賈國(guó)濤 王曉瑜 孫溢明 聶聰 何靜宇 馮穎杰 馬勝濤 崔廷 程?hào)|旭 姚倩 李悅 張子穎 王寶林 劉惠民

（1 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，450000，河南鄭州；2 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，450001，河南鄭州）

煙葉是卷煙工業(yè)的基礎(chǔ)，不同生態(tài)區(qū)域條件下，煙葉質(zhì)量風(fēng)格特征存在明顯差異，其中游離氨基酸含量與煙葉風(fēng)格特征有密切的關(guān)系[1]。游離氨基酸是指以游離狀態(tài)存在、未結(jié)合在蛋白質(zhì)分子中的氨基酸，是煙草中重要的含氮化合物，不僅具有重要的生理功能，而且是煙葉香氣的主要來(lái)源之一[2-3]。在煙葉的調(diào)制和醇化過(guò)程中，游離氨基酸與煙草中的還原糖或羰基化合物之間發(fā)生酶催化及非酶催化的棕色化反應(yīng)，生成多種具有煙草香味特征的吡咯、吡哺、吡嗪和吡啶類等雜環(huán)化合物，可以賦予煙氣烤焙香、堅(jiān)果香和甜焦糖味，對(duì)煙氣的香味有重要作用。某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇和苯乙醇等，這些成分對(duì)煙草的香味具有重要影響[4-7]。近年來(lái)，關(guān)于烤煙游離氨基酸的研究越來(lái)越多。程昌合等[8]通過(guò)對(duì)濃香型、中間香型和清香型烤煙游離氨基酸組成和含量的差異分析，發(fā)現(xiàn)濃香型氨基酸含量普遍高于中間香型。李永智等[9]對(duì)9 個(gè)品種在3 個(gè)不同海拔的游離氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種游離氨基酸含量差異明顯，且隨海拔的升高而增加。王樹(shù)聲等[10]分析了31 份煙葉游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）和酪氨酸（Tyr）含量與評(píng)吸質(zhì)量呈正相關(guān)，亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）和游離氨基酸總量與評(píng)吸質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。

目前，針對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、品種和海拔的烤煙游離氨基酸的研究較多，而關(guān)于我國(guó)不同生態(tài)區(qū)域烤煙游離氨基酸含量與煙葉內(nèi)在品質(zhì)關(guān)系的報(bào)道較少。因此，以不同香型風(fēng)格烤煙生態(tài)區(qū)煙葉樣品為研究對(duì)象，分析烤煙游離氨基酸含量差異及其相關(guān)性，為煙葉種植區(qū)劃及特色優(yōu)質(zhì)煙葉開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為2018 年全國(guó)17 個(gè)省份56 個(gè)地區(qū)共249份原料樣品，包括84 個(gè)B2F（上部葉）、84 個(gè)C3F（中部葉）和81 個(gè)X2F（下部葉），依據(jù)文獻(xiàn)[11]將全國(guó)烤煙煙葉劃分為8 個(gè)香型生態(tài)區(qū)域（表1）。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

取各等級(jí)樣品30 片，進(jìn)行去梗、烘干和粉碎處理，然后過(guò)0.30mm 篩，用于常規(guī)化學(xué)成分分析。使用連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3，德國(guó)SEAL），由中國(guó)煙草鄭州煙草研究院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[12]測(cè)定煙葉總氮、煙堿、總糖、還原糖、鉀和氯等常規(guī)化學(xué)成分含量；用鹽酸調(diào)節(jié)的檸檬酸鋰緩沖液萃取煙葉中游離氨基酸，使用氨基酸分析儀（Biochrom 30）測(cè)定氨基酸含量[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、SPSS 22.0 和R 語(yǔ)言（R-4.2.1）進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、方差分析、相關(guān)性分析和熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位烤煙游離氨基酸含量的描述性統(tǒng)計(jì)分析

由表2 可知，烤煙游離氨基酸含量整體表現(xiàn)為Pro 含量最高，其次為天冬酰胺（Asn），蛋氨酸（Met）含量最低。不同部位烤煙游離氨基酸Asn、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、Gly、丙氨酸（Ala）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）和色氨酸（Trp）含量表現(xiàn)為上部葉＞下部葉＞中部葉，且上部葉與其他部位都存在顯著性差異。中部葉蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）和苯丙氨酸（Phe）含量顯著低于其他部位。下部葉天冬氨酸（Asp）和纈氨酸（Val）含量顯著高于其他部位。不同部位烤煙游離氨基酸胱氨酸（Cys）、Leu、氨基丁酸（4-Gaba）和Pro 含量都存在顯著性差異，Ser和Met 含量無(wú)顯著差異。上部葉、中部葉和下部葉游離氨基酸總量分別為15 555.79、11 650.82 和11 280.83μg/g。

表2 不同部位烤煙游離氨基酸含量比較Table 2 Comparison of free amino acid contents in different parts of flue-cured tobaccoμg/g

2.2 烤煙游離氨基酸相關(guān)性分析

如圖1 所示，烤煙游離氨基酸主要以正相關(guān)為主，其中Thr 與Glu、Gln、Tyr、4-Gaba、Lys、His、Trp，Asn 與Glu、Gln、Leu、Phe、Lys、His、Typ、Arg，Glu 與Gln、Phe、4-Gaba、His、Trp，Gln 與Tyr、Phe、4-Gaba、Lys、His、Typ、Arg，Gly 與Ala、4-Gaba，Ala 與4-Gaba，Leu 與4-Gaba，Tyr與Phe、His、Trp，Phe 與Lys、His、Typ，4-Gaba與Lys、His、Typ，Lys 與His、Typ、Arg，His 與Typ、Arg 都為正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)都不小于0.80，且都在0.001 水平上顯著相關(guān)。Val 與Asn、Gln、Lys、His、Typ、Arg、Pro 為負(fù)相關(guān)關(guān)系，在0.001水平上顯著相關(guān)；Ser 與Met、Val 與Leu 為極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；Val 與Thr、Gly、Ala、Tyr，Met 與Pro 為顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

圖1 烤煙游離氨基酸含量相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of free amino acid contents in flue-cured tobacco

2.3 不同生態(tài)區(qū)域烤煙游離氨基酸熱圖分析

熱圖是近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的一種統(tǒng)計(jì)方法，可以簡(jiǎn)單地聚合大量數(shù)據(jù)，將結(jié)果以一種漸進(jìn)的色帶直觀地展現(xiàn)出來(lái)，能夠看出數(shù)據(jù)的疏密和頻率高低程度。對(duì)8 個(gè)生態(tài)區(qū)域21 種烤煙游離氨基酸含量分析（圖2），從不同生態(tài)區(qū)域來(lái)看，烤煙游離氨基酸總量整體表現(xiàn)為Ⅳ＞Ⅶ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅴ＞Ⅵ。8 個(gè)生態(tài)區(qū)可以劃分為3 類，第1 類包括南嶺丘陵生態(tài)區(qū)-焦甜醇甜香型（Ⅴ）和武夷丘陵生態(tài)區(qū)-清甜蜜甜香型（Ⅵ），該類Asp、Thr、Asn、Ala、His、Arg、Pro 含量和氨基酸總量低；第2 類包括黃淮平原生態(tài)區(qū)-焦甜焦香型（Ⅳ）和沂蒙丘陵生態(tài)區(qū)-蜜甜焦香型（Ⅶ），該類Asn、Gln、Leu、Phe、Lys、His、Pro 含量和氨基酸總量高；第3 類包括東北平原生態(tài)區(qū)-木香蜜甜香型（Ⅷ）、西南高原生態(tài)區(qū)-清甜香型（Ⅰ）、黔桂山地生態(tài)區(qū)-蜜甜香型（Ⅱ）和武陵秦巴生態(tài)區(qū)-醇甜香型（Ⅲ），該類Ser 含量高，氨基酸總量處于中間水平。根據(jù)游離氨基酸含量，可以分4 類，第1 類為Arg、Lys、Gly、Leu、Ile 和Met，整體含量最低；第2 類為4-Gaba、Phe、Trp、His、Tyr、Thr 和Cys，整體含量較低；第3 類為Glu、Asp、Ser、Val、Ala、Gln 和Asn，整體含量高；第4 類為Pro 和氨基酸總量，含量最高。

圖2 不同生態(tài)區(qū)域烤煙游離氨基酸含量熱圖Fig.2 Heatmap of free amino acid contents in flue-cured tobacco in different ecological regions

2.4 烤煙游離氨基酸與常規(guī)化學(xué)品質(zhì)相關(guān)性

對(duì)烤煙游離氨基酸與常規(guī)化學(xué)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3），相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值不小于0.4?？偺呛瓦€原糖含量與Asn、Glu、Gly、Ala、Leu、Phe、4-Gaba、Lys、His、Trp、Arg 含量及氨基酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ser 含量呈顯著正相關(guān)；總氮含量與Asn、Glu、Gln、Gly、Ala、Cys、Leu、4-Gaba、Lys、His、Trp、Arg、Pro 含量及氨基酸總量呈顯著正相關(guān)；煙堿含量與Gly、Arg、Pro 含量呈顯著正相關(guān)；鉀含量與Gln、Ala、Lys、His、Trp、Arg、Pro 含量及氨基酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Val 含量呈顯著正相關(guān)；糖堿比與Asn、Gly、Ala、Leu、Lys、His、Arg、Pro 含量及氨基酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ser 含量呈顯著正相關(guān)；氯含量、氮堿比和鉀氯比與烤煙游離氨基酸含量無(wú)顯著相關(guān)性。

圖3 烤煙游離氨基酸含量與常規(guī)化學(xué)品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis between free amino acid contents and conventional chemical quality indexes of flue-cured tobacco

3 討論

全國(guó)烤煙游離氨基酸總量整體表現(xiàn)為上部葉＞中部葉＞下部葉，Pro 含量最高，其次為Asn，Met 含量最低，這與陳文等[14]研究得出的我國(guó)主要煙區(qū)的烤煙游離氨基酸包括Pro、Ala、Asn、Arg、Asp 和Phe 結(jié)果基本一致。白寶璋等[15]通過(guò)對(duì)烤煙品種NC89 研究發(fā)現(xiàn)，Phe 含量隨著部位的上升而逐漸上升，而Tyr 含量隨部位的上升逐漸下降，與本研究中部葉Phe 和Tyr 含量最低的結(jié)果不一致，這可能是本試驗(yàn)烤煙品種種類多有關(guān)。烤煙游離氨基酸含量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，烤煙游離氨基酸主要以正相關(guān)為主。

煙葉的香型風(fēng)格與烤煙游離氨基酸含量密切相關(guān)[2]。本研究通過(guò)對(duì)不同生態(tài)區(qū)域烤煙游離氨基酸進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)烤煙游離氨基酸總量整體表現(xiàn)為Ⅳ＞Ⅶ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅴ＞Ⅵ。黃淮平原生態(tài)區(qū)-焦甜焦香型（Ⅳ）和沂蒙丘陵生態(tài)區(qū)-蜜甜焦香型（Ⅶ）氨基酸總量高，南嶺丘陵生態(tài)區(qū)-焦甜醇甜香型（Ⅴ）和武夷丘陵生態(tài)區(qū)-清甜蜜甜香型（Ⅵ）氨基酸總量低，這與李好麗等[16]的研究結(jié)果基本一致。本研究中，Ⅷ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ生態(tài)區(qū)Ser 含量高，而董洪旭等[2]研究表明，清香型產(chǎn)區(qū)的Asp 和Ser 含量較高。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ生態(tài)區(qū)屬于清香型煙葉生產(chǎn)適宜區(qū)，煙葉質(zhì)量符合工業(yè)需求，可用性高[17]。

煙葉化學(xué)成分是決定煙葉質(zhì)量的內(nèi)在因素，煙草及其制品的品質(zhì)主要是由其內(nèi)在化學(xué)成分的組成及含量決定[18]。本研究表明，總糖和還原糖含量與Ser 含量呈顯著正相關(guān)，Ser 含量高的Ⅷ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生態(tài)區(qū)煙葉總糖和還原糖含量也高[19]。楊德廉等[20]研究表明，煙草中游離氨基酸與化學(xué)派生值之間存在著一定的相關(guān)關(guān)系，其中糖堿比與Asn、Gly、Ala、Leu、Lys、His、Arg、Pro 含量及氨基酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ser 含量呈顯著正相關(guān)。鉀含量與Gln、Ala、Lys、His、Trp、Arg、Pro 含量及氨基酸總量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Val 含量呈顯著正相關(guān)，而鉀含量低不利于煙葉的燃燒性。

4 結(jié)論

全國(guó)烤煙游離氨基酸總量整體表現(xiàn)為上部葉＞中部葉＞下部葉，Pro 含量最高，其次為Asn，Met 含量最低。其中烤煙游離氨基酸Asn、Glu、Gln、Gly、Ala、Lys、His 和Trp 含量表現(xiàn)為上部葉＞下部葉＞中部葉?？緹熡坞x氨基酸含量主要以正相關(guān)為主。不同生態(tài)區(qū)域烤煙游離氨基酸總量整體表現(xiàn)為Ⅳ＞Ⅶ＞Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅷ＞Ⅴ＞Ⅵ。不同生態(tài)區(qū)域總糖、還原糖、鉀含量和糖堿比與大部分游離氨基酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。