療后AIS患者sICH的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有重要的臨床意義。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxic inducible factor-1α,HIF-1α)是體內(nèi)低氧轉(zhuǎn)錄因子,具有重建局部微循環(huán)、調(diào)控低氧損傷的功能,在腦缺血時(shí)能減少腦組織損傷[6]。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α在蛛網(wǎng)膜下腔后皮質(zhì)出血后6 h內(nèi)迅速升高并達(dá)到峰值,提示HIF-1α可能參與了蛛網(wǎng)膜下腔后皮質(zhì)出血的早期腦損傷的病理進(jìn)程[7]。本研究分析了AIS患者靜脈注射rt-PA治療前血清HIF-1α水平與治療后sICH發(fā)生及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性,以期為臨床提供有助于改善AIS患者預(yù)后的新型生物學(xué)標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2019年1月至2021年2月我院收治的AIS患者229例,均在發(fā)病4.5 h內(nèi)接受rt-PA治療。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]中關(guān)于AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)CT血管造影(computed tomography angiography,CTA)或磁共振血管造影(magnetic resonance angiography,MRA)證實(shí);(2)年齡18～85歲;(3)美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)評(píng)分≥4分;(4)腦卒中癥狀出現(xiàn)時(shí)間>30 min。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并顱內(nèi)腫瘤、動(dòng)脈瘤等惡性腫瘤者;(2)合并感染性疾病或處于感染潛伏期者;(3)合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全者;(4)既往3個(gè)月內(nèi)有腦卒中病史,同時(shí)伴有明顯神經(jīng)功能缺損癥狀者;(5)有聯(lián)合機(jī)械取栓術(shù)或溶栓治療史者。本研究嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》進(jìn)行,獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):2019-027),患者或其親屬知情同意。

1.2rt-PA治療方法 患者均接受靜脈注射rt-PA治療,劑量為0.6～0.9 mg/kg(最大劑量為90 mg)。將rt-PA溶于100 ml生理鹽水中,其中10%在最初1 min內(nèi)靜脈推注,其余90%在隨后1 h內(nèi)持續(xù)靜脈滴注完畢,于神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care Unit,ICU)進(jìn)行觀察。rt-PA給藥后24 h內(nèi)嚴(yán)禁使用抗血栓藥物,包括阿司匹林、氯吡格雷、替羅非班、替格瑞洛、肝素或低分子肝素、華法林等。

1.3血清HIF-1α水平檢測(cè) 于治療前采集患者肘部靜脈血5 ml,以3 000 r/min離心10 min,取上層血清,-80 ℃保存待檢。采用夾心式酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清HIF-1α水平,試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4臨床資料收集 (1)一般臨床資料,包括年齡、性別、吸煙史、合并病史(高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病、心房顫動(dòng)、既往腦卒中)以及抗血栓或抗凝藥物史等。(2)發(fā)病至溶栓時(shí)間、rt-PA治療前血壓。(3)入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果,包括空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、凝血酶原時(shí)間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio of prothrombin time,PT-INR)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)。其中FBG、SCr及血脂指標(biāo)采用日立7060自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè),試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司;PT、PT-INR等凝血指標(biāo)采用希森美康CS-5100凝血分析儀及其配套試劑進(jìn)行檢測(cè);HbA1c水平采用普門糖化血紅蛋白分析儀H9進(jìn)行檢測(cè),試劑盒購自德國羅氏公司。(4)治療前NIHSS評(píng)分。

1.5sICH評(píng)判及分組 以rt-PA治療后36 h內(nèi)NIHSS評(píng)分增加>4分,且在腦部非對(duì)比CT掃描中觀察到血腫定義為sICH[9]。本研究將發(fā)生sICH的AIS患者納入sICH組(25例),未發(fā)生sICH的AIS患者納入非sICH組(204例)。

1.6治療預(yù)后評(píng)估 于治療后3個(gè)月使用改良Rankin量表(modified Rankin Scale,mRS)評(píng)分評(píng)估患者預(yù)后,以mRS 0～1分為預(yù)后良好,mRS≥2分為預(yù)后不良[10]。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料比較 sICH組患者入院時(shí)NIHSS評(píng)分、FBG和HIF-1α水平均高于非sICH組,且合并糖尿病和既往有腦卒中史的人數(shù)比例較非sICH組更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2AIS患者血清HIF-1α水平與臨床及病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 血清HIF-1α水平與AIS患者NIHSS評(píng)分、梗死體積存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。見表2。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平與NIHSS評(píng)分(rs=0.201,P<0.001)和梗死體積(rs=0.191,P=0.001)呈正相關(guān)。

2.3血清HIF-1α水平對(duì)AIS患者發(fā)生sICH的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平具有預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生sICH的應(yīng)用價(jià)值[AUC(95%CI)=0.886(0.815～0.957),P<0.001],最佳截?cái)嘀禐?.96 ng/ml,其對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為88.0%、78.4%。見圖1。

圖1 血清HIF-1α水平預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生sICH的ROC曲線圖

2.4溶栓前血清HIF-1α水平與sICH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的Cox回歸分析結(jié)果 根據(jù)ROC曲線分析得到的最佳截?cái)嘀祵IS患者分為血清HIF-1α低水平組(<1.96 ng/ml,n=163)和血清HIF-1α高水平組(≥1.96 ng/ml,n=66)。以sICH發(fā)生情況為因變量進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,溶栓前血清HIF-1α≥1.96 ng/ml是AIS患者發(fā)生sICH的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。多變量調(diào)整樣條回歸分析結(jié)果顯示,sICH風(fēng)險(xiǎn)與溶栓前血清HIF-1α水平呈正線性劑量-反應(yīng)關(guān)系(線性P=0.025,非線性P=0.828)。見圖2。

圖2 多變量調(diào)整樣條回歸分析結(jié)果圖

表3 溶栓前血清HIF-1α水平與sICH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的Cox回歸分析結(jié)果

2.5血清HIF-1α水平與AIS患者rt-PA治療預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 經(jīng)rt-PA治療,預(yù)后良好者68例(29.69%),預(yù)后不良者161例(70.31%)。預(yù)后良好AIS患者的血清HIF-1α水平顯著低于預(yù)后不良者[1.26(0.91,1.85)ng/ml vs 1.63(1.26,2.21);Z=-2.382,P=0.017]。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平與患者治療后的mRS評(píng)分呈正相關(guān)(rs=0.137,P=0.038)。經(jīng)校正年齡、性別、吸煙史、合并癥史等混雜因素后,多元線性逐步回歸分析結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平是影響AIS患者治療后mRS評(píng)分的獨(dú)立因素(t=2.069,β=0.324,P=0.026)。

3 討論

3.1腦卒中通常表現(xiàn)為突發(fā)的急性神經(jīng)癥狀,入院后及時(shí)恢復(fù)正常血流是決定腦卒中患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[11]。臨床救治措施以盡快提供靜脈溶栓治療為主,雖然血管內(nèi)治療的應(yīng)用前景廣闊,但rt-PA靜脈溶栓仍是發(fā)病4.5 h內(nèi)AIS患者的首選及基礎(chǔ)治療方法,可降低病死率,改善預(yù)后。然而,溶栓后由于缺血進(jìn)展、出血轉(zhuǎn)化或腦水腫,約10%的患者可出現(xiàn)早期神經(jīng)系統(tǒng)惡化,加之rt-PA靜脈給藥增加了sICH的風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致高病死率和較差的功能結(jié)局[12-13]。靜脈內(nèi)rt-PA通過將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶,進(jìn)而將纖維蛋白降解為纖維蛋白分裂產(chǎn)物來產(chǎn)生局部溶栓作用。據(jù)報(bào)道,靜脈給予rt-PA可能會(huì)導(dǎo)致凝血障礙、血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞,從而誘發(fā)sICH[14]。

3.2本研究納入了229例AIS患者,根據(jù)rt-PA治療后36 h內(nèi)的NIHSS評(píng)分和CT掃描結(jié)果,共確診25例患者發(fā)生sICH,通過比較分析后發(fā)現(xiàn),sICH組患者入院時(shí)NIHSS評(píng)分、FBG和HIF-1α水平均較高,提示HIF-1α水平可能作為預(yù)測(cè)sICH發(fā)生的生物標(biāo)志物。HIF-1α是核轉(zhuǎn)錄因子之一,其參與缺氧因子表達(dá)的調(diào)控。作為轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1α可以激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,提升組織細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧的適應(yīng)能力[15]。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α在急性缺血性腦卒中后1 h升高,可作為腦缺血性神經(jīng)元損傷嚴(yán)重程度和恢復(fù)的標(biāo)志物;另一方面,抑制HIF-1α可減少AIS誘導(dǎo)的BBB損傷,并且在體外和體內(nèi)激活HIF-1α的藥物或分子被證明在小鼠腦缺血模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。為了明確HIF-1α在sICH中的作用,本研究結(jié)果顯示NIHSS評(píng)分及梗死體積較大的患者血清HIF-1α水平顯著升高,進(jìn)一步的Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平與AIS患者基線NIHSS評(píng)分及梗死體積呈正相關(guān)性,提示血清HIF-1α表達(dá)與NIHSS評(píng)分、梗死體積的進(jìn)展密切相關(guān),且高血清HIF-1α水平的AIS患者在靜脈溶栓后更容易發(fā)生sICH,這與既往研究結(jié)論相符[18]。ROC曲線分析結(jié)果提示血清HIF-1α水平對(duì)AIS患者發(fā)生sICH具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。分析原因認(rèn)為,因血腫占位效應(yīng)影響以及腦血管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能異常,使血腫周邊腦組織發(fā)生缺氧、缺血,刺激HIF-1α合成增加,進(jìn)而加速神經(jīng)功能的損傷并增加梗死灶面積[19]。因此,HIF-1α不僅與sICH發(fā)生有關(guān),也與患者不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),這在本研究中得到驗(yàn)證。

3.3HIF-1α可通過調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷后腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘餌受體1的表達(dá)來介導(dǎo)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[20]。然而,He等[21]的研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α在參與細(xì)胞對(duì)急性腦損傷的反應(yīng)中具有“雙刃劍”效應(yīng)。HIF-1α介導(dǎo)參與神經(jīng)發(fā)生、血管生成、細(xì)胞增殖、紅細(xì)胞生成和細(xì)胞代謝等多種相關(guān)基因的表達(dá),還參與細(xì)胞死亡、適應(yīng)性反應(yīng)和細(xì)胞再生,增加其對(duì)缺血性應(yīng)激的適應(yīng)性,從而顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。然而,HIF-1α在腦缺血性損傷中也具有傷害作用,包括參與嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡以及AIS后BBB損傷等,這提示HIF-1α可能是神經(jīng)炎癥介質(zhì),從而影響B(tài)BB的通透性[21]。Cai等[22]的研究顯示,血清HIF-1α水平與腦內(nèi)出血患者嚴(yán)重程度及不良預(yù)后相關(guān),且認(rèn)為血清HIF-1α水平與腦損傷嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián)性可能不依賴于HIF-1α的功能。Amalia等[17]證實(shí)了HIF-1α水平與缺血性病變嚴(yán)重程度相關(guān),可用于預(yù)測(cè)AIS患者的臨床結(jié)局,HIF-1α水平越高,患者結(jié)局越差。本研究結(jié)果顯示,血清HIF-1α水平與患者治療后mRS評(píng)分呈正相關(guān),且預(yù)后良好AIS患者的血清HIF-1α水平更低,并通過校正混雜因素進(jìn)一步明確了較高血清HIF-1α水平與AIS患者不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述,rt-PA靜脈溶栓前血清HIF-1α水平升高是AIS患者繼發(fā)sICH的危險(xiǎn)因素,且高血清HIF-1α水平也預(yù)示AIS患者短期預(yù)后不良。但是,腦缺血后HIF-1α水平可能依賴于缺血持續(xù)時(shí)間,后續(xù)研究可進(jìn)一步動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清HIF-1α水平在AIS及sICH疾病進(jìn)程中的變化。