金 哲, 董環(huán)宇, 金銘路, 任昭輝, 蘇 亮, 李俊明, 樸世領(lǐng)*

(1.吉林省煙草公司延邊州公司;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院:吉林 延吉 133002;3.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,長(zhǎng)春 130033)

低溫脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育及作物產(chǎn)量最主要的逆境脅迫之一,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量降低,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株死亡[1]。水楊酸(Salicylic acid, SA)是一種小分子酚類化合物,廣泛存在于植物體內(nèi),逆境條件下,可使植物保持較高的抗氧化酶活性,增強(qiáng)其抗氧化能力[2],從而增強(qiáng)植物的耐寒力。相關(guān)研究表明,SA可增強(qiáng)植物在低溫脅迫下細(xì)胞膜穩(wěn)定性和抗氧化酶活性,抑制丙二醛和活性氧積累,增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,緩解低溫脅迫對(duì)植物造成的損傷[3-4]。以往的研究已經(jīng)證實(shí)了水楊酸對(duì)植物耐寒性的顯著作用,但有關(guān)東北地區(qū)在低溫脅迫下施加外源水楊酸對(duì)烤煙生理特性的影響鮮有報(bào)道。該研究對(duì)煙草苗期葉面噴施4個(gè)梯度的外源水楊酸處理,對(duì)與耐寒性相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析,篩選出外源水楊酸的最佳施用濃度,為后續(xù)研究煙草低溫脅迫的機(jī)理和在生產(chǎn)上緩解低溫脅迫對(duì)煙草的不利影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以課題組前期工作篩選出的低溫敏感型品種NC82為試材,所需的種子材料由吉林省延邊朝鮮族自治州農(nóng)科院煙草研究所提供,外源水楊酸購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 種子預(yù)處理及育苗 試驗(yàn)所需種子播種前用濃度為1%無(wú)水硫酸銅消毒15 min,之后用清水浸種24 h,然后用播種于540 mm×280 mm的裝有基質(zhì)(腐殖質(zhì)、草炭土、細(xì)紗為10∶10∶1)的72孔簡(jiǎn)塑盤中,在溫室內(nèi)育苗,3葉齡時(shí)選擇壯苗假植至32孔簡(jiǎn)塑料盤(540 mm×275 mm)。

2) 低溫脅迫及不同濃度水楊酸處理 苗期達(dá)到5～6葉齡時(shí),連續(xù)3 d每天上午9:00用不同濃度SA進(jìn)行葉面噴施處理1次,SA濃度梯度分別為0.5(T1)、1(T2)、1.5(T3)、2.0(T4) mmol/L,每株噴施量相同,約為1.5～2 mL。葉面噴施后24 h放于人工氣候箱中進(jìn)行11 ℃低溫光照培養(yǎng)。常溫對(duì)照(CK)葉面噴水后在人工氣候箱中25 ℃培養(yǎng),低溫對(duì)照(CK0)葉面噴水后先在氣候箱中25 ℃培養(yǎng)3 d后再進(jìn)行11 ℃低溫處理,氣候箱白天光照度設(shè)置為100～560 μmol/(m2·s),光照時(shí)數(shù)12 h,相對(duì)濕度80%。于0、2、6、8 d選取長(zhǎng)勢(shì)一致烤煙幼苗進(jìn)行取樣,每個(gè)處理3次重復(fù),并放于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1) 干物質(zhì)積累量和根系活力的測(cè)定 采用常壓干燥法進(jìn)行測(cè)定[6]。對(duì)煙株去泥洗凈后測(cè)定鮮重,后置入設(shè)定在100～105 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-1A型)中完成干燥過程。連續(xù)烘干至3次恒重,冷卻結(jié)束后,測(cè)定其質(zhì)量,得到干重。根系活力參考TTC法進(jìn)行測(cè)定[7]。

2) 抗氧化酶活性和脯氨酸含量的測(cè)定 SOD活性參考氮藍(lán)四唑法進(jìn)行測(cè)定[8];CAT活性參考分光光度法進(jìn)行測(cè)定[9];POD活性參考愈創(chuàng)木酚測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定[10];脯氨酸含量參考茚三酮比色法進(jìn)行測(cè)定[11]。

3) 葉綠素及活性氧代謝指標(biāo)的測(cè)定 選取長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗,由上至下第3片真葉采用SPAD-205葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量。電導(dǎo)率采用ORION TDS型電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定,MDA含量參考硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及主成分分析

使用SPSS20和Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪圖。對(duì)4個(gè)梯度SA處理各生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。并采用8 d時(shí)各低溫脅迫處理的生理生化指標(biāo)為耐寒性評(píng)價(jià)的原始數(shù)據(jù),對(duì)其進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)SA濃度處理低溫脅迫后干物質(zhì)和根系活力變化規(guī)律

不同濃度SA處理對(duì)干物質(zhì)積累量的影響列于表1。與常溫對(duì)照(CK)處理相比,各低溫脅迫處理的干重隨低溫天數(shù)增加呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),低溫脅迫2～4 d時(shí),各處理之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05);脅迫至8 d時(shí),各低溫脅迫處理均顯著低于CK處理(P<0.05),外施水楊酸濃度T1(0.5 mmol/L)和T2(1 mmol/L)處理間無(wú)顯著性差異,且均高于其余低溫處理;與常溫對(duì)照相比,T2和T1處理降幅均較小,分別為T2(-8.33%)和T1(-8.95%),其次為T3(-12.65%)和T4(-12.96%),下降幅度最大的是CK0(-13.27%);綜合來看外施SA濃度為T2處理時(shí)表現(xiàn)最好,最接近CK處理,低溫脅迫后仍能保持較高的干物質(zhì)積累量。

表1 不同濃度SA處理對(duì)干物質(zhì)積累量的影響

不同濃度SA處理對(duì)根系活力的影響見表2。

表2 不同濃度SA處理對(duì)根系活力的影響

低溫脅迫后各低溫脅迫處理根系活力均出現(xiàn)逐漸下降的變化規(guī)律,而常溫對(duì)照(CK)處理呈平穩(wěn)上升趨勢(shì),低溫脅迫8 d時(shí),T1與T2處理間無(wú)顯著性差異(P>0.05),但均顯著高于其余低溫脅迫處理,大小順序依次為CK、T2、T1、T3、T4和CK0,其中T2處理最接近CK處理,表現(xiàn)最好,而T4處理最接近低溫對(duì)照CK0處理,表現(xiàn)最差;隨脅迫天數(shù)的增加,與常溫對(duì)照(CK)處理相比各低溫脅迫處理根系活力的降幅均隨低溫持續(xù)時(shí)間的增加而增大,低溫處理8 d時(shí),各處理根系活力降幅均達(dá)到最大,其值自大到小分別是CK0(-36.77%)、T4(-35.70%)、T3(-34.45%)、T1(-32.69%)和T2(-30.46%),綜合來看,預(yù)施1 mmol/L濃度的SA處理,可有效減緩根系活力下降程度,效果最好。

2.2 4個(gè)SA濃度處理低溫脅迫后抗氧化酶活性和脯氨酸含量變化規(guī)律

不同濃度SA處理對(duì)POD活性的影響見表3。隨低溫處理天數(shù)的增加,常溫對(duì)照(CK)處理POD活性呈平穩(wěn)上升趨勢(shì),而各低溫脅迫處理均為先升高后降低,處理階段2～4 d,POD活性顯著上升,并在4 d時(shí)達(dá)到最高,其值按大小順序?yàn)?T2(88.21 U/g)、T1(87.29 U/g)、T3(83.25 U/g)、T4(81.92 U/g)、CK0(81.58 U/g)和CK(45.87 U/g),與常溫對(duì)照相比,不同濃度SA處理POD活性增幅均在處理4 d時(shí)最高,其中,T2處理增幅最大,分別為T1、T3、T4和CK0的1.02、1.13、1.17和1.19倍;綜合來看,低溫脅迫前,外施1 mmol/L SA可最大程度地提高煙草苗期的POD活性。

表3 不同濃度SA處理對(duì)POD活性的影響

不同濃度SA處理后SOD活性變化(表4)均呈先升高后降低的趨勢(shì),而常溫對(duì)照(CK)處理穩(wěn)定上升,各處理受到11 ℃低溫脅迫時(shí),SOD活性迅速上升,在2 d時(shí)達(dá)到峰值,大小排序?yàn)門2(220.25 U/g)、T1(218.25 U/g)、T3(213.88 U/g)、T4(207.94 U/g)、CK0(199.32 U/g)和CK(90.62 U/g),T1與T2處理間無(wú)顯著性差異,但均高于其余低溫脅迫處理;低溫處理2 d時(shí),與CK處理相比各低溫脅迫處理增幅迅速增加,并達(dá)到峰值,其增幅大小順序及數(shù)值為T2(143.05%)、T1(140.84%)、T3(136.02%)、T4(129.46%)、CK0(119.95%),T1與T2濃度處理均高于其他濃度處理,但二者間無(wú)顯著差異(P>0.05);綜合來看,外施1 mmol/L SA可最大程度提高低溫脅迫后烤煙苗期的SOD活性。

表4 不同濃度SA處理對(duì)SOD活性的影響

不同濃度SA處理后CAT活性變化(表5)與SOD活性變化基本一致。

表5 不同濃度SA處理對(duì)CAT活性的影響

各低溫脅迫處理均在2 d時(shí)CAT活性達(dá)到最高,分別為T2(205.24 μg/g)、T1(203.26 μg/g)、T3(194.02 μg/g)、T4(189.28 μg/g)和CK0(175.46 μg/g),之后開始下降,而常溫對(duì)照(CK)呈平緩上升趨勢(shì),T1與T2處理間無(wú)顯著性差異(P>0.05),且顯著高于其余低溫脅迫處理(P<0.05);與常溫對(duì)照相比,低溫處理2 d時(shí),各低溫脅迫處理增幅均達(dá)到最高,其中,T2處理增幅最大,分別較T1、T2、T4和CK0處理高2.41、13.62、19.37和36.14個(gè)百分點(diǎn);因此,外施SA濃度為T2時(shí),可最大程度地提高低溫脅迫后烤煙苗期的CAT活性。

不同濃度SA處理對(duì)Pro含量的影響見表6。隨低溫持續(xù)天數(shù)增加,低溫脅迫各處理均呈不斷上升趨勢(shì),且顯著高于常溫對(duì)照(CK),CK處理則保持平穩(wěn)上升趨勢(shì)。低溫處理至8 d時(shí),各處理Pro含量最高,大小順序依次為T2(7.09 μg/g)、T1(6.99 μg/g)、T3(6.62 μg/g)、T4(6.39 μg/g)、CK0(6.81 μg/g和CK(2.95 g/g),T2與T1無(wú)顯著性差異(P>0.05),二者與其他4個(gè)處理均有顯著性差異(P<0.05);與常溫對(duì)照(CK)處理相比,各低溫脅迫處理增長(zhǎng)幅度均隨低溫持續(xù)時(shí)間的增加而增大,低溫處理2 d時(shí),各處理Pro含量增幅間差異不顯著(P>0.05),低溫處理8 d時(shí),各處理Pro含量增幅均達(dá)到最大,其值從大到小分別是T2(140.34%)、T1(136.95%)、T3(124.41%)、T4(116.61%)、CK0(96.95%);綜合來看,外施1 mmol/L SA處理,可有效增加Pro含量,且效果最好。

2.3 4個(gè)SA濃度處理低溫脅迫后葉綠素含量和活性氧代謝指標(biāo)變化規(guī)律

不同濃度SA處理對(duì)葉綠素含量的影響列于表7。隨低溫天數(shù)的增加,各低溫脅迫處理的葉綠素含量與常溫對(duì)照(CK)處理相比,均有不同程度的下降,脅迫至8 d時(shí),各低溫脅迫處理下降程度最明顯,排序自大到小依次為,CK0(25.01 mg/g)、T4(25.61 mg/g)、T3(25.66 mg/g)、T1(26.54 mg/g)和T2(26.78 mg/g),其中T1與T2處理間無(wú)顯著性差異(P<0.05),且均顯著高于其余低溫脅迫處理;脅迫8 d時(shí),與CK處理相比各低溫脅迫處理降幅均達(dá)到最大,按大小排序依次為CK0(-26.55%)、T4(-24.79%)、T3(-24.64%)、T1(-22.06%)、和T2(-21.35%);由此可見,施用適宜濃度的外源SA,可緩解低溫脅迫下煙草苗期的葉綠素下降程度,其中,T2濃度處理表現(xiàn)最為優(yōu)異。

表7 不同濃度SA處理對(duì)葉綠素含量的影響

隨低溫脅迫天數(shù)的增加,各處理MDA含量(表8)均有不同程度的增加,在2～8 d時(shí),MDA積累量均呈平穩(wěn)上升趨勢(shì),常溫對(duì)照(CK)始終趨于平緩趨勢(shì)。處理8 d時(shí),各處理MDA積累量均最高,按大小順序排序?yàn)镃K0(8.78 nmol/g)>T4(8.66 nmol/g)>T3(8.52 nmol/g)>T1(8.19 nmol/g)>T2(7.98 nmol/g),T1與T2處理在8 d時(shí)不存在顯著性差異(P>0.05),但顯著低于CK處理(P<0.05),隨脅迫天數(shù)的增加,各低溫脅迫處理與CK處理相比,MDA含量增幅逐漸上升,6～8 d時(shí),增幅變化較明顯,8 d時(shí),MDA增長(zhǎng)幅度最大,按積累量增幅排序?yàn)镃K0(94.68%)、T4(92.02%)、T3(88.91%)、T1(81.60%)和T2(76.94%)。

表8 不同濃度SA處理對(duì)MDA含量的影響

綜合來看,11 ℃低溫脅迫前,外施適宜濃度的SA處理,可有效減緩MDA積累量,其中,T2(1 mmol/L)濃度處理最佳,最接近CK處理。

不同濃度處理對(duì)電導(dǎo)率的影響見表9,各低溫脅迫處理電導(dǎo)率與MDA積累量變化趨勢(shì)基本一致,隨低溫脅迫天數(shù)不斷增加,均呈急劇上升趨勢(shì),而常溫對(duì)照(CK)處理呈緩慢上升趨勢(shì),各處理均于8 d時(shí)達(dá)到最大值,其中,T2與T1處理電導(dǎo)率均較低,分別為T2(41.88%)和T1(42.54%),2處理間無(wú)顯著性差異(P<0.05),其中,T2濃度處理最接近CK,低溫處理CK0表現(xiàn)最差(50.93%),T4(1 mmol/L)濃度處理與CK0最為接近;與常溫對(duì)照相比,不同濃度SA處理相對(duì)電導(dǎo)率增幅均在處理8 d時(shí)最高,其中,T2和T1處理增幅均較小,分別為18.10%和19.97%,表現(xiàn)較好,而CK0處理最高,為43.63%,表現(xiàn)最差。因此,11 ℃低溫脅迫前,預(yù)施適宜濃度的SA處理,可有效減緩電導(dǎo)率上升,其中,T2(1 mmol/L)濃度處理最佳,最接近CK處理。

表9 不同濃度處理對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.4 4個(gè)SA濃度處理低溫脅迫后8 d時(shí)各指標(biāo)耐寒性主成分分析

對(duì)不同濃度處理基于主成分分析的耐寒性綜合排序結(jié)果見表10。

表10 不同濃度處理低溫脅迫8 d時(shí)各生理指標(biāo)主成分分析總得分及排序

外施SA濃度為1 mmol /L時(shí),耐寒性最強(qiáng),為3.59,0.5和1.5 mmol /L次之,分別為2.39和-0.64,外施2 mmol /L SA的耐寒性最低,為-1.85。

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫會(huì)降低光合速率,影響水分吸收與運(yùn)輸,降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累進(jìn)而降低植物的干物質(zhì)積累量。該研究發(fā)現(xiàn),外施1 mmol/L SA后,烤煙的干物質(zhì)積累量在低溫脅迫各個(gè)時(shí)期均高于低溫對(duì)照處理(CK0),最接近于常溫對(duì)照(CK),有效減緩低溫脅迫后干物質(zhì)積累量的下降幅度,這與許勇等[13]研究一致,這是由于外施水楊酸能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、丙二醛含量以及可溶性糖、脯氨酸等保護(hù)物質(zhì)的合成,改變植物體內(nèi)的堿基平衡狀態(tài),并刺激次生代謝過程[14]。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,直接影響地上部的營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平,低溫脅迫會(huì)抑制根系的生長(zhǎng),同時(shí)也會(huì)改變根的代謝和植物形態(tài)[15-16]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨低溫脅迫天數(shù)的持續(xù),烤煙幼苗生長(zhǎng)受到抑制,而外施4個(gè)梯度的SA處理均能顯著緩解低溫脅迫的抑制作用,且1 mmol/L緩解效果最好,說明外施適宜濃度SA能夠緩解低溫脅迫對(duì)烤煙幼苗根系活力的影響,這與孫波等[17]人研究結(jié)果一致。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)在植物酶促防御機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用,是植物抵御抗氧化的第1道防線[18-19]。SOD能夠清除植物在逆境下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,POD是抗氧化系統(tǒng)的組成部分,可有效降低細(xì)胞膜脂過氧化,CAT的主要作用是清除植物代謝中產(chǎn)生的H2O2,避免H2O2過量積累而對(duì)細(xì)胞造成氧化破壞[20]。該試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),各低溫脅迫處理抗氧化酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì),造成此現(xiàn)象的原因可能是低溫脅迫前期煙株體內(nèi)積累了大量的活性氧,消耗了大量抗氧化酶,導(dǎo)致后期酶活性降低,這與張中華等[21]研究結(jié)果一致。SA作為內(nèi)源信號(hào)分子,能夠刺激植物在遭遇逆境脅迫時(shí)啟動(dòng)生理生化反應(yīng),從而提高酶活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫脅迫前外施1 mmol/L SA,烤煙幼苗的抗氧化酶活性均顯著高于常溫對(duì)照處理,說明外施適宜濃度SA可有效刺激酶活性,清除大量的活性氧,降低膜脂過氧化造成的損害,提高煙草耐寒力,這與張俊康等[22]研究結(jié)果一致。

低溫脅迫下,植物體內(nèi)的脯氨酸含量會(huì)迅速增加,這主要是因?yàn)榈蜏貢?huì)誘導(dǎo)脯氨酸合成酶的活性增強(qiáng),促使脯氨酸生成;同時(shí),低溫也可能減慢脯氨酸降解速度,導(dǎo)致在細(xì)胞中積累[23]。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),外施4個(gè)梯度水楊酸處理均能夠顯著提高植物在低溫脅迫下的脯氨酸含量,減輕低溫脅迫對(duì)烤煙幼苗的損傷,其中,1 mmol/L效果最好,這與李美茹等[24]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)樗畻钏嵊|發(fā)了植物中的信號(hào)傳遞系統(tǒng),使得植物能更有效地適應(yīng)和抵抗低溫脅迫[25]。

前人研究發(fā)現(xiàn)[26],植物在遭遇低溫脅迫時(shí),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜脂過氧化和活性氧自由基積累,細(xì)胞膜完整性遭到破壞,膜透性加大,誘導(dǎo)膜脂氧化產(chǎn)物MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加。該試驗(yàn)結(jié)果表明,11 ℃低溫脅迫后,烤煙葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量迅速上升,表明低溫對(duì)烤煙葉片穩(wěn)定性和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。外施1 mmol/L SA處理顯著降低了MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率,削弱了細(xì)胞膜受損程度,緩解了低溫脅迫對(duì)烤煙幼苗的損害,這與田丹青等[27]、韓浩章等[28]的研究結(jié)果一致。這是由于外施SA可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜中飽和及非飽和脂肪酸的比例來維持質(zhì)膜穩(wěn)定性,保持活性氧代謝系統(tǒng)平衡,進(jìn)而降低膜脂過氧化造成的損害[29]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外施SA濃度過高或過低都不利于緩解低溫脅迫對(duì)幼苗的損害,這可能是由于低濃度的SA不足以抵抗低溫脅迫下自由基對(duì)細(xì)胞的損害,而高濃度SA又不利于SA蛋白與SA相結(jié)合,進(jìn)而導(dǎo)致活性氧自由基的大量積累,這與王詩(shī)雅等[30]的研究結(jié)果一致。

低溫脅迫導(dǎo)致葉綠素合成減少、降解速度加快,以及光合過程受損[31]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外施1 mmol/L外源SA顯著提高了植物葉綠素含量,這主要是因?yàn)樗畻钏峥梢砸种迫~綠素分解酶的活性,降低葉綠素的降解速率;同時(shí),它還可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平,促進(jìn)葉綠素的合成,這與馬曙曉等[32]的研究結(jié)果一致。

主成分分析(PCA,Principal Component Analysis) 是一種常用的數(shù)據(jù)分析方法。其操作是通過線性轉(zhuǎn)換(數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理),將數(shù)量眾多的變量選出較少個(gè)數(shù)重要變量,這些變量能夠概括原始信息的85%以上,并且可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合分析[33-34]。外施水楊酸誘導(dǎo)煙草苗期對(duì)低溫脅迫耐寒性的綜合排序從大到小依次為1 mmol/L>0.5 mmol/L>1.5 mmol/L>2 mmol/L>低溫對(duì)照(CK0)。

綜上所述,外施水楊酸濃度為1 mmol/L時(shí),能夠顯著提高低溫敏感型品種(NC82)的耐寒力,緩解低溫脅迫對(duì)烤煙幼苗造成的損害。