蘇凱奇，呂轉(zhuǎn)，吳明莉，羅萌，高靜，聶晨晨，劉昊，馮曉東，*

腦卒中是我國(guó)人口壽命年減少的首要病因，缺血性腦卒中約占其中的87%［1-2］。腦卒中患者常存在不同程度的功能障礙，其中約2/3的患者出現(xiàn)執(zhí)行功能/注意力、記憶、視空間等至少1 個(gè)領(lǐng)域的認(rèn)知功能下降，嚴(yán)重影響患者的依從性和整體康復(fù)［3-4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，神庭和百會(huì)是針刺治療腦卒中后認(rèn)知障礙常用的穴位［5］，同時(shí)電針神庭、百會(huì)能夠有效改善卒中后患者認(rèn)知功能，提高生活自理能力［6-7］，然而具體的作用機(jī)制仍需深入研討。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、成熟，在維持神經(jīng)元存活、增加神經(jīng)遞質(zhì)的合成中具有重要作用［8-9］。BDNF 與其特異性受體酪氨酸激受體B（TrkB）結(jié)合后，可激活下游磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，與細(xì)胞凋亡、自噬、突觸可塑性密切相關(guān)［8，10-11］?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)構(gòu)建大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCAO/R）后學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠模型，觀察了電針對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及對(duì)BDNF/TrkB/PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2021 年5 月—2022 年3 月選取60 只8 周齡健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，SPF 級(jí)，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司〔動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）2019003〕。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫20～26 ℃，濕度50%～70%，12 h 光照，自由飲食、飲水。本研究嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)規(guī)定執(zhí)行，并通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（YFYDW2021030）。

1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉（上海氟德化工有限公司，貨號(hào)：21642-83-1），硫酸慶大霉素〔上海現(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：1405-41-0〕，線栓（北京西濃科技有限公司，貨號(hào)：2036A6），多聚甲醛（biosharp 生物科技，貨號(hào)：BL539A），中性樹(shù)膠（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，貨號(hào)：96949-21-2），2%（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）TTC 染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T8170），總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R1200），蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R0010），BCA 蛋白定濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：PC0020），彩虹光譜蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：PR1920）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：PE0010），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒〔翌圣生物科技（上海）股份有限公司，貨號(hào)：14601ES03〕，引物（金唯智生物科技公司），兔抗BDNF（美國(guó)Abcam，貨號(hào)：ab108319），TrkB 多克隆抗體（美國(guó)Abcam，貨號(hào)：ab187041），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（美國(guó)Abcam，貨號(hào)：ab150077），兔抗磷酸化下游磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）（美國(guó)Abcam，貨號(hào)：ab278545），PI3K（美國(guó)Abcam，貨號(hào)：ab133595），磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：80455-1-RR），Akt（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：6-2-3-2-lg），GAPDH 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：60004-1-lg），PAGE 凝膠試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：PG112）。

Morris 水迷宮（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），針灸針、電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠），病理切片機(jī)（德國(guó)徠卡，型號(hào)：RM2245），脫水機(jī)（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：ASP200S），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-L7），高速組織研磨儀（武漢Servicebio，型號(hào)：SWE-FP），PCR 儀（杭州比格飛序，型號(hào)：96B），蛋白濃度微量測(cè)定儀（美國(guó)Thermo，型號(hào)：NanoDropOne），熒光定量PCR 儀（西安天隆科技，型號(hào)：Gentier），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo，型號(hào)：MK3），電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad，型號(hào)：1658001，170-3930），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad，型號(hào)：GelDoc XR+）。

1.3 大鼠造模及分組 喂養(yǎng)1 周后稱重，按照體質(zhì)量生成的隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分組，取24 只大鼠分為空白組（n=12）、假手術(shù)組（n=12），其余36 只大鼠采用Zea Longa 線栓法構(gòu)建MCAO/R 模型［12］。大鼠術(shù)前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位，分離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎ECA 遠(yuǎn)心端，夾閉CCA 近心端和ICA 遠(yuǎn)心端，在ECA 分叉處剪一“V”形開(kāi)口，用（0.26±0.02）mm 的硅膠涂層尼龍線栓從切口處插入至ICA 夾閉處，松掉ICA 動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入至輕微阻力為止，深度1.8～2.0 cm，記錄插栓時(shí)間，縫合切口。術(shù)后腹腔注射慶大霉素（2 U/只），連續(xù)3 d。缺血2 h 后，輕輕拉出長(zhǎng)度約1 cm 線栓，復(fù)通血管以灌注?？瞻捉M僅予同等條件的捉抓，假手術(shù)組予麻醉后僅分離血管，不插栓。待假手術(shù)組和造模后的大鼠完全清醒后對(duì)大鼠進(jìn)行Zea-Longa 評(píng)分（具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1），排除0 分和4 分的大鼠，24 h 后對(duì)假手術(shù)組和剩余造模大鼠開(kāi)展水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。以假手術(shù)組平均逃避潛伏時(shí)間為參考值，若造模組大鼠平均逃避潛伏時(shí)間小于參考值的80%，則認(rèn)為造模成功［13］。最終將造模成功的24 只大鼠隨機(jī)分為模型組（n=12）和電針組（n=12）。

1.4 電針治療 電針組于神庭、百會(huì)穴進(jìn)行電針治療，腧穴定位依照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［14］。將大鼠置于特殊制作的治療架上，采用針灸針（0.3 mm×25 mm）向后斜刺3 mm 進(jìn)針，連接GM01 電針儀，選用疏密波，電壓峰值6 V，頻率2～10 Hz，電流強(qiáng)度1～3 mA；30 min/次，1 次/d，連續(xù)治療14 d。治療期間關(guān)注大鼠狀態(tài)，避免針灸針脫落和大鼠跌落摔傷。模型組、空白組、假手術(shù)組只給予同等條件抓取，不予其他干預(yù)措施。

1.5 大鼠神經(jīng)缺損程度與空間學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)價(jià) 治療后第7、14 天由對(duì)實(shí)驗(yàn)方案不知情的人員對(duì)大鼠進(jìn)行Zea-Longa 評(píng)分，以此觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：于治療第9～13 天8：00 及18：00 進(jìn)行，由第1 象限開(kāi)始按順時(shí)針順序依次將大鼠置入水中，大鼠通過(guò)游泳來(lái)尋找逃生平臺(tái)，記錄大鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間（逃避潛伏期）。90 s 內(nèi)未能找到平臺(tái)，由研究者將大鼠置于平臺(tái)上，并給予10 s 的休息時(shí)間，并記錄此大鼠的逃避潛伏期為90 s。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：在治療進(jìn)行第14 天時(shí)撤掉水池中的逃生平臺(tái)，其余不變，將大鼠面朝池壁，依次投放入水池內(nèi)的4 個(gè)象限，記錄90 s 內(nèi)穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)。

1.6 TTC 染色觀察大鼠腦梗死體積 治療結(jié)束后，每組隨機(jī)選3 只大鼠麻醉后斷頭取腦組織，沖洗干凈，于-20 ℃冰箱中快速冷凍20 min 后沿冠狀面進(jìn)行切片，切片厚度約2 mm，每個(gè)腦組織共切5 片。于2%TTC 染色液中37 ℃避光染色。染色后將腦切片按照順序擺放后拍照，應(yīng)用Image J 軟件計(jì)算腦梗死體積占總體積的百分比。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài) 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3 只大鼠，麻醉后0.9%氯化鈉溶液和多聚甲醛心臟灌注，斷頭取腦組織，多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋切片。56 ℃烤片1 h，脫蠟步驟如下：切片置于松節(jié)油中8 min，4 次，然后于乙醇中梯度脫水。使用蘇木素染色5～10 min，采用純水將切片清洗至水色變清，使用1%鹽酸酒精分化2～3 s后使用純水清洗，氨水返藍(lán)，再次清洗。1%伊紅染色5～10 min，清洗1 min，乙醇脫水后中性樹(shù)膠封片待檢。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）測(cè)定BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3 只大鼠，完全麻醉后取腦，在冰面上剝?nèi)『ｑR組織，置于無(wú)酶凍存管中-80 ℃冰箱保存。按100 mg 海馬組織∶1 mL 裂解液比例配置，勻漿器充分研磨，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，置于冰上進(jìn)行RNA 濃度測(cè)定。引物序列見(jiàn)表2。逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃，15 min，98 ℃，5 min，結(jié)束后分裝并-20 ℃保存。RT-PCR 條件與方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法計(jì)算。

表2 RT-PCR 引物序列Table 2 RT-PCR primer sequence

1.9 Western blotting 檢 測(cè)BDNF、TrkB 蛋 白 水 平 及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平 干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3 只大鼠，完全麻醉后取腦，在冰面上剝?nèi)『ｑR組織，置于無(wú)酶凍存管中-80 ℃冰箱保存。海馬組織稱重后，加入裂解混合液（RIPA 裂解液∶蛋白酶抑制劑∶蛋白磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）。使用勻漿器低溫充分研磨，4℃，12 000 r/min 離心15 min 后提取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后加熱變性。制備聚丙烯酰胺凝膠，電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉1.5～2 h。4 ℃一抗（BDNF 1∶7 000、TrkB 1∶5 000、p-PI3K 1∶1 000、PI3K 1∶1 000、p-Akt 1∶1 000、Akt 1∶1 000、GAPDH 1∶10 000）孵育過(guò)夜。二抗（ 1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL 法顯影，凝膠成像拍照。使用Image J 軟件并以目的蛋白/內(nèi)參灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量，PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平分別以磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）/PI3K、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）/Akt 表示。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析；等級(jí)資料比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠神經(jīng)功能缺損程度 術(shù)后2 h 模型組、電針組Zea-Longa 評(píng)分與空白組、假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療第7 天、治療第14 天模型組Zea-Longa 評(píng)分與空白組、假手術(shù)組、電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 4 組大鼠Zea-Longa 評(píng)分比較〔只（%）〕Table 3 Comparison of Zea-Longa scores among 4 groups of rats

2.2 4 組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 定位航行實(shí)驗(yàn)的重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別主效應(yīng)及時(shí)間與組別的交互效應(yīng)。在治療第9～13 天逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以組別為自變量的效應(yīng)分析結(jié)果顯示，治療第9～13 天4 組大鼠逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第9～13 天模型組均大于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組均低于模型組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 4 組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）Table 4 Comparison of incubation period among 4 groups of rats

表4 4 組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）Table 4 Comparison of incubation period among 4 groups of rats

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術(shù)組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數(shù) 第9 天 第10 天 第11 天 第12 天 第13 天空白組 12 38.6±5.0 31.1±5.9 25.8±4.5 13.9±3.7 8.4±3.3假手術(shù)組 12 37.7±7.2 31.4±6.2 25.1±5.6 14.0±4.2 8.2±3.4模型組 12 51.9±6.3ab 42.4±6.0ab 34.5±5.0ab 27.5±5.1ab 20.7±5.9ab電針組 12 46.5±6.2c 37.6±5.1c 29.5±4.9c 20.4±3.3c 12.4±4.2c F 值 F交互=1.191，F(xiàn)組間=52.513，F(xiàn)時(shí)間=277.985 P 值 P交互=0.30，P組間＜0.05，P時(shí)間＜0.05

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 組大鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中模型組穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)低于空白組、假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 4 組大鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)比較（±s，次）Table 5 Comparison of times of crossing the effective region of the platform among 4 groups of rats

表5 4 組大鼠穿越平臺(tái)有效區(qū)域次數(shù)比較（±s，次）Table 5 Comparison of times of crossing the effective region of the platform among 4 groups of rats

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示假手術(shù)組比較P＜0.05，c表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數(shù) 穿越平臺(tái)次數(shù)空白組 12 7.99±2.71假手術(shù)組 12 7.64±3.20模型組 12 2.19±1.52ab電針組 12 4.87±1.65c F 值 15.57 P 值 ＜0.05

2.3 4 組大鼠腦梗死體積占比比較 空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組大鼠腦梗死體積占比分別為0、0、（36.7±6.3）%、（24.0±2.2）%，電針組大鼠腦梗死體積占比低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.30，P＜0.05），4 組大鼠腦組織TTC 染色情況見(jiàn)圖1。

圖1 4 組大鼠腦組織TTC 染色Figure 1 TTC staining of brain tissue in 4 groups of rats

2.4 4 組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài) 空白組和假手術(shù)組CA1 區(qū)神經(jīng)元排布緊致，胞質(zhì)均勻、顏色均勻，核顯示清楚，形態(tài)規(guī)整；模型組神經(jīng)元數(shù)目稀少，大小、形態(tài)各異，胞膜完整性差，部分變形、腫脹、破裂，胞質(zhì)顏色偏深，分布不均，核深染固縮，核仁顯示不清；電針組神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多，排列較為密集規(guī)整，形態(tài)規(guī)則，膜和核仁清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)分布均勻，見(jiàn)圖2。

圖2 4 組大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色情況（×200）Figure 2 HE staining in hippocampal CA1 region of 4 groups

2.5 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較 4 組大鼠BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中模型組BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平低于空白組、假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 4組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of mRNA levels of BDNF，TrkB，PI3K and Akt in hippocampal tissues of four groups

表6 4組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of mRNA levels of BDNF，TrkB，PI3K and Akt in hippocampal tissues of four groups

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術(shù)組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 例數(shù) BDNF TrkB PI3K Akt空白組 3 1.00±0.09 1.00±0.02 1.00±0.12 1.00±0.20假手術(shù)組 3 0.99±0.04 1.00±0.02 1.03±0.10 1.00±0.10模型組 3 0.23±0.03ab 0.48±0.10ab 0.55±0.04ab 0.53±0.05ab電針組 3 0.76±0.08c 0.75±0.07c 0.88±0.16c 0.90±0.09c F 值 91.95 44.87 11.45 10.35 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB 蛋白水平及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平比較 空白組與假手術(shù)組BDNF、TrkB 蛋白水平及PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平無(wú)差異（P＞0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組BDNF、TrkB 蛋白水平均下降（P＜0.01；P＜0.001），PI3K、Akt蛋白磷酸化水平下降（P＜0.01；P＜0.05）；與模型組相比，電針組BDNF、TrkB 蛋白水平和PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表7、圖3。

圖3 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白質(zhì)印跡法蛋白條帶圖Figure 3 Protein bands of BDNF，TrkB，PI3K，Akt，p-PI3K，p-Akt in the hippocampus of the four groups of rats by Western Blotting

表7 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）Table 7 Comparison of protein relative expression levels of BDNF，TrkB，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in hippocampal tissues of four groups

表7 4 組大鼠海馬組織BDNF、TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）Table 7 Comparison of protein relative expression levels of BDNF，TrkB，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in hippocampal tissues of four groups

注：p-PI3K=磷酸化磷脂酰肌醇3激酶，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與假手術(shù)組比較P＜0.05，c 表示與模型組比較P＜0.05。

組別 只數(shù) BDNF TrkB p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt空白組 3 0.32±0.07 0.95±0.04 0.58±0.01 0.33±0.03假手術(shù)組 3 0.32±0.07 0.91±0.06 0.59±0.04 0.35±0.03模型組 3 0.08±0.03ab 0.43±0.02ab 0.31±0.10ab 0.17±0.02ab電針組 3 0.23±0.07c 0.65±0.06c 0.54±0.09c 0.32±0.09c F 值 10.58 45.22 10.66 7.62 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

腦卒中后認(rèn)知功能障礙歸屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“健忘”等范疇。現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為本病病位在腦，病機(jī)為腦脈痹阻、腦髓失養(yǎng)。患者因邪致氣血不暢，痰瘀閉阻清竅，腦髓不充而神識(shí)不清，表現(xiàn)為表情呆滯、學(xué)習(xí)記憶力下降等［15］。本研究團(tuán)隊(duì)基于該病“病位在腦，首取督脈”的學(xué)術(shù)思想，在前期文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，總結(jié)出以電針神庭、百會(huì)為主的通督醒神針刺療法，在臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著［5］。神庭為督脈、足太陽(yáng)、陽(yáng)明之會(huì)，對(duì)于神智方面的疾病，非神庭莫能治。百會(huì)位居巔頂，貫通周身經(jīng)穴，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。前期研究發(fā)現(xiàn)，電針神庭、百會(huì)能夠有效改善腦卒中后患者認(rèn)知功能，提高生活自理能力［6-7］。

海馬與學(xué)習(xí)記憶、情緒等高級(jí)腦活動(dòng)密切相關(guān)。正常情況下，短時(shí)記憶儲(chǔ)存在海馬中，大腦通過(guò)重復(fù)和強(qiáng)化后將部分短時(shí)記憶轉(zhuǎn)變?yōu)橛谰眯杂洃泝?chǔ)存在大腦中。而當(dāng)各種原因?qū)е潞ｑR損傷時(shí)，機(jī)體則會(huì)出現(xiàn)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶功能的障礙。因此，海馬常被用來(lái)研究與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的生理機(jī)制。其次，海馬神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧異常敏感，因此海馬也是研究最多的與腦卒中后學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)的腦區(qū)［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO/R 大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元廣泛溶解、數(shù)目稀少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，同時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分及行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠存在不同程度的學(xué)習(xí)記憶功能減退，與海馬神經(jīng)元的損傷程度密切相關(guān)。

BDNF 作為哺乳動(dòng)物中樞內(nèi)分布最為廣泛、含量最高的營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元形成、功能重塑以及情緒、學(xué)習(xí)和記憶等功能的發(fā)揮具有重要作用［18-19］。BDNF 表達(dá)異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的生長(zhǎng)受限，影響突觸信號(hào)傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)疼痛、抑郁、癲癇等。同樣，海馬BDNF的表達(dá)差異與其結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除BDNF 基因可引起小鼠認(rèn)知功能障礙，甚至導(dǎo)致小鼠死亡［20］。向大鼠腦室內(nèi)注射BDNF 能夠預(yù)防缺血海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元死亡，促進(jìn)DG 區(qū)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)與成熟，增強(qiáng)海馬突觸后受體活性，從而改善神經(jīng)功能［21］。

BDNF 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用是依賴于與其下游高親和力受體TrkB 結(jié)合后，TrkB 可發(fā)生二聚體化，繼而引發(fā)下游PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活。BDNF/TrkB介導(dǎo)的PI3K/Akt 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在突觸重塑、神經(jīng)元形成以及情緒、學(xué)習(xí)和記憶神經(jīng)發(fā)育及相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用。PI3K/Akt 信號(hào)通路是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其激活與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起著非常重要的作用［22］。LI 等［23］采用甲叉丙烯酰胺干預(yù)局灶性腦缺血后大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組大鼠海馬組織PI3K 信號(hào)通路被激活，同時(shí)水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠認(rèn)知功能提高，說(shuō)明通過(guò)調(diào)控PI3K 信號(hào)通路可以改善腦缺血缺氧大鼠的認(rèn)知能力。本研究結(jié)果顯示，MCAO/R 模型大鼠海馬BDNF、TrkB、PI3K、Akt 水平下降，學(xué)習(xí)記憶能力受損，神經(jīng)元損傷明顯，而電針干預(yù)能夠提高BDNF、TrkB、PI3K、Akt 水平，改善學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與電針提高該通路水平、增強(qiáng)海馬突觸可塑性有關(guān)，然而仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。此外，mTOR 作為PI3K/Akt 通路的下游關(guān)鍵蛋白，是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，那么電針療法是否是通過(guò)影響B(tài)DNF/TrkB 介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控了海馬神經(jīng)元的自噬水平而發(fā)揮作用的，以及自噬與突觸可塑性的關(guān)系如何仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：蘇凱奇負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思設(shè)計(jì)及論文的撰寫(xiě)；蘇凱奇、呂轉(zhuǎn)、羅萌、聶晨晨、劉昊負(fù)責(zé)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)收集整理；吳明莉、高靜負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)管理及數(shù)據(jù)分析；馮曉東負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及終稿的審校，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。