邱凱華 方淑梅 梁喜龍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，163319，黑龍江大慶）

真核生物的結(jié)構(gòu)基因為斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄生成的mRNA 前體（pre-mRNA）必須經(jīng)過5'端加帽、剪接（去除內(nèi)含子，連接外顯子）、3'端加polyA 尾這一系列高度整合和偶聯(lián)的步驟形成成熟的mRNA，隨后從細(xì)胞核穿過核孔，運送至細(xì)胞質(zhì)進行下一步反應(yīng)[1-4]。pre-mRNA 剪接是由一個大復(fù)合物——剪接體來執(zhí)行，剪接體由U1、U2、U4、U5和U6 5 種核小核糖核蛋白（ small nuclear ribonucleoproteins，snRNP）和大量非核小核糖核蛋白（non-snRNP）組成[5-6]，首先，U1snRNP 識別內(nèi)含子的5'剪接位點并與其結(jié)合，SF1（splicing factor 1）與分支點結(jié)合，從而促進U2AF 因子在3'剪接位點的結(jié)合，形成復(fù)合體E；隨后U2snRNP 取代SF1參與剪接，產(chǎn)生復(fù)合體A；接著預(yù)成型的U4/U6-U5三聚體加入復(fù)合體A，形成復(fù)合體B；再經(jīng)過大量蛋白的交換和募集最終轉(zhuǎn)化為具有催化活力的復(fù)合體C，至此剪接體形成[7]。pre-mRNA 剪接過程涉及2 個連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，首先，分支點腺苷的2'-OH基團對內(nèi)含子5'剪接位點的磷酸二酯鍵進行親核攻擊，產(chǎn)生裂解的上游外顯子，第2 步，由上游外顯子的3'-OH 基團攻擊3'剪接位點的磷酸二酯鍵，使外顯子連接，內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)釋放[5,8]。

SR（Serine/Arginine）家族及其相關(guān)蛋白是眾多非snRNP 剪接因子中表征最廣泛的一類，在剪接位點的選擇和剪接的其他過程中發(fā)揮重要作用[9-12]。SRRM1（Serine/arginine repetitive matrix protein 1）/SRm160（the SR-related nuclear matrix protein of 160kDa）是其中的一個成員，是一種剪接輔激活因子，通過結(jié)合5'剪接位點、分支點和3'剪接位點的剪接因子發(fā)揮作用[13]，其N 端含有一個高度保守的PWI（Pro-Trp-Ile）結(jié)構(gòu)域。PWI 結(jié)構(gòu)域是一類新型的RNA 結(jié)合域，其可促進剪接過程中pre-mRNA的3'末端切割，有利于mRNA 向細(xì)胞質(zhì)釋放[13-15]。研究[16-21]發(fā)現(xiàn)，SRm160 在轉(zhuǎn)錄后仍與mRNA 結(jié)合，作為EJC（exon junction complex）的組成成分，通過NMD（nonsense-mediated mRNA decay）途徑參與mRNA 從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的輸出和轉(zhuǎn)運。

研究[22]發(fā)現(xiàn)，SRRM1/SRm160 在調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育和行為中發(fā)揮重要作用。對果蠅的研究[23]顯示，SRm160 可以通過可變剪接影響果蠅的節(jié)律行為；在秀麗隱桿線蟲中SRm160 和CstF-50 基因同步缺失會導(dǎo)致晚期胚胎發(fā)育停滯。本研究以稻瘟菌類SRRM1 蛋白為研究對象，首先對其進行生物信息學(xué)分析，進一步采用以基因重組原理為基礎(chǔ)的基因定點敲除技術(shù)對該基因功能進行研究，為稻瘟病菌中轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

稻瘟病菌菌株Y34、遺傳轉(zhuǎn)化所用土壤農(nóng)桿菌AGL-1、敲除載體pXEH20 為本實驗室保存；真菌DNA 提取試劑盒為OMEGA 公司產(chǎn)品；細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒為AXYGEN 公司產(chǎn)品；基因克隆所用試劑與大腸桿菌（DH-5α）感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司；基因克隆載體pMD18-T 與引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司，具體引物信息如表1 所示；其他藥品和試劑均為分析純。

表1 敲除載體構(gòu)建及突變體驗證所用引物信息Table 1 Primer information for knockout vector construction and mutant verification

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）搜索“SRRM1”，獲取人的SRRM1 蛋白序列，再通過NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），物種選擇為“Pyricularia oryzae”，獲取稻瘟病菌中的類SRRM1 蛋白序列。利用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測理化性質(zhì)；利用Prot Comp 9.0（http://linux1.Softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=prol oc）預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；利用SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Signa lP-5.0）預(yù)測信號肽；利用TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測跨膜螺旋；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm a.html）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；利用NCBI Conserved Domain Search （ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測結(jié)構(gòu)域，通過Dog 2.0畫圖；在SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）獲取三級結(jié)構(gòu)。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源比對得到人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花（Gossypium hirsutum）、大豆（Glycine max）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae） 、白僵菌（Beauveria bassiana）、炭疽病菌（Colletotrichum truncatum）、白粉病菌（Erysiphe necator）、白紋羽病菌（Rosellinia necatrix）中同源蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining 法繪制系統(tǒng)進化樹，參數(shù)默認(rèn)，生成系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 敲除載體的構(gòu)建及土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 （1）擴增M-0 左、右臂：以野生型稻瘟病菌菌株Y34 基因組DNA 為模板，PCR 擴增基因左、右臂，電泳檢測。然后分別將左、右臂與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，進行測序，確認(rèn)無誤后保存菌液。（2）敲除載體連接：將敲除載體pXEH20 與連接到T 載體的基因左、右臂菌液進行活化，提取質(zhì)粒。利用相應(yīng)內(nèi)切酶先后將左、右臂連接于pXEH20 載體，形成重組的敲除載體。將敲除載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，進行菌液PCR 驗證，能同時擴增基因左、右臂，證明成功轉(zhuǎn)入，然后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL-1 中，菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化（土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法）（1）稻瘟病菌分生孢子的準(zhǔn)備：將稻瘟病菌接種于燕麥片培養(yǎng)基（含濃度為100μg/mL 的鏈霉素），28℃黑暗培養(yǎng)7d，去除培養(yǎng)基表面的氣生菌絲，蓋一層紗布，連續(xù)光照培養(yǎng)3d，使之產(chǎn)生孢子。取2mL IM 液體培養(yǎng)基加入平板，洗出分生孢子，通過3 層擦鏡紙折成的無菌漏斗過濾，顯微鏡調(diào)整孢子濃度至1×106個/mL。（2）土壤農(nóng)桿菌AGL-1的活化與誘導(dǎo)：在LB 培養(yǎng)基加50μg/mL 利福平和50μg/mL 卡那霉素劃線培養(yǎng)含有敲除載體的土壤農(nóng)桿菌AGL-1 約2d，用接種環(huán)刮取適量菌體于10mL IM 液體培養(yǎng)基，用移液器反復(fù)吸吹至菌體充分懸浮，而后28℃恒溫、180 轉(zhuǎn)/min 黑暗誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。（3）分生孢子與土壤農(nóng)桿菌AGL-1 的共培養(yǎng)：將誘導(dǎo)的土壤農(nóng)桿菌菌液和孢懸液1:1 混勻，加入終濃度為500μmol/L 的AS 試劑。將上述混合液涂抹于鋪有玻璃紙的IM 固體培養(yǎng)基，每個平板200μL，28℃恒溫黑暗培養(yǎng)48h。（4）轉(zhuǎn)化子的篩選與純化：取下玻璃紙反向貼于含400μg/mL 頭孢霉素、200μg/mL 羧芐青霉素、200μg/mL 潮霉素的PDA 篩選培養(yǎng)基，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h 后取下玻璃紙，將可擴展菌落接于新的潮霉素篩選平板，連續(xù)篩選3 代，用濾紙片保存。

1.2.4 敲除突變體的獲得與鑒定 活化初篩轉(zhuǎn)化子，用CM 液體培養(yǎng)基搖培約3d 后取菌絲，微波爐法提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以其為模板，用特異性引物PCR 擴增Hyg 抗性基因片段，確認(rèn)敲除載體是否轉(zhuǎn)入，再擴增敲除掉的基因片段，初步確認(rèn)轉(zhuǎn)化子是否為敲除轉(zhuǎn)化子。進一步以上述轉(zhuǎn)化子基因組DNA 為模板，在敲除基因的左臂上游序列設(shè)計正向引物，在轉(zhuǎn)入的Hyg 抗性基因序列設(shè)計反向引物，同理，在Hyg 抗性基因序列設(shè)計正向引物，在敲除基因的右臂下游設(shè)計反向引物，進行PCR 擴增反應(yīng)，若均可擴增相應(yīng)片段，確認(rèn)轉(zhuǎn)化子為敲除突變體。

1.2.5 生物學(xué)特性分析 在CM 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基進行營養(yǎng)生長分析；細(xì)胞壁的完整性分析，在終濃度為200μg/mL 剛果紅（Congo-Red）和0.01%十二烷基硫酸鈉（SDS）的CM 固體培養(yǎng)基進行；滲透逆境，在分別含有1mol/L 山梨醇和NaCl 的CM固體培養(yǎng)基進行；殺菌劑逆境，在含有0.0074μg/mL吡唑醚菌酯的CM 固體培養(yǎng)基進行。上述試驗條件均為28℃恒溫培養(yǎng)7d，十字交叉法測量菌落直徑并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 統(tǒng)計數(shù)據(jù)與繪圖，采用SPSS 22.0 軟件進行ANOVA 單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

類SRRM1 蛋白ID 為XP_003713560，對應(yīng)基因名為MGG_04513，含有氨基酸402 個，分子量為43 408.33，等電點為10.48，是一種堿性親水蛋白，該蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白，無跨膜螺旋，亞細(xì)胞定位存在于細(xì)胞核。如圖1a 所示，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占比31.09%。如圖1b 所示，該蛋白僅在5'端含有一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，即PWI 結(jié)構(gòu)域。如圖1c 所示，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模板為1mp1.1.A，序列與模板一致度為49.02%，GMQE值為0.12，QMEAN 值為-4.08，數(shù)值均在可信范圍內(nèi)。如圖2 所示，進化關(guān)系中，棉花、大豆和擬南芥構(gòu)成一個分支，人和小鼠構(gòu)成一個分支，真菌中炭疽病菌和白紋羽病菌親緣關(guān)系最近，二者與白粉菌構(gòu)成一個分支，而白僵菌與動植物構(gòu)成一個大的分支，稻瘟病菌則獨立構(gòu)成一個分支，由此我們推測，SRm160 同源物在動物和植物中進化較保守，而在真菌中進化差異較大。Motif 1、2、4 為10 個物種共有基序，PWI 為共有結(jié)構(gòu)域，且均在N 端。

圖1 類SRRM1 蛋白的空間結(jié)構(gòu)Fig.1 The spatial structure of SRRM1-like protein

圖2 類SRRM1 蛋白的進化關(guān)系與結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Evolutionary relationship and structural analysis of SRRM1-like protein

2.2 敲除載體的構(gòu)建與驗證

以Y34 基因組DNA 為模板，利用特異性引物擴增出MGG_04513（以下簡稱M-0）基因的左、右臂（M-0-L、M-0-R），大小分別為1152 和1305bp，電泳檢測結(jié)果見圖3，可見條帶正確。然后分別將M-0-L 和M-0-R 與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行測序，確認(rèn)后保存。

圖3 M-0 基因左、右臂的PCR 擴增Fig.3 PCR amplification of left and right arms of M-0 gene

取出pXEH20，連接于T 載體的M-0-L 和M-0-R，進行菌株活化，提取質(zhì)粒，利用內(nèi)切酶XhoI 和EcoR I 分別對連接于T 載體的M-0-L 與pXEH20 載體雙酶切，酶切產(chǎn)物M-0-L 與pXEH20膠回收純化，再用T4DNA 連接酶將二者連接轉(zhuǎn)化為pXEH20-L，簡寫為P-L，再利用內(nèi)切酶BamH I和Hind III 分別對連接于T 載體的M-0-R 與P-L重組載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物M-0-R 與P-L 膠回收純化，然后用T4DNA 連接酶將其連接為重組載體pXEH20-LR，簡寫為P-LR。對pXEH20、P-L、P-LR 質(zhì)粒進行電泳檢測，結(jié)果見圖4，條帶大小均正確。

圖4 pXEH20、P-L、P-LR 質(zhì)粒電泳圖Fig.4 Electropherogram of pXEH20,P-L,P-LR plasmid

構(gòu)建敲除載體pXEH20-LR 的示意圖如圖5a 所示，將重組載體pXEH20-LR 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR 驗證（擴增M-0-L與M-0-R 片段），結(jié)果見圖5b，條帶正確。然后提取大腸桿菌中重組敲除載體pXEH20-LR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL-1 中，菌液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖5 M-0 基因敲除載體的構(gòu)建示意圖及驗證Fig.5 Schematic diagram and verification of construction of knockout vector of M-0 gene

2.3 敲除突變體的獲得與鑒定

以遺傳轉(zhuǎn)化過程中篩選出的轉(zhuǎn)化子基因組DNA 為模板，擴增Hyg 抗性基因（753bp）與敲除片段基因（653bp），結(jié)果見圖6，初步確認(rèn)轉(zhuǎn)化子為敲除轉(zhuǎn)化子。

圖6 M-0 轉(zhuǎn)化子目的基因驗證電泳圖Fig.6 Electropherogram of the verified M-0 transformant target genes

再利用特異性引物M-0-L-H-S、M-0-L-H-A與M-0-H-R-S、M-0-H-R-A 進行擴增，電泳檢測結(jié)果見圖7，皆能成功擴增相應(yīng)片段，說明敲除載體上的同源基因與稻瘟病菌基因組中的基因正確交換，轉(zhuǎn)化子為敲除突變體。

圖7 M-0 轉(zhuǎn)化子側(cè)翼序列驗證電泳圖Fig.7 Electropherogram of the verified M-0 transformant flank sequences

2.4 生物學(xué)特性分析

營養(yǎng)生長分析在CM 和PDA 培養(yǎng)基進行，結(jié)果見圖8，野生型菌株Y34 及突變體M9、M11、M17 的菌落生長速率相近，無明顯差異。為探究其是否參與稻瘟病菌對外界脅迫的應(yīng)答，將野生型菌株和敲除突變體菌株分別接種于含有Congo-Red、SDS、山梨醇、NaCl 以及吡唑醚菌酯的CM固體培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，在幾種逆境下敲除菌株與野生型菌株相比受到不同程度的抑制，均達到顯著差異水平，其中，Congo-Red 條件下敲除菌株直徑減小最少，敲除菌株M9、M11 和M17 相比野生型菌株Y34 的菌落直徑分別減小5.37%、5.38%和6.80%；山梨醇條件下敲除菌株M9、M11和M17 相比野生型菌株Y34 的菌落直徑分別減小7.39%、8.36%和8.04%；SDS 條件下敲除菌株M9、M11 和M17 相比野生型菌株Y34 的菌落直徑分別減小11.56%、9.25%和10.98%；NaCl 條件下敲除菌株受影響最大，敲除菌株M9、M11 和M17 相比野生型菌株Y34 的菌落直徑分別減小13.27%、11.85%和11.37%。另外，在吡唑醚菌脂殺菌劑逆境下敲除突變體菌株直徑分別減小了9.83%、9.25%和12.14%，也表現(xiàn)出較強的敏感性。

圖8 基因敲除對稻瘟病菌營養(yǎng)生長及逆境適應(yīng)的影響Fig.8 Effects of gene knockout on the vegetative growth and stress adaptation of Magnaporthe grisea

3 討論

SR 蛋白在N 端含有1 或2 個RRM（RNA 識別基序），使其具有RNA 結(jié)合特性，在C 端有一個RS（富含精氨酸和絲氨酸）結(jié)構(gòu)域，用于促進蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[24-25]。因為SRm160 缺少RRM 基序，但在功能上滿足SR 蛋白的定義，它可以通過PWI 結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合核酸，所以它不是典型的SR 家族成員，而被定義為SR 相關(guān)蛋白[15,26]。類SRRM1 是哺乳動物剪接因子SRRM1 在稻瘟病菌中的同源物，本研究通過生物信息學(xué)分析與其他物種中同源物的進化關(guān)系，白僵菌與動植物在一個分支，稻瘟病菌獨立構(gòu)成一個分支，其他真菌在一個分支，與其他9 個物種共有基序為Motif 1、2、4，缺少其他物種都具有的Motif 3，比真菌物種多一個Motif 10，僅在N 端含有一個PWI 結(jié)構(gòu)域，由此我們認(rèn)為該基因在真菌中進化差異較大。

Beckwith 等[22]研究表明，SRm160 通過剪接調(diào)控果蠅大腦起搏器神經(jīng)元的基因表達來確保分子鐘的適當(dāng)振蕩，進而影響果蠅的節(jié)律行為；在秀麗隱桿線蟲中，McCracken 等[23]通過RNA 干擾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，SRm160 和卵裂因子CstF-50 存在特定的相互作用，2 種基因共同缺失會導(dǎo)致線蟲的晚期胚胎發(fā)育停滯；其后McCracken 等[27]又發(fā)現(xiàn)，SRm160 與染色質(zhì)調(diào)節(jié)和姐妹染色單體結(jié)合有關(guān)；Cheng 等[28]發(fā)現(xiàn)，SRm160 通過與Sam68 相互作用來調(diào)節(jié)人體內(nèi)源跨膜糖蛋白CD44 的選擇性剪接，進而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲。由此可見，SRm160 同源基因在不同生物體中發(fā)揮的作用以及重要程度不同。本研究發(fā)現(xiàn)，在稻瘟病菌中敲除類SRRM1不會致死，對于稻瘟病菌而言，CM 與PDA 培養(yǎng)基以及28℃都是最適的培養(yǎng)條件，此條件下野生型與敲除突變體菌落直徑相近，無明顯差異，由此推測在適當(dāng)條件下，類SRRM1 對稻瘟病菌營養(yǎng)生長不是必需的；然而經(jīng)過Congo-Red、SDS（兩者均抑制細(xì)胞壁的形成）和滲透逆境（山梨醇、NaCl）以及殺菌劑吡唑醚菌酯處理后，敲除突變體的菌絲生長均受到明顯影響，表現(xiàn)出抗逆性減弱。

本研究結(jié)果可以為了解稻瘟病菌中類SRRM1功能提供參考，我們將繼續(xù)設(shè)計基因缺失與致病性相關(guān)的試驗方案，進一步研究類SRRM1 與稻瘟病菌致病力的關(guān)系，為明確pre-mRNA 剪接與稻瘟病菌應(yīng)對寄主逆境和致病性的深層關(guān)系提供基礎(chǔ)，為稻瘟病有效防控提供新思路。

4 結(jié)論

生物信息學(xué)分析表明，稻瘟菌中類SRRM1 是存在于細(xì)胞核的堿性親水蛋白，不含信號肽，無跨膜螺旋，在N 端含有一個PWI 結(jié)構(gòu)域。類SRRM1基因缺失不影響稻瘟病菌的營養(yǎng)生長，但對Congo-Red、SDS、山梨醇、NaCl 及殺菌劑吡唑醚菌酯逆境脅迫敏感，表現(xiàn)為抗逆性減弱。因此推測，類SRRM1 與稻瘟病菌細(xì)胞壁形成有關(guān)，參與滲透逆境應(yīng)答，也與稻瘟病菌應(yīng)對殺菌劑吡唑醚菌酯的過程相關(guān)，類SRRM1 在稻瘟病菌逆境適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。