郭紅霞 王創(chuàng)云 鄧妍 趙麗 張麗光 郭虹霞 秦麗霞 高飛 席瑞珍

（1 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，030006，山西太原；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，030031，山西太原）

氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要的大量元素之一，作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中缺氮素將會(huì)對(duì)其生命活動(dòng)和產(chǎn)量造成一定的影響[1-2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為保證作物高產(chǎn)而大量施用氮肥。2000 年前后，中國(guó)的氮肥產(chǎn)量和使用量已經(jīng)超過(guò)了美國(guó)和歐盟的總和，居世界第一[3]。但是施入農(nóng)田的氮肥只有30%～50%被農(nóng)作物吸收[4]，其余大部分以其他途徑流失到環(huán)境中[5-6]。不僅造成了農(nóng)作物生產(chǎn)成本的提高，而且加重了土壤和水資源的污染，目前我國(guó)農(nóng)業(yè)區(qū)的過(guò)量施氮已經(jīng)造成嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[7-8]。因此，通過(guò)研究作物耐低氮機(jī)制、選育耐低氮能力強(qiáng)的品種來(lái)減少氮肥施用量變得尤為重要[9-11]。

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）并非屬于常見(jiàn)的禾本科谷物，而是屬于莧科藜屬，因此被稱為“假谷物”[12]。藜麥不但具有耐鹽堿、耐貧瘠、抗干旱和抗霜凍等生理特性，還含有人體所需的均衡營(yíng)養(yǎng)，研究[13-15]表明，藜麥中蛋白質(zhì)、微量元素、氨基酸、纖維素和維生素等含量均高于小麥、水稻和玉米等傳統(tǒng)谷物；藜麥中蛋白質(zhì)的含量平均為16%，最高可達(dá)22%，富含人體必需的8 種氨基酸和嬰幼兒必需的1 種氨基酸，且賴氨酸和礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)含量都很高，將藜麥作為唯一的食物來(lái)源，人體基本不會(huì)缺乏營(yíng)養(yǎng)，所以藜麥逐漸被人們重視[16-18]。藜麥目前在我國(guó)各地都有廣泛的種植，山西靜樂(lè)被譽(yù)為“中國(guó)藜麥之鄉(xiāng)”。目前關(guān)于藜麥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)研究主要有干旱脅迫、水分脅迫、溫度脅迫和鹽堿脅迫對(duì)其生長(zhǎng)特性、生理特性和產(chǎn)量的影響。溫日宇等[19]探究了低溫脅迫對(duì)紅藜、白藜、黑藜3 種不同藜麥幼苗生理生化特性的影響，結(jié)果表明低溫脅迫對(duì)3 種不同藜麥幼苗的過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量均有不同程度的影響，且抗寒性表現(xiàn)為黑藜＞白藜＞紅藜。劉文瑜等[20]研究表明，隨NaCl 濃度的升高，可溶性糖、Pro和MDA 含量逐漸升高，SOD、POD、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性增強(qiáng)。鹽脅迫后藜麥幼苗的莖葉和根系生長(zhǎng)均受到了抑制，且莖葉生長(zhǎng)受到的抑制程度大于根系。關(guān)于施氮量對(duì)藜麥生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響已有不少研究，前人[21-22]研究表明，藜麥對(duì)氮肥的需求量比較大，但是藜麥的產(chǎn)量并不都是隨著氮肥施用量的增加而增加，過(guò)多施用氮肥會(huì)導(dǎo)致藜麥的株高顯著提高，倒伏率上升，從而降低產(chǎn)量，但對(duì)于藜麥對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)研究低氮脅迫下不同藜麥幼苗生長(zhǎng)特性和生理特性的差異，采用模糊隸屬函數(shù)法、主成分分析法及系統(tǒng)聚類法分析不同藜麥品系耐低氮能力的強(qiáng)弱，探究藜麥在低氮環(huán)境中的響應(yīng)機(jī)制，可為選育耐低氮藜麥品種提供種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的9 份藜麥材料分別是HL58、G68、A29、G36、BL23、A86、HL93、BL77、BL22，均由山西華青藜麥產(chǎn)品開發(fā)有限公司提供，為自有品系，沒(méi)有認(rèn)定，具體信息見(jiàn)表1。

表1 供試的9 份藜麥材料信息Table 1 Information of tested nine quinoa materials

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

9個(gè)不同基因型藜麥種子用10% NaClO溶液消毒10min，經(jīng)蒸餾水多次沖洗后置于盛有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25°C 培養(yǎng)至發(fā)芽，移至盛滿砂子的花盆中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗周期16h/8h，溫度22°C，常規(guī)管理。待藜麥長(zhǎng)至6～8 葉時(shí)選生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行不同氮濃度的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液處理，設(shè)置正常供氮（CK，Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)液，N含量4mmol/L）和低氮脅迫（LN，0.5% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，N 含量0.02mmol/L）2 種處理。每個(gè)處理重復(fù)3 次。處理20d 后測(cè)定各基因型生長(zhǎng)特性（株高、莖粗、主根長(zhǎng)、根系體積、根系表面積及根系平均直徑、地上部干重、根系干重、根冠比）、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)、生理特性[根系活力、硝酸還原酶（NR）活性、谷氨酸合成酶（GOGTA）活性、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro 含量]、氮素利用效率（植株全氮含量、氮積累量、氮素利用效率）等指標(biāo)；采用模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算各指標(biāo)耐低氮指數(shù)，通過(guò)主成分分析與聚類分析評(píng)價(jià)各基因型藜麥綜合耐低氮能力。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

株高：采用直尺直接測(cè)量；莖粗：用游標(biāo)卡尺直接測(cè)定；主根長(zhǎng)、根系體積、表面積及根系平均直徑：用緩慢的水流將根系的泥土沖洗干凈，采用EPSON SCAN 根系掃描儀進(jìn)行掃描，然后用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)進(jìn)行分析；采用烘干后稱重法測(cè)定地上部干重、根系干重；采用TTC 法測(cè)定根系活力；采用對(duì)氨基苯磺酸比色法之離體法測(cè)定NR 活性；采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定SOD 活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定POD 活性；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA 含量；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮法[23]測(cè)定Pro含量；用SPAD 型葉綠素測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定SPAD 值；采用Handy PEA 葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)；采用凱氏定氮法[24]測(cè)定植株全氮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根冠比=植株根系干重/地上部干重；氮積累量=植株干重×氮含量；氮利用效率=植株干重/植株氮積累量；

各性狀相對(duì)值：Rx=低氮脅迫的測(cè)定值/正常供氮的測(cè)定值；

隸屬函數(shù)值：U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

隸屬函數(shù)值是利用模糊隸屬函數(shù)法將各指標(biāo)性狀在所提取的主成分上的得分值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)，j=1，2，…，n；Xmax和Xmin分別表示每個(gè)主成分各性狀指標(biāo)得分值的最大值和最小值。Wj表示所提取的第j個(gè)主成分的權(quán)重，Rj表示第j個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率；D值表示各藜麥品系耐低氮性的綜合值。

分別運(yùn)用Excel 2019、DPS 9.5 和SPSS 23.0 分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系農(nóng)藝性狀的影響

2.1.1 對(duì)地上部分生長(zhǎng)的影響 如圖1 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫下不同藜麥品系的株高、莖粗和莖葉干重均有不同程度下降。其中A29、BL23、A86、BL77 和BL22 株高差異均顯著，HL58 降低幅度（15.25%）最大，BL22 降低幅度最小為4.21%；莖粗除G68、BL23 和BL22 外，其他品系差異均不顯著，HL58 降低幅度（13.08%）最大，BL22 降低幅度（4.17%）最??；2 個(gè)處理下，莖葉干重只有A29 差異顯著，A29 降低幅度（7.31%）最大，HL58降低幅度（0.12%）最小。低氮脅后各指標(biāo)的變化幅度為株高＞莖粗＞莖葉干重，說(shuō)明低氮脅迫對(duì)藜麥的葉片影響不大。

圖1 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系地上部分生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of low nitrogen stress on aboveground partial growth of different quinoa lines

2.1.2 對(duì)根系生長(zhǎng)的影響 如表2 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫下，不同藜麥品系的最大根長(zhǎng)都有不同程度增加，A86、BL77、BL23 差異顯著，其中A86 增加幅度最大，為9.65%，HL93 增加幅度最小，為0.69%；根系平均直徑除了G68 增加以外，其他品系都有不同程度的降低，HL93 和BL22差異不顯著，其他品系差異顯著，其中BL77 降低幅度最大，為25.08%，BL22 降低幅度最小，為4.00%，說(shuō)明低氮脅迫可使根系平均直徑降低；根系表面積在低氮脅迫后除了BL77 增加以外，其他品系均有不同程度的降低，除了HL58 和BL22 以外，其他品系差異均顯著，其中G68 降低幅度最大，為11.28%，BL22 降低幅度最小，為3.29%，說(shuō)明低氮脅迫有使根系表面積降低的趨勢(shì)；低氮脅迫后根系體積均有不同程度降低，其中HL93 和BL22差異不顯著，其他品系差異顯著，A86 降低幅度最大，為24.06%，HL93 降低幅度最小，為3.45%；根系干重和根冠比均有不同程度的增加，根系干重增加幅度為0.57%～11.42%，根冠比增加幅度為2.68%～15.06%，由于根系干重增加而莖葉干重降低導(dǎo)致根冠比增加，以上結(jié)果說(shuō)明低氮脅迫可使藜麥根系伸長(zhǎng)，使根系生物量整體增加。

表2 低氮脅迫對(duì)藜麥根系生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of low nitrogen stress on the root growth of quinoa

2.2 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如圖2 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫后，不同藜麥品系的SPAD 值均有不同程度降低，HL58降低幅度最大，為14.23%，BL22 最小，為3.98%。

圖2 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of low nitrogen stress on the chlorophyll content of different quinoa lines

如圖3 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫后，初始熒光參數(shù)（Fo）都有一定程度升高，BL23、BL77 和BL22 差異顯著，其中G68 升高的幅度最大，為11.67%，BL22 升高的幅度最小，為2.18%；最大熒光參數(shù)（Fm）均有一定程度的降低，其中BL77 降低最大，為18.83%，A86 降低最小，為8.43%；最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）也均有一定程度降低，其中G68 降低最大，為11.57%，BL22 降低最小，為2.17%。說(shuō)明低氮脅迫后藜麥光合作用受到了抑制。

圖3 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.3 Effects of low nitrogen stress on the chlorophyll fluorescence parameters of different quinoa lines

2.3 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系生理特性的影響

如表3 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫下，不同藜麥品系的NR 活性有不同程度降低，其中A86 降低幅度最大，為77.09%，BL22 降低幅度最小，為1.82%；G68 和A86 POD 活性分別降低6.47%和1.39%，其他藜麥品系的POD 活性有不同程度升高；G68 和BL23 SOD 活性分別降低10.19%和2.46%，其他品系的SOD 活性有不同程度升高，升高范圍為1.77%～10.65%；HL93 MDA 含量降低了5.81%，其他藜麥品系均有不同程度的增加，其中A86 增加了137.45%，G68 增加了69.38%，說(shuō)明A86 和G68 這2 個(gè)品系在低氮脅迫后，超出自身耐受范圍，細(xì)胞膜受到傷害，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA 的大量堆積。

表3 低氮脅迫對(duì)藜麥酶活性及MDA 含量的影響Table 3 Effects of low nitrogen stress on enzyme activities and MDA content in quinoa

如表4 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫后除了HL58 外，其他品系藜麥的根系活力均有所降低，A86 降低幅度最大，為29.89%，BL22 降低幅度最小，為3.81%；G68 和A86 GS 活性降低比較大，分別為12.81%和11.92%，BL22 降低最小，為2.27%；A86 GOGTA 活性降低最大，為21.69%，BL22 降低最小，為0.35%，說(shuō)明低氮脅迫對(duì)A86的氮代謝相關(guān)酶活性影響比較大，而對(duì)BL22 的影響非常小。

表4 低氮脅迫對(duì)藜麥根系活力及氮代謝相關(guān)酶活性的影響Table 4 Effects of low nitrogen stress on quinoa root activity and enzyme activities related to nitrogen metabolism

如表5 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫后藜麥品系的可溶性蛋白含量降低，降低范圍在1.29%～23.73%；可溶性糖含量均升高，除BL22 差異不顯著外，其他品系差異均顯著，其中G68、BL77、A86 升高較大，分別為59.02%、42.23%和37.59%，BL22 升高最低，為3.13%；大部分藜麥品系Pro含量處于升高趨勢(shì)，說(shuō)明低氮脅迫使植物體內(nèi)Pro積累，為細(xì)胞正?；顒?dòng)提供足夠的自由水。

表5 低氮脅迫對(duì)藜麥滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Table 5 Effects of low nitrogen stress on quinoa osmotic mediation substances

2.4 低氮脅迫對(duì)不同藜麥品系氮素含量及氮利用效率的影響

如表6 所示，與正常供氮相比，低氮脅迫后，不同藜麥的全氮含量和植株氮積累量都表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，而氮利用效率表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，A86 的全氮含量和氮積累量降低最多，BL22 的全氮含量和氮積累量降低最少。

表6 低氮脅迫對(duì)藜麥氮素含量及氮利用效率的影響Table 6 Effects of low nitrogen stress on quinoa nitrogen content and nitrogen utilization efficiency

2.5 主成分分析

2.5.1 各綜合指標(biāo)載荷系數(shù)及貢獻(xiàn)率 如表7 所示，對(duì)26 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，前4 個(gè)綜合指標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率分別為47.463%、18.447%、10.066%、7.983%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)83.959%，因此這4 個(gè)主因子可以代表9 個(gè)藜麥品系所測(cè)定的26個(gè)指標(biāo)的大部分信息。第1 主成分中，植株氮積累量、全氮含量、氮利用效率、根干重、最大根長(zhǎng)、根冠比的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說(shuō)明第1 主成分反映的是植株氮素吸收利用情況和部分根系生長(zhǎng)的情況；第2 主成分中，SOD 活性、POD 活性、GOGTA 活性的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說(shuō)明第2 主成分反映的是植株生理特性變化的情況；第3主成分中，SPAD 值、株高、莖粗、莖葉干重的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說(shuō)明第3 主成分反映的是植株地上部分生長(zhǎng)情況；第4 主成分中，F(xiàn)o、Fm、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量的載荷系數(shù)絕對(duì)值較大，說(shuō)明第4 主成分反映的是植株葉片熒光參數(shù)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的相關(guān)信息。

表7 各綜合指標(biāo)載荷系數(shù)及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 7 Load coefficient and cumulative contribution rate of each comprehensive index

2.5.2 不同藜麥品系的綜合指標(biāo)值、權(quán)重、D值及綜合評(píng)價(jià) 如表8 所示，綜合評(píng)價(jià)值（D值）最高的是BL22，說(shuō)明其對(duì)低氮脅迫不敏感，耐低氮能力最強(qiáng)，其他依次是HL93、BL77、G36、A29、BL23、HL58、A86，最低的是G68，說(shuō)明其對(duì)低氮脅迫很敏感，耐低氮能力最弱。

表8 不同藜麥品系的綜合指標(biāo)值、權(quán)重、D 值及排序Table 8 Comprehensive index values,weights,D values and ranking of different quinoa lines

2.6 聚類分析

如圖4 所示，采用歐式平方距離法，對(duì)D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類，在垂直虛線處可將9 個(gè)藜麥品系分為3 類，即耐低氮型、中間型和低氮敏感型，BL22為耐低氮型，HL93、BL77、G36、A29、BL23 為中間型，HL58、A86 和G68 為低氮敏感型。

圖4 9 個(gè)藜麥品系耐低氮能力系統(tǒng)聚類圖Fig.4 Cluster diagram of low nitrogen tolerance of nine quinoa strains

3 討論

在土地瘠薄和土壤缺氮地區(qū)，選育耐低氮能力強(qiáng)的作物品種是減少化肥用量和提高作物產(chǎn)量的有效方法[25-26]。植物在逆境脅迫中，其生長(zhǎng)特性和生理生化特性都會(huì)受到影響[8]。前人[27-28]研究表明，作物在受到低氮脅迫后地上部和地下部分的生長(zhǎng)都會(huì)受到抑制，但地上部分受抑制程度高于地下部分，且氮素利用效率會(huì)升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低氮脅迫后藜麥的莖葉生長(zhǎng)和根系生長(zhǎng)都受到了抑制，與前人研究結(jié)果一致，但藜麥?zhǔn)芤种瞥潭葏s沒(méi)有玉米和苦蕎等物種那么高，可能是由于不同物種遺傳特性不同，說(shuō)明藜麥耐瘠薄的能力比玉米等物種強(qiáng)[25,27]；低氮脅迫后最大根長(zhǎng)增加，說(shuō)明其在低氮環(huán)境中為了吸收更多的養(yǎng)分，適應(yīng)低氮環(huán)境而伸長(zhǎng)根長(zhǎng)。研究[1,29-30]表明，植物在逆境中會(huì)通過(guò)自身酶活性的變化來(lái)調(diào)節(jié)生理特性以適應(yīng)環(huán)境，例如POD 活性的增強(qiáng)可以抵抗膜脂過(guò)氧化的傷害，可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加可以提高葉片的滲透調(diào)節(jié)能力，本研究結(jié)果顯示，低氮脅迫下藜麥的SOD、POD 活性和Pro、MDA、可溶性糖含量升高，說(shuō)明藜麥在低氮環(huán)境下能夠通過(guò)升高SOD、POD 活性來(lái)清除細(xì)胞中的過(guò)氧化物和自由基，同時(shí)積累大量Pro 和可溶性糖保持細(xì)胞較高的水勢(shì)來(lái)維持植物體正常的生命活動(dòng)；可溶性蛋白含量、根系活力、NR、GS 和GOGTA 活性下降，且程度都是低氮敏感性品種大于耐低氮型品種，說(shuō)明低氮脅迫后藜麥的氮同化酶和氮代謝相關(guān)酶受到影響，蛋白質(zhì)合成受到抑制；低氮脅迫后藜麥的Fo升高，F(xiàn)m和Fv/Fm降低，這與前人[25,27]對(duì)玉米和苦蕎的研究結(jié)果一致，說(shuō)明低氮脅迫后藜麥光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心失活減弱了光合電子的傳遞能力，導(dǎo)致光合效率降低。

在綜合評(píng)價(jià)篩選作物品種時(shí)，前人用了許多方法，例如張楚[25]采用水培方式對(duì)不同基因型苦蕎的25 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，用隸屬函數(shù)法、主成分分析法和聚類分析法篩選出耐低氮型苦蕎品種。李強(qiáng)等[27]采用水培和盆栽的方式對(duì)不同基因型玉米的25 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，采用模糊隸屬法和主成分分析法相結(jié)合來(lái)篩選出耐低氮的玉米品種。本試驗(yàn)采用盆栽方式對(duì)9 個(gè)不同藜麥品系的26 個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，采用主成分提取和模糊隸屬函數(shù)法相結(jié)合計(jì)算出各藜麥品系的綜合耐低氮評(píng)價(jià)值（D值），再采用平方歐式距離法按D值進(jìn)行聚類分析，篩選出1 個(gè)耐低氮型藜麥品系BL22，5個(gè)中間型品系HL93、BL77、G36、A29 和BL23，以及3 個(gè)低氮敏感性品系HL58、A86 和G68。

4 結(jié)論

低氮脅迫下，藜麥地上部分生長(zhǎng)受到抑制，莖葉干重降低，地下部分最大根長(zhǎng)增大，根系干重增加，導(dǎo)致根冠比增加；葉綠素含量降低，F(xiàn)o升高，F(xiàn)m和Fv/Fm降低，根系活力、NR、GS、GOGTA活性、可溶性蛋白含量下降，而SOD 和POD 活性和MDA、可溶性糖、Pro 含量升高，植株氮積累量降低，但氮素利用率升高。