羅 弦，劉 竹，李陽鵬，胡 劍，歐賢紅，譚曉秋,，陳唐葶

1.西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所，醫(yī)學電生理教育部重點實驗室，四川省醫(yī)學電生理重點實驗室（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院（瀘州 646000）

隨著全球人口老齡化的加劇，老齡化已成為心血管疾病、癌癥、糖尿病等人類疾病最主要的危險因素之一。目前我國心血管疾病的發(fā)病率仍持續(xù)增高[1-2]，心血管疾病死亡率占城鄉(xiāng)居民總死亡率的首位[3]，也是老年人死亡的主要原因。心律失常是臨床常見的心血管疾病，可單發(fā)或與其它心血管疾病伴發(fā)，并隨年齡增加而發(fā)病率增加。有報道顯示65 歲以上老年人發(fā)生心律失常的概率約為30.62%，遠高于一般成年人[4-5]，而惡性心律失常也是心血管疾病致死原因之一。本研究旨在通過比較青年和老年小鼠在程序性電刺激下誘發(fā)的室性心律失常（ventricular tachycardia，VT）發(fā)生率，利用光標測技術（optical mapping）對其機制進行探究，為臨床診斷和治療老齡化相關性心律失常提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J青年小鼠（8～12周齡）和老年小鼠（16+月齡），SPF級，各44只，其中36只用于電刺激誘發(fā)心律失常實驗，5 只用于光標測實驗，3 只用于組織形態(tài)學實驗。實驗小鼠來自西南醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK（川）2018-17]，本研究通過西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（編號：20210927-011），動物使用許可證[SCXK（川）2018-065]。

1.2 心電圖及程序性電刺激

將小鼠放入小動物麻醉機（R500，瑞沃德），異氟烷吸入麻醉后，固定在小動物固定板上（仰臥位），經口行氣管插管，連接小動物呼吸機（潮氣量1.2 mL/min，呼吸比5：4）。在小鼠四肢接好電極并記錄心電圖（420 s生理記錄儀，成都泰盟）。穩(wěn)定記錄10 min 基礎心電圖后，進行開胸手術，暴露心臟，撕開心包膜，并安裝好刺激電極，調整刺激器及程控刺激方案（刺激強度5 V，刺激間隔30 ms），給予心室快速起搏，記錄30 min后腹腔注射異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）（1 mmol/kg）[6-7]。實驗分組：青年小鼠直接電刺激為Youth 組，記錄完畢再給予ISO處理后重復電刺激方案，為Youth+ISO組；老年小鼠直接電刺激為Old組，記錄完畢后再給予ISO處理后重復電刺激方案，為Old+ISO組。

1.3 超聲檢測小鼠心臟

使用3%～5%異氟烷氣體誘導麻醉，0.5%～1%異氟烷維持麻醉，保持心率400～450 次/min。胸部備皮后固定在超聲固定板上（仰臥位），超聲探頭置于胸部上方，調整方位，觀察小鼠心臟短軸切面（parasternal short-axis section，PSAX），測量并且記錄相關數據。分析射血分數（ejection fraction，EF）、縮短分數（fractional shortening，FS）、左室舒張末期前壁厚度（end-diastolic left ventricular anterior wall thickness，LVAWd）、左室收縮末期前壁厚度（end-systolic left ventricular anterior wall thickness，LVAWs）、左室舒張期末內徑（enddiastolic left ventricular diameter，LVIDd）、左室收縮末期內徑（end-systolic left ventricular diameter，LVIDs）、左室舒張末期后壁厚度（end-diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）、左室收縮末期后壁厚度（end-systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWs）。

1.4 小鼠心臟、體重及脛骨長度測量

小鼠稱重后，頸椎脫臼處死，取下心臟，4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)實驗，另外部分心臟在PBS液體中洗凈后，濾紙吸干水分，稱重，最后使用游標卡尺測量脛骨長度。

1.5 小鼠心臟HE和Masson染色

將固定好的心臟組織做石蠟包埋，4 μm 切片，常規(guī)HE 和Masson 染色，使用CaseViewer 及Image J 進行圖像采集和分析。

1.6 小鼠心臟光標測記錄

小鼠頸椎脫臼處死后，取出心臟，將主動脈固定在Langendorff 灌流系統(tǒng)。生理鹽溶液（PSS 液）心臟灌流10 min 排出余血，停搏劑Blebbistatin（10 μM）灌流10 min，心臟停止舒縮活動。取電壓敏感染料RH237（1 μM）和Ca2+敏感染料Rhod-2AM（1 μg/mL）循環(huán)灌注染色10 min 后，繼續(xù)循環(huán)灌注停搏劑。在心臟心尖部給予程控刺激（刺激強度5 V，波寬2 ms，頻率10 Hz），MacroLED燈（530 nm）提供激發(fā)光，630 nm長通濾波器收集膜電壓（voltage of membrane，Vm）熒光，585/40 nm帶通濾波器收集Ca2+熒光，同時采集2 種熒光信號值。實驗結束用ElectroMap軟件分析結果[8-9]。

1.7 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計軟件為GraphPad Prism software version 8.0 及IBM SPSS Statistics 22.0。

2 結果

2.1 青年和老年小鼠心電圖及心律失常發(fā)生率比較

老年小鼠和青年小鼠相比，基礎心電圖P 波持續(xù)時間以及P-R、QRS和QT間期相似（圖1A、1B），但老年小鼠表現出更低的心率，表現為R-R 間期延長（t=4.202，P ＜0.001，圖1B）。程序性電刺激誘發(fā)小鼠室性快速性心律失常（圖1C，室性心動過速和心室顫動），兩組小鼠均可誘發(fā)出室性心律失常。給予腹腔注射ISO 5 min之后，老年小鼠室性心律失常的誘發(fā)率顯著高于青年小鼠（P ＜0.01，表1）。由此可見，在急性給予ISO所致的β 腎上腺素能應激條件下，老年小鼠的心律失常易感性增加。

表1 青年和老年小鼠VT發(fā)生率比較Table 1 Comparison of VT occurrence rate between young and aged mice

圖1 青年和老年小鼠心電活動差異Figure 1 Electrocardiogram of young and old mice

2.2 青年和老年小鼠心臟收縮和舒張功能比較

青年小鼠和老年小鼠隨機各選取10 只做超聲心動圖檢測心功能（圖2A、2B）。結果發(fā)現，與青年小鼠相比，老年小鼠的EF 和FS 均顯著降低。老年小鼠的LVIDd，LVIDs，LVPWd 與青年小鼠相比顯著增厚（表2）。

表2 青年小鼠和老年小鼠心臟收縮和舒張功能超聲心動參數比較Table 2 Comparison of cardiac function between young and old mice

圖2 青年和老年小鼠組織學之間的差異Figure 2 Histology differences between young and aged mice

2.3 青年和老年小鼠組織學比較

心臟切片HE 染色可以看出，老年小鼠較青年小鼠心臟體積增大，左心室壁增厚（圖2C、2D、2E）；與青年小鼠相比，老年小鼠心臟質量增加，其心重脛骨長度比顯著升高（t=6.749，P ＜0.001，圖2G）；心肌細胞橫截面積增大（t=21.39，P ＜0.001，圖2H）。Masson染色提示老年小鼠心肌膠原纖維化較青年小鼠嚴重，膠原沉積百分比高于青年小鼠（t=9.929，P ＜0.001，圖2F、2I）。

2.4 青年和老年小鼠心臟動作電位時程和鈣瞬變時程比較

利用光標測技術，在離體組織水平觀察老齡對心臟膜電位和鈣瞬變的影響（圖3）。結果發(fā)現，老齡和ISO處理并無交互作用，但老齡和ISO處理均可以影響動作電位時程（action potential duration，APD）APD80（F=24.32，P ＜0.001 和F=16.28，P ＜0.001）、鈣瞬變時程（calcium transient duration，CaTD）CaTD50（F=4.531，P ＜0.05 和F=26.36，P ＜0.001）和擬合鈣瞬變時程曲線的10%～100%的時間常數τ（τ10-100）值（F=18.61，P ＜0.001 和F=13.97，P ＜0.01）。進一步兩兩比較分析發(fā)現，在10 Hz基礎刺激下，與青年小鼠相比，老年小鼠的APD80 和CaTD50（q=5.722，P ＜0.01 和q=4.270，P ＜0.05）延長，老年小鼠與青年小鼠相比，τ10-100顯著延長（q=4.900，P ＜0.05），提示老齡可能影響胞內鈣的回收過程。而給予ISO 刺激后老年小鼠APD80（q=4.825，P ＜0.05）、CaTD50（q=6.096，P ＜0.01）、CaTD80（q=9.479，P ＜0.001）和τ10-100（q=4.324，P ＜0.05）較給藥前均縮短，但ISO刺激下的老年小鼠與ISO 刺激下的青年小鼠相比，APD80 明顯延長（q=4.140，P ＜0.05），而CaTD50、CaTD80和τ10-100差異無統(tǒng)計學意義。進一步通過電刺激誘發(fā)心律失常，發(fā)現老年小鼠在電刺激后易發(fā)心率失常，并形成典型的折返和轉子波。如圖3G、3I 和3J 所示，在小鼠心臟選取a、b、c位置，計算從a點到b點再到c點Vm傳播時間和方向。小鼠心臟Vm傳導方向由起搏點傳至遠端，即由心尖傳至心底部；而老年小鼠發(fā)生心律失常時其Vm的傳導出現旋轉、延遲、折返和異位起搏，Vm異質性增加。這可能是老年小鼠易發(fā)心律失常的原因之一。

3 討論

心血管疾病發(fā)病率和病死率都隨著年齡的增長而逐漸增加，報道顯示70 歲以上老年人比60～69 歲老年人心律失常發(fā)生率明顯增加[10]，而65～70年齡段心血管病死亡率達到最高峰[11]。高血壓、肥胖、代謝綜合癥等因素促進了中老年人心臟疾病發(fā)病率和死亡率上升[12]。隨著年齡增加，機體各項功能降低，生理儲備能力下降和機體內平衡紊亂[13]，從而降低了機體維持穩(wěn)定性的能力，并增加了對應激事件的易感性[14]。本實驗中，老年小鼠在電刺激或ISO 刺激下更易誘發(fā)心律失常，這與老齡衰弱導致的心臟功能降低，對應激刺激易感性增加有關。

心肌纖維化是導致心律失常的重要原因之一，文獻報道，隨著年齡增加，心肌纖維組織可以從6%增加到10%～35%[15]。彌漫性纖維化減慢了波的傳播，增加了折返和轉子的形成，并且能延長折返性心律失常的時間[16-17]。本研究中，老年小鼠心臟膠原沉積明顯增加，光標測顯示，誘發(fā)心律失常后出現動作電位的折返和轉子的形成，與文獻報道一致，這些結果說明心肌纖維化是老年小鼠心律失常易感性增加的機制之一。

心肌細胞收縮和電興奮性與細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的過程密切相關。觸發(fā)動作電位使細胞去極化，細胞膜上L型Ca2+通道開放，從而啟動肌漿網和蘭尼堿受體2（ryanodine2，RyR2）的Ca2+釋放。細胞內這種膜電位與Ca2+濃度周期性變化被稱為膜鐘和鈣鐘，以維持心臟正常的電活動[18]。老年心肌細胞內Ca2+平衡的打破容易引發(fā)心律失常[19]，文獻報道老年化心臟細胞中Ca2+漏出增多[20]、肌漿網Ca2+回收減慢[21]、L型Ca2+通道電流減少[22]，舒張期Ca2+火花和波動顯著增加[23]，從而增加心律失常發(fā)生率。而通過應用治療性丹特林穩(wěn)定RyR2中的域間相互作用可減少過量的肌漿網Ca2+泄漏并減弱心律失常的發(fā)生。本研究中，光標測技術可同時記錄電壓和鈣信號，可同時觀察動作電位和鈣瞬變時程變化。結果發(fā)現老年小鼠心肌細胞APD、CaTD和鈣瞬變時間常數τ10-100明顯延長，快速電刺激和ISO刺激后，老年小鼠出現明顯的電傳導折返和轉子波形成，Vm異質性增加，這可能與老年小鼠心肌細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失調，SERCA2a 功能降低[24]，Ca2+回收減慢相關，是老年小鼠心律失常易感性增加的又一機制。除此之外，衰老心臟中ATP敏感K+通道、延遲整流K+通道和其他鉀通道功能不全，也可能導致APD延長，增加心律失常易感性[25-26]。

4 結論與啟示

老年小鼠心律失常易感性增加的機制是復雜的，衰弱、心功能降低、心肌纖維化、胞內鈣穩(wěn)態(tài)失調等都是老年小鼠易發(fā)心血管疾病以及心律失常的因素。開發(fā)藥物維持心臟胞膜鐘和鈣鐘的穩(wěn)態(tài)、減少心肌纖維化，可能降低老年小鼠心臟對應激刺激產生心律失常的發(fā)生率。