＊陳玉婷 李桂瀅 宋成 伍仕權 龍思雨 朱良茂 楊孝容

（樂山師范學院新能源材料與化學學院 四川 614000）

抗生素在水產養(yǎng)殖中用于治療和預防動物的疾病以及促進生長和提高飼料的利用率，使用非常廣泛，但攝入體內的抗生素大部分以原藥或初級代謝的方式排出體外進入環(huán)境，部分沉積在底泥，環(huán)境中抗生素殘留以及耐藥細菌的傳播、擴散等引起環(huán)境污染[1-3]。通過水體和底泥抗生素含量監(jiān)測，可以了解抗生素的使用和殘留情況。底泥的成分復雜，有很強的吸附性，影響底泥抗生素監(jiān)測準確度的主要因素是提取方法相關報道較多[4-6]。

本文以高效液相色譜-串聯(lián)質譜為監(jiān)測手段，以加標回收率為指標，單因素變量法優(yōu)化底泥抗生素的提取方法，為準確測定底泥磺胺類抗生素提供技術支持。

1.實驗部分

(1)主要儀器與試劑

LC-20A和LC-MS 8030三重四級桿液相色譜-質譜聯(lián)用儀配電噴霧電離源（ESI），ATY124分析天平，HLB 200mg/6mL小柱，上述購置日本島津；ST 16R冷凍離心機（賽默飛世爾）；固相萃取裝置（美國Supelco公司）；DOA-P504-BN真空泵（GAST公司）；LGJ-12A冷凍干燥機（四環(huán)科儀）；KQ-300GDV超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；NK200-1B氮吹儀（無錫沃信儀器有限公司）；0.22μm濾膜。

磺胺標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司：磺胺二甲異嘧啶（SMO）、磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SP）、磺胺甲基嘧啶（SMZ1）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ2）、磺胺甲噻二唑（STZ）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺對甲氧嘧啶鈉鹽（SME）、磺胺間甲氧嘧啶鈉鹽（SMM）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDO）、磺胺甲噁唑（SMX）、磺胺二甲異噁唑（SDX）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQO）。

檸檬酸，磷酸氫二鈉，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），氫氧化鈉，磷酸，上述試劑均為分析純；甲酸和甲醇為色譜純（r）。實驗用水為怡寶飲用純凈水。

(2)溶液的配制

用甲醇配制200mg/L的單標儲備液，儲于4℃冰箱；臨時用甲醇配制4.0mg/L的混標工作液；用定容液配制為5～500μg/L混標溶液。

0.1mol/L檸檬酸溶液；0.05mol/L EDTA-0.05 mol/L Na2HPO4溶液，用NaOH溶液或H3PO4溶液調節(jié)至所需pH。

(3)樣品前處理

將采集的養(yǎng)魚池塘底泥，冷凍干燥，研磨過60目的篩子并裝于自封袋放干燥器備用。

條件優(yōu)化：稱取2g（稱至0.0001g）4份樣品于50mL離心管中，兩份加入1.0μg/mL標液2.00mL，另外兩份不加標樣，每支離心管加入10.0mL提取液（緩沖溶液VmL+甲醇(10-V)mL），20℃超聲10min，5000r/min 20℃離心10min，離心液轉入試劑瓶，殘渣再重復兩次以上操作，合并3次離心液加水至150mL左右，用1.0 mol/L的磷酸和氫氧化鈉調節(jié)pH；過HLB小柱凈化富集（小柱用5mL甲醇和5mL水活化），拋棄流出液，再用5～10mL水淋洗小柱；減壓抽15min，用8mL甲醇洗脫，收集洗脫液于15mL離心管中，40℃氮吹至干，用甲醇-0.5%甲酸水溶液（3:7）的定容液2.00mL溶解，過0.22μm濾膜裝于色譜樣品瓶，按“1.4”的色譜和質譜條件分析。

(4)色譜條件和質譜條件

色譜條件：用Shim-pack VP-ODS（150mm×2.0 mm，5μm）色譜柱；流速0.3mL/min；進樣量5μL；柱溫35℃；運行時間19min；流動相A 0.2%甲酸水溶液，B甲醇；梯度洗滌程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗滌程序

質譜條件：離子化模式為電噴霧正離子模式；掃描模式為多反應監(jiān)測；碰撞氣為氬氣；毛細管電壓4.5kV；霧化氣為氮氣3L/min；干燥氣為氮氣15L/min；加熱模塊溫度400℃；DL溫度250℃。

2.結果與討論

(1)色譜條件和質譜條件的優(yōu)化結果

配制濃度為500μg/L的17種磺胺溶液的單標，選擇Sacn（+）模式，Q3掃描尋找母離子，以母離子作為前體離子m/z，系統(tǒng)軟件自動優(yōu)化產物離子及MRM參數(shù)；然后接上色譜柱優(yōu)化色譜條件，色譜條件見表1；17種抗生素的色譜保留時間和質譜參數(shù)見表2。

表2 17種磺胺的保留時間和質譜參數(shù)

(2)緩沖溶液的選擇

緩沖溶液：0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA），pH6.5的Na2HPO4-EDTA和pH10.0的Na2HPO4-EDTA。緩沖溶液8.0mL+甲醇2.0mL提取，調節(jié)pH3.0過HLB小柱，其余與“1.3”相同，樣品加標回收率見圖1。

圖1 不同pH緩沖液的樣品加標回收率

從圖1可知，緩沖溶液與甲醇按8:2提起磺胺類抗生素，檸檬酸緩沖液和pH10緩沖溶液的整體效果較pH6.5緩沖溶液的效果好。但二者的效果懸殊不大。實驗選擇緩沖液0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA）溶液進行后續(xù)實驗。

(3)過HLB小組的pH選擇

以0.1mol/L檸檬酸8.0mL與2.0mL甲醇（加0.1g EDTA），其余與“1.3”節(jié)相同，過HLB小柱前調節(jié)溶液的pH3.0和5.0，考察加標回收率，實驗結果見圖2。圖2表明過柱溶液的pH對磺胺類抗生素的加標回收率的影響不明顯。后續(xù)實驗選擇提取液調節(jié)pH3.0過小柱。

圖2 pH3.0和pH5.0過柱的樣品加標回收率

(4)提取液的選擇

以0.1mol/L檸檬酸+甲醇（加0.1g EDTA）8.0mL+2.0mL、7.0mL+3.0mL、6.0mL+4.0mL和5.0mL+5.0mL，選擇提取液，結果見圖3。

圖3 甲醇與檸檬酸溶液的比例對加標回收率的影響

圖3表明，多數(shù)磺胺以0.1mol/L檸檬酸與甲醇8:2～5:5（加0.1g EDTA）作提取液的加標回收率差異不大，但SDX和SQO提取液中甲醇40%～50%較理想。后期實驗選擇0.1mol/L檸檬酸（含0.1g EDTA）6.0mL+4.0mL甲醇作提取液。

(5)不同加標濃度回收率的測定

在樣品中分別加入0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.25μg/mL的混標2.00mL，提取液采用0.1mol/L的檸檬酸6.0mL+4.0mL甲醇，加入0.1g EDTA，其余與“1.3”完全相同，相當于加標濃度0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.25mg/kg，每種加標濃度平行4次。加標回收率結果見圖4。

圖4 三種濃度的加標回收率

圖4可知，17種磺胺的三個水平的樣品平均加標回收率在61%～97%，相對標準偏差RSD在1.1%～8.9%。除SA和SQO的加標回收率可能低于70%，其余15種磺胺的樣品加標回收率在70%～97%。

本文優(yōu)化的提取水產養(yǎng)殖底泥中磺胺類抗生素的方法，三個加標水平的回收率與文獻[3-6]報道的回收率相當或約高，但本文的提取溶劑和洗脫劑更簡單，有機溶劑的用量較少。

3.結論

本文固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法優(yōu)化了水產養(yǎng)殖底泥中17種磺胺類抗生素的提取方法。采用0.1mol/L檸檬酸與甲醇6:4加0.1g EDTA提取3次，合并提取液稀釋至150mL，調節(jié)pH3.0，用HLB固相萃取小柱富集凈化，甲醇洗脫，氮吹濃縮，甲醇-0.5%甲酸水溶液3:7溶解定容，以0.2%甲酸水溶液-甲醇作流動相色譜梯度洗滌分離，串聯(lián)質譜正離子模式多反應監(jiān)測。提取劑簡單、成本較低、底泥樣品的加標回收率高，可用于水產養(yǎng)殖底泥磺胺類抗生素的測定。