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        氣相色譜法檢測R-3- 氨基丁醇的研究

        2023-08-08 10:21:52劉麗榮王曉茹穆玉敏張浩月楊夢茜任麗梅
        煤炭與化工 2023年6期
        關(guān)鍵詞:檢測

        劉麗榮,王曉茹,穆玉敏,張浩月,楊夢茜,劉 東,任麗梅

        (1.美邦美和生物科技有限公司,河北 石家莊 050000;2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院,河北 石家莊 050035;3.河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北 石家莊 050035)

        0 引 言

        R-3- 氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol) 是一種氨基醇類化合物,在有機合成和藥物生產(chǎn)過程中用途廣泛。在1977 年,報道R-3- 氨基丁醇是4-甲基環(huán)磷酰胺的關(guān)鍵中間體,而后者是抗腫瘤藥物的抑制劑。

        Tetrahed. Lett 報道R-3- 氨基丁醇可以衍生合成β- 內(nèi)酰胺,進一步合成具有碳青霉烯類結(jié)構(gòu)的抗生素;Drugs 報道在抗艾滋病藥物度魯特韋抑制劑的合成過程中,R-3- 氨基丁醇是其關(guān)鍵的中間體。近年來,世界艾滋病和腫瘤類疾病的增長蔓延已經(jīng)引起各國政府和相關(guān)國際機構(gòu)的關(guān)注和重視,相關(guān)防治措施和醫(yī)療方法需求的迫切性也使R-3- 氨基丁醇相關(guān)產(chǎn)品的合成研究和用途開發(fā)成為市場前景的課題之一。

        作為一種手性氨基醇類,早期的氨基醇類物質(zhì)主要以天然的氨基酸為原料還原得到。目前,合成R-3- 氨基丁醇的方法主要有硼氫化物還原法,以酒石酸為拆分劑的拆分法和以釕碳等為誘導(dǎo)劑的化學(xué)誘導(dǎo)法,以及近年來興起的以各種酶為核心的生物催化、基因轉(zhuǎn)移等合成方法。

        目前,工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品大多來源于化學(xué)合成,因資源環(huán)境和持續(xù)發(fā)展等系列問題,生物法的相關(guān)產(chǎn)品研究也在逐步走向市場。R-3- 氨基丁醇產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量參差不齊,這對于合成最終產(chǎn)品的品質(zhì)及生產(chǎn)成本有著很重要的影響,因此,建立一種準確而高效的氨基丁醇的檢測方法顯得尤為重要。

        目前,氨基醇類的檢測方法主要有薄層層析法、液相色譜法和氣相色譜法等。早期的薄層色譜層析法,由于手工操作較多,人為因素導(dǎo)致定量和重現(xiàn)性較差。而R-3- 氨基丁醇本身沒有紫外吸收,應(yīng)用最廣泛的液相紫外檢測器檢測時通常采用HPLC- 衍生法,衍生過程通常存在步驟繁瑣、定性困難、定量準確性差等一系列問題。常用的氣相色譜檢測醇類物質(zhì)成分時,一般使用揮發(fā)性溶劑,也存在定量誤差。

        本文針對氣相色譜法中揮發(fā)性溶劑等特點,采用氣相色譜內(nèi)標法,選用用途廣泛的氫火焰離子化檢測器(FID),檢測時樣品用量少,定量檢測時不需要衍生處理,方法的靈敏度、準確度和精密度普遍較高,操作簡單方便。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        (1) R-3- 氨基丁醇對照品:95%,上海麥克林化學(xué)試劑有限公司。

        (2) 含R-3- 氨基丁醇的供試樣品:美和生物技術(shù)有限公司。

        (3) 正丁醇:色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

        (4) 甲醇:色譜純,天津市康科德科技有限公司。

        (5) 其他試劑均為分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠。

        1.2 儀器設(shè)備

        (1) 氣相色譜儀:8860 型,配有氫火焰離子化檢測器(FID),美國Agilent 公司。

        (2) 電子分析天平:FA1004A 型,上海精天電子儀器有限公司。

        2 實驗內(nèi)容

        2.1 色譜條件

        (1) 色譜柱:KB-624 石英毛細管柱,60 m×0.32 mm×1.8 μm。

        (2) FID 檢測器溫度:280 ℃。

        (3) 進樣口溫度:250 ℃。

        (4) 柱溫條件:初溫50 ℃,保持6 min,以10 ℃/min 的速度升溫至220 ℃,并保持5 min。

        (5) 柱流速(N2):1.0 mL/min。

        (6) 氫氣流速:30 mL/min。

        (7) 空氣流速:400 mL/min。

        (8) 進樣量:1 μL。

        (9) 分流比:20∶1,分流進樣。

        2.2 對照品溶液制備

        準確稱取4.341 6 g R-3- 氨基丁醇對照品,用無水甲醇溶解,并定容至25.0 mL,混勻,此對照品溶液中R-3- 氨基丁醇的濃度為165.0 mg/mL。

        2.3 供試樣品測定

        2.3.1 供試樣品配制

        根據(jù)供試樣品中含有R-3- 氨基丁醇組分的含量(檢測濃度在線性范圍內(nèi)),準確稱取適量樣品試液,加入10 mL 容量瓶中,再加入0.5 mL 正丁醇內(nèi)標,用甲醇稀釋并定容,吸取稀釋液,按照2.1 色譜條件,進氣相色譜儀檢測,進樣量為1.0 μL。

        2.3.2 結(jié)果計算

        供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量X 的計算公式為:

        式中:X 為供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量,mg/g;C 為對照品R-3- 氨基丁醇的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為供試樣品的稀釋定容體積,mL;A 為供試樣品中R-3- 氨基丁醇的峰面積,mAu×s;As 為供試樣品中內(nèi)標正丁醇的峰面積,mAu×s;m 為供試樣品質(zhì)量,g;f 為供試樣品的稀釋倍數(shù)。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 色譜柱的選擇

        R-3- 氨基丁醇在使用型號為DB-1、DB-5、KB-624 和DB-1701 等色譜柱檢測時,均可出峰,綜合考慮實驗室資源共用情況,選用KB-624(60 m×0.32 mm×1.8 μm) 毛細柱,能將供試樣品中R-3- 氨基丁醇和其他幾種組分以及內(nèi)標物完全分開,且峰形對稱,各組分的分析時間分布合理。

        3.2 分流比的選擇

        根據(jù)氣相色譜分析原理特點,進樣時適當(dāng)?shù)姆至鞅瓤筛纳品逍?。本實驗依次選擇分流比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1,分別進樣后發(fā)現(xiàn),隨著分流比的增加,色譜峰寬度變窄,峰的分離效果越好,但相應(yīng)檢測器的響應(yīng)信號降低,峰面積減小。

        在分流比20∶1 時,各組分之間能完全分離,為提高響應(yīng)值,因此,本實驗檢測條件選定分流比為20∶1。

        3.3 溶劑的選擇

        供試樣品測定過程中,由于對照品線性范圍的限制及樣品濃度的未知性,需要配制標準溶液或稀釋樣品。

        由于測試樣品中可能含有乙醇、乙酸乙酯及四氫呋喃等成分,故選用性質(zhì)相似、沸點低且成本不高的甲醇來配制對照品溶液,稀釋供試樣品,出峰快,且不與產(chǎn)品中的其他溶劑雜質(zhì)混淆,直觀定性供試樣品中溶劑殘留情況。

        對照品和溶劑的氣相色譜圖如圖1 所示。

        圖1 對照品和溶劑的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of reference substance and solvent

        3.4 柱溫的探討

        R-3- 氨基丁醇化合物的沸點相對較高,若柱溫太低,汽化可能不完全,且峰型不好;若初始溫太高,則供試樣品中低沸點的成分易隨甲醇溶劑一起流出,不易分離。

        因此,選擇初溫為50 ℃,保持6 min,以每分鐘10 ℃的速度升溫至220 ℃,并保持5min。選擇上述色譜柱溫條件,能使供試樣品中R-3- 氨基丁醇和其他各組分完全分離,色譜峰型良好,且分析時間控制在<30 min。

        3.5 定量方法選擇

        由于氣相檢測物質(zhì)大多屬于揮發(fā)性組分,且氣相色譜儀FID 檢測器屬于質(zhì)量型檢測器,在定量檢測時,各組分峰面積隨著進樣量的不同而變化,為改善因溶劑揮發(fā),進樣量重復(fù)性和儀器穩(wěn)定性變化帶來的誤差,在供試樣品檢測過程中,分別選用外標法(ESTD)和內(nèi)標法(ISTD) 進行比較。

        ESTD 和ISTD 比較的結(jié)果見表1。

        表1 ESTD 和ISTD 的比較Table 1 Comparison of ESTD and ISTD

        由表1 可以看出,外標法測定供試樣品得到的RSD 值分別為2.75%和2.17%,而內(nèi)標法的RSD值分別為0.46%和0.94%,應(yīng)用內(nèi)標法計算結(jié)果的精密度明顯略勝一籌。

        在內(nèi)標物的選擇中,比較甲基叔丁基醚、異丙醇和正丁醇等幾種化學(xué)試劑,其中,正丁醇的一些物理化學(xué)性質(zhì),色譜峰峰型與目標物R-3- 氨基丁醇相似,出峰位置靠近,是此檢測實驗中的合適內(nèi)標物。

        3.6 線性關(guān)系、檢測限和定量限

        依次吸取R-3- 氨基丁醇對照品溶液0.30、0.60、1.25、2.00、2.50、3.75 和6.00 mL,移入10 mL 容量瓶中,分別加入0.50 mL 正丁醇內(nèi)標,用甲醇稀釋并定容,混勻后分別進樣。

        以R-3- 氨基丁醇的質(zhì)量與內(nèi)標物質(zhì)量比值為橫坐標(X),對照品與內(nèi)標物的峰面積比值作為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=0.102 6X-0.199 3,R2=0.999 2。

        結(jié)果表明,該方法R-3- 氨基丁醇濃度在5.0 ~99.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。分別以3.3 倍和10 倍標準偏差和與標準曲線斜率的比值的響應(yīng)為方法的檢測限(LOD) 和定量限(LOQ),得 到LOD 為0.50 mg/mL,LOQ 為1.52 mg/mL。

        3.7 專屬性和系統(tǒng)適應(yīng)性

        分別精密吸取R-3- 氨基丁醇的空白溶劑、對照品溶液和供試樣品溶液,按照2.1 色譜條件進行試驗,測得R-3- 氨基丁醇保留時間為22.5 min,內(nèi)標正丁醇保留時間為17.5 min,分離效果良好,空白樣品在定性保留時間附近無雜質(zhì)干擾峰,專屬性和實驗系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

        空白、對照品和供試樣品的氣相色譜圖如圖2所示。

        圖2 空白、對照品和供試樣品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of the blank,reference substance and sample

        3.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性

        準確稱取同一批次供試樣品6 份,按照2.3 的方法進行處理、檢測,計算得到R-3- 氨基丁醇的平均值為936.9 mg/g,RSD 值為0.42%。實驗結(jié)果表明,該方法的重復(fù)性良好。

        取另一供試樣品,在0、2、4、6、12、24 h進樣測定,樣品每次進樣后4 ℃保存,進樣前30 min 置于室溫,檢測結(jié)果見表2。

        表2 穩(wěn)定性的測定結(jié)果(n=6)Table 2 Determination result of stability (n=6)

        由表2 可以看出,含R-3- 氨基丁醇的供試樣品含量的RSD<2.0%,表明該測試樣品在4 ℃的條件存儲下,24 h 內(nèi)主成分含量變化不大,穩(wěn)定性良好。

        3.9 精密度和準確度

        準確稱取同一供試樣品的前期、中期、后期以及殘液各3 份,置于10 mL 容量瓶中,分別加入1、2 和5 mLR-3- 氨基丁醇對照品,按照2.3.1 制備不同濃度的供試樣品溶液,每個濃度設(shè)置6 個平行,按照2.1 色譜條件和2.3 供試樣品檢測進行測定,結(jié)果見表3。

        表3 回收率的測定結(jié)果(n=6)Table 3 Determination result of recovery rate(n=6)

        由表3 可以看出,通過不同加標濃度測得樣品的回收率為95.2%~99.7%,RSD 值為0.13%~0.97%,表明該方法的準確度和精密度良好,符合藥典中回收率限度和精密度規(guī)定。

        3.1 0 供試樣品的檢測

        分別取實驗生產(chǎn)中初期、中期、后期以及處理殘液的供試樣品,按2.3 方法制備并檢測R-3- 氨基丁醇的含量,檢測結(jié)果見表4。

        表4 供試樣品的測定結(jié)果Table 4 Determination results of the test samples

        由表4 可以看出,供試樣品中R-3- 氨基丁醇含量反應(yīng)初期較少,隨著時間推移,含量增加,而處理殘液中的R-3- 氨基丁醇大部分已提取完成。整個測定結(jié)果及時準確監(jiān)測了反應(yīng)過程中和成品中R-3- 氨基丁醇的含量。

        4 結(jié) 語

        本文采用氣相色譜內(nèi)標法檢測R-3- 氨基丁醇,供試樣品取樣方便,不需要衍生等復(fù)雜前處理,試樣中目標物和幾種溶劑分離完全。測試方法操作方便,分析結(jié)果的準確性和精密度符合藥典相關(guān)標準規(guī)定。

        本方法對由化學(xué)法或生物法等制備的樣品均可檢測分析,可應(yīng)用于制備生產(chǎn)過程中含R-3- 氨基丁醇樣品的跟蹤分析和成品的測定。

        該方法檢測實施過程中還有一些待改進的地方,如由于受色譜柱等實驗條件的限制,R-3- 氨基丁醇和其異構(gòu)體的分離檢測還需驗證和優(yōu)化;生產(chǎn)反應(yīng)過程中,R-3- 氨基丁酸或羰基醇等底物的剩余量同時監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化過程等。

        將通過更多試驗,優(yōu)化更新檢測條件,能同時定性定量檢測反應(yīng)底物的濃度以及分離檢測手性異構(gòu)體等,讓R-3- 氨基丁醇的過程監(jiān)測和成品驗收簡單化、一步化。

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