王 蕾,惠向娟,支 慧,上官周平,李 瑋

(1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站,青海 西寧 810016;3. 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

我國(guó)于20世紀(jì)70年代引進(jìn)農(nóng)田地膜覆蓋技術(shù),該技術(shù)已經(jīng)普遍用于農(nóng)作物栽培,特別是在北方干旱地區(qū)獲得廣泛應(yīng)用。近年來(lái),隨著糧、棉、油料等作物產(chǎn)量的增加,農(nóng)用地膜使用量也在年年攀升。地膜覆蓋面積從1982年的7 804 hm2增加到2015年的1 834萬(wàn)hm2。預(yù)計(jì)到2024年,我國(guó)農(nóng)用地膜使用量將達(dá)到200萬(wàn) t,覆蓋土地面積將達(dá)到2 211萬(wàn) hm2[1]。研究表明我國(guó)西北地區(qū)地膜殘留量最多,尤其是在新疆、甘肅,平均地膜殘留量分別高達(dá)259.1 kg·hm-2和136.7 kg·hm-2[2]。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,新疆喀什地區(qū)農(nóng)田廢棄地膜殘留量約65.7～236.7 kg·hm-2,個(gè)別地塊的最高殘留量達(dá)519.3 kg·hm-2,是全國(guó)平均水平的3～5倍[3]。青海省地膜使用的歷史較東、中部省區(qū)要短,據(jù)青海省農(nóng)牧廳統(tǒng)計(jì),截止2018年青海省全膜雙壟技術(shù)推廣達(dá)到1.1萬(wàn) hm2,主要應(yīng)用于馬鈴薯、白菜和辣椒等作物[4-5]。不同顏色地膜覆蓋透光性不同,對(duì)土壤保溫性和保水性不同,對(duì)作物產(chǎn)量的影響也不同[6]。青海屬于高海拔地區(qū),紫外線(xiàn)強(qiáng)烈,生產(chǎn)中多使用白色透明地膜。黑色與白色透明雙色地膜覆蓋技術(shù)有維持土壤溫度、抑制膜下雜草生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)的投入生產(chǎn)和使用使土壤中地膜殘留種類(lèi)增加,更加難以回收與降解[7]。目前實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍以聚乙烯或聚氯乙烯為原料的塑料薄膜應(yīng)用更加廣泛,此類(lèi)薄膜成分為高分子化合物,分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在自然界中很難被光和熱降解;加之地膜越來(lái)越薄且容易破碎,導(dǎo)致回收工作難度大大增加。隨著地膜使用年限的延長(zhǎng),殘留在土壤中的地膜得不到及時(shí)回收,殘膜量不斷累積,造成土壤肥力下降,影響農(nóng)作物根系生長(zhǎng)發(fā)育;此外,殘膜經(jīng)過(guò)耕作、風(fēng)力、生物等作用降解形成微塑料顆粒[8-12],對(duì)農(nóng)田土壤環(huán)境造成嚴(yán)重污染,不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

近年來(lái),生物降解地膜逐漸開(kāi)始在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用推廣,這類(lèi)地膜一定程度上減輕了聚乙烯地膜對(duì)農(nóng)田的危害,但其存在成本高、降解過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn),且對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響具有不確定性[3]。目前發(fā)現(xiàn)可降解聚乙烯材料的微生物主要為細(xì)菌和真菌類(lèi),其中真菌以霉菌為主,多為曲霉屬真菌。李夏等[13]發(fā)現(xiàn)桔青霉(Penicilliumcitrinum)有降解低分子量和高分子量聚乙烯粉末的作用,能快速降解侵蝕傳統(tǒng)聚乙烯地膜和聚酯類(lèi)生物降解地膜。Khan等[14]從土壤中分離出一株土曲霉(Aspergillustubingensis),發(fā)現(xiàn)其可在聚酯類(lèi)薄膜上生長(zhǎng)并能夠降解該類(lèi)薄膜。Yoshida等[15]從暴露于PET的天然微生物群落中分離出一株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),發(fā)現(xiàn)其能降解PET材料。Das等[16]從固體土壤中分離出的2株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BSM-1和BSM-2均能在短時(shí)間內(nèi)降解線(xiàn)性低密度聚乙烯薄膜。

要解決青海省地膜殘留問(wèn)題,最重要的就是篩選分離能高效降解聚乙烯材料的菌種資源。本研究將前期篩選到的一株有降解聚乙烯材料潛力的真菌 M2進(jìn)行鑒定,通過(guò)測(cè)定地膜失重率,觀(guān)察膜片表面微觀(guān)特征、表面粗糙度、表面疏水性和表面官能團(tuán)等變化情況,分析M2對(duì)聚乙烯地膜的降解能力,以期為微生物降解聚乙烯地膜提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、儀器與試劑

供試材料:地膜樣品為分子量2 000的白色透明聚乙烯地膜、黑色聚乙烯地膜;供試菌株M2由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

供試儀器:SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋 (日本YAMATO公司),ZHPW-70恒溫培養(yǎng)搖床 (天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司),GTOP-1000D恒溫培養(yǎng)箱 (浙江托普儀器有限公司),MIRA LMS掃描電子顯微鏡(捷克TESCAN公司) ,SC7620濺射鍍膜儀 (英國(guó)Quorum公司) ,Dimension Icon原子力顯微鏡 (德國(guó)Bruker公司),Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀 (美國(guó)Thermo Scientific公司),JY-82水接觸角儀(承德鼎盛試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)設(shè)備有限公司)。

基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(g·L-1)[17]:硫酸銨0.4 g,硝酸銨1.2 g,磷酸二氫鉀0.5 g,磷酸氫二鉀1.5 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鈉0.5 g,酵母提取物0.05 g,調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。改良馬丁培養(yǎng)基 (g·L-1):酵母浸出粉2.0 g,葡萄糖20.0 g,蛋白胨5.0 g,磷酸氫二鉀1.0 g,硫酸鎂0.5 g,調(diào)節(jié)pH為6.4～6.6。以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌30 min。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 降解菌株鑒定 形態(tài)鑒定:將目的菌株M2接種在改良馬丁固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3～5 d,觀(guān)察菌株的形態(tài)特征并拍照,在載玻片上滴1滴無(wú)菌水,挑取生長(zhǎng)期為5 d的目的菌株部分菌絲均勻涂抹于無(wú)菌水滴中,光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌株的菌體形態(tài)、菌絲以及菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。分子鑒定:選擇Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司),以目的菌株M2的基因組DNA作為模板,選擇真菌鑒定引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增[18]。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 4 min;94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳?；厥占兓笥缮虾Ｉど锕就瓿蓽y(cè)序,獲取序列后,登錄NCBI網(wǎng)站選擇Blast窗口,輸入獲得的基因序列進(jìn)行同源性序列比對(duì),用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 供試樣品處理 將白色透明地膜與黑色地膜裁剪為5 cm×5 cm大小膜片,依次在滅菌的3% KCl 溶液、75 %酒精中振蕩浸泡30 min和15 min,期間用無(wú)菌水沖洗3次,最后置于超凈臺(tái)中用紫外燈照射1 h,自然風(fēng)干后備用[13]。

無(wú)菌條件下,將培養(yǎng)好的M2菌株接種到含250 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中,置于搖床里振蕩(150 r·min-1,30℃)培養(yǎng)5 d,設(shè)2個(gè)不接菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照,相同條件下培養(yǎng),5 d后在無(wú)菌條件下將白色透明地膜與黑色地膜分別接入含M2菌株的處理組培養(yǎng)基以及不接菌的對(duì)照組培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 d和60 d后分別取樣檢測(cè)菌株降解效果。

1.2.3 地膜失重率測(cè)定 為監(jiān)測(cè)降解過(guò)程中地膜的重量變化,分別在培養(yǎng)10、30、50、60 d取樣測(cè)定地膜的失重率,試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),以不接菌為對(duì)照。取出培養(yǎng)基中的地膜用去離子水反復(fù)淋洗,洗凈地膜表面附著的微生物膜,將洗凈的地膜在40℃的烘箱中干燥過(guò)夜,冷卻至室溫后稱(chēng)重。地膜失重率按照下式計(jì)算:

失重率(%)=(菌株處理前地膜質(zhì)量-菌株處理后地膜質(zhì)量)/菌株處理前地膜質(zhì)量×100%

1.2.4 地膜表面微觀(guān)特征觀(guān)察 將培養(yǎng)30、60 d的微量地膜樣品直接粘到導(dǎo)電膠上,并使用Oxford Quorum SC7620濺射鍍膜儀噴金45 s,噴金電流為10 mA;隨后使用TESCAN MIRA LMS掃描電子顯微鏡拍攝樣品表面形貌,觀(guān)察不同顏色膜片表面的微觀(guān)特征,包括是否出現(xiàn)裂紋以及孔洞等破損情況,形貌拍攝時(shí)加速電壓為3 kV,能譜mapping拍攝時(shí)加速電壓為15 kV,探測(cè)器為SE2二次電子探測(cè)器,放大倍數(shù)為2 000倍,拍攝標(biāo)尺為5 μm,通過(guò)分析拍攝到的照片分析M2菌株對(duì)白色透明以及黑色地膜的降解效能。

1.2.5 水接觸角測(cè)定 將培養(yǎng)30、60 d的地膜樣品置于JY-82接觸角測(cè)試平臺(tái),利用設(shè)備自動(dòng)滴定系統(tǒng)滴上水滴,配備光源為可調(diào)背光平面平行光源,放大方式為可連續(xù)變焦,拍攝測(cè)試照片,用量角法測(cè)定靜水接觸角角度,進(jìn)而分析M2降解下兩種膜片表面疏水性的變化[13]。

1.2.6 地膜表面化學(xué)官能團(tuán)結(jié)構(gòu)測(cè)定 將培養(yǎng)30、60 d的地膜樣品置于金剛石ATR模塊中,波數(shù)范圍600～4 000 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1,傅里葉紅外光譜儀測(cè)定膜片表面的官能團(tuán),用Origin分析紅外色譜圖,分析降解后膜片表面是否引入新的極性官能團(tuán)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株M2的鑒定

形態(tài)鑒定:經(jīng)過(guò)5 d的培養(yǎng),菌株M2在改良馬丁培養(yǎng)基上菌落近圓形,呈絨毛狀,生長(zhǎng)初期為白色(圖1A,見(jiàn)222頁(yè)),生長(zhǎng)后期為淡紫色(圖1B,見(jiàn)222頁(yè));光學(xué)顯微鏡下分生孢子梗呈樹(shù)狀,各分支頂端含小梗(圖1C,見(jiàn)222頁(yè))。

注:A: M2生長(zhǎng)前期菌落形態(tài);B: M2生長(zhǎng)后期菌落形態(tài);C: M2顯微形態(tài)。

通過(guò)PCR擴(kuò)增,從菌株M2獲得1 294 bp基因片段;經(jīng)過(guò)裁剪后,利用MEGA 7.0的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),菌株M2(登錄號(hào):MW686879.1)與淡紫紫孢菌(GU980027.1)聚為同一分支(圖2)。因此,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果,M2鑒定為淡紫紫孢菌Purpureocilliumlilacinum(異名:淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus)。

2.2 不同顏色地膜失重率分析

聚乙烯地膜的表觀(guān)降解速率可通過(guò)比較地膜的干質(zhì)量損失來(lái)評(píng)估。由圖3可知,黑色地膜的失重率高于白色透明地膜,經(jīng)過(guò)60 d的M2降解,白色透明地膜失重率為7.27%,而黑色膜片的失重率可達(dá)8.45%。對(duì)照組地膜的少量質(zhì)量損失可能為其清洗轉(zhuǎn)移時(shí)的損失。由此可初步推測(cè),菌株M2對(duì)聚乙烯地膜具有較好的降解作用。

圖2 菌株M2 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖

2.3 不同顏色地膜表面微觀(guān)特征分析

用掃描電子顯微鏡觀(guān)察降解30、60 d后的地膜,由圖4可見(jiàn),經(jīng)過(guò)30 d的M2降解處理,未接菌處理的白色透明地膜對(duì)照組(CK1)表面光滑平整,經(jīng)過(guò)M2降解的白色透明地膜(T1)出現(xiàn)一定程度的破損;經(jīng)過(guò)M2降解60 d后,T1表面開(kāi)始出現(xiàn)凹槽和孔洞。由圖5可見(jiàn),菌株M2降解30 d后,與未接菌處理的黑色地膜(CK2)相比,接菌處理的黑色地膜(T2)表面變得明顯粗糙,出現(xiàn)較多的微小裂紋與破損,局部高低不平;經(jīng)過(guò)60 d的降解后,T2表面出現(xiàn)的褶皺和孔洞更加明顯。結(jié)果說(shuō)明菌株M2對(duì)黑色地膜的降解效果更好。

注:CK1:未接菌的白色透明地膜;T1:經(jīng)過(guò)M2降解的白色透明地膜;CK2:未接菌的黑色地膜;T2:經(jīng)過(guò)M2降解的黑色地膜。下同。

圖4 降解前后白色透明地膜表面的掃描電鏡觀(guān)察結(jié)果

圖5 降解前后黑色地膜表面的掃描電鏡觀(guān)察結(jié)果

2.4 不同顏色地膜降解前后疏水性分析

地膜的主要成分是聚乙烯,聚乙烯是一種非極性疏水材料,測(cè)定膜片表面的水接觸角能了解膜片表面疏水性的變化,而疏水性降低是地膜被降解的重要特征[20]。如表1所示,經(jīng)過(guò)30 d的搖床培養(yǎng),未接菌的白色透明地膜平均水接觸角為85.70°,經(jīng)M2降解后白色透明地膜T1的平均水接觸角降至83.60°;搖床培養(yǎng)60 d后,白色透明地膜的平均水接觸角由85.66°降至81.24°。經(jīng)過(guò)30 d的降解處理,黑色地膜的平均水接觸角由91.66°降至84.36°;經(jīng)過(guò)60 d的降解處理,黑色地膜的平均水接觸角由94.13°降至69.18°。由兩種膜片表面水接觸角的變化可以發(fā)現(xiàn),黑色地膜經(jīng)過(guò)M2降解后水接觸角顯著降低,說(shuō)明其表面疏水性顯著降低,親水性提高,且隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng),水接觸角降低幅度逐漸增大;而白色透明地膜疏水性降低幅度小于黑色地膜,說(shuō)明菌株M2對(duì)黑色地膜的降解效果更好,與掃描電鏡結(jié)果一致。

2.5 不同顏色地膜紅外光譜圖分析

化合物的紅外光譜圖可以反映物質(zhì)所含的官能團(tuán)種類(lèi)。將地膜洗凈后使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行化學(xué)官能團(tuán)結(jié)構(gòu)分析,可以推斷化合物的結(jié)構(gòu)。聚乙烯是由乙烯和少量α-烯烴共聚而成,化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因而其難以降解,聚乙烯塑料地膜初步發(fā)生降解時(shí),會(huì)在外來(lái)微生物的作用下引入極性官能團(tuán),從而增加其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,以便后續(xù)的降解發(fā)生[13]。圖6是未經(jīng)M2降解處理以及M2降解處理30、60 d后白色透明地膜的紅外圖譜。3 200～3 400 cm-1區(qū)域?qū)儆诹u基C-OH的伸縮振動(dòng),1 000～1 100 cm-1區(qū)域?qū)儆诿焰IC—O—C的伸縮振動(dòng),經(jīng)過(guò)30 d的M2降解,T1在3 200～3 400 cm-1和1 000～1 100 cm-1處吸收峰增強(qiáng)幅度均較小;經(jīng)過(guò)60 d的降解,T1在3 200～3 400 cm-1區(qū)域吸收峰無(wú)明顯變化,而在1 000～1 100 cm-1區(qū)域吸收峰顯著增強(qiáng),說(shuō)明白色透明地膜中在降解過(guò)程中引入的官能團(tuán)以醚鍵C—O—C為主。

圖7為未經(jīng)M2降解處理以及M2降解處理30、60 d后黑色地膜的紅外圖譜。經(jīng)過(guò)30 d的降解,T2在3 200～3 400 cm-1的區(qū)域吸收峰無(wú)明顯變化,而在1 000～1 100 cm-1附近吸收峰出現(xiàn)一定程度的增強(qiáng),說(shuō)明M2在降解黑色地膜過(guò)程中引入了新的極性官能團(tuán)醚鍵 C—O—C;經(jīng)過(guò)60 d的降解,T2在3 200～3 400 cm-1和1 000～1 100 cm-1附近吸收峰均明顯增強(qiáng),說(shuō)明M2在降解黑色地膜過(guò)程中引入了羥基C—OH和醚鍵C—O—C。兩種地膜的處理組與對(duì)照組紅外圖譜的差異表明M2對(duì)這兩種顏色的聚乙烯地膜都有降解侵蝕能力,而經(jīng)M2降解的黑色地膜特征峰強(qiáng)度顯著高于白色透明地膜,表明M2對(duì)黑色地膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響更大,更易降解黑色地膜。

表1 降解前后白色透明地膜與黑色地膜水接觸角的變化/(°)

圖6 白色透明地膜傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

圖7 黑色地膜傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

3 討 論

聚乙烯地膜是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用的物質(zhì)資料之一,其帶來(lái)巨大收益的同時(shí)也對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。青海地區(qū)海拔高,氣候冷涼,降水較少,土壤肥力處于中等偏下水平,保水保肥能力較差,耕層淺而貧瘠,在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常應(yīng)用雙色聚乙烯地膜增溫保墑[7,21-24],由于聚乙烯難以自然降解且不易回收,極易造成“白色污染”。為緩解該地區(qū)農(nóng)田“白色污染”問(wèn)題,本試驗(yàn)以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用的白色透明、黑色聚乙烯地膜為研究對(duì)象,探究降解菌株M2對(duì)這兩種顏色地膜的降解能力。

經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子鑒定,M2是一株淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)。淡紫紫孢菌是一種食線(xiàn)蟲(chóng)真菌,多用于防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng),淡紫紫孢菌制劑已被廣泛用于防控線(xiàn)蟲(chóng)病害[25-29]。目前聚乙烯降解菌株主要為曲霉屬真菌[30],關(guān)于淡紫紫孢菌降解聚乙烯方面的研究尚不多見(jiàn)。本研究通過(guò)掃描電鏡、水接觸儀和傅里葉紅外光譜儀測(cè)定兩種顏色聚乙烯膜片被M2降解后的表面微觀(guān)特征、表面粗糙度、表面疏水性和表面官能團(tuán)變化,探究了淡紫紫孢菌M2對(duì)聚乙烯的降解能力。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定地膜的干質(zhì)量損失發(fā)現(xiàn)M2降解后,白色透明地膜失重率為7.27%,黑色膜片的失重率可達(dá)8.45%,直觀(guān)地體現(xiàn)了M2對(duì)地膜的降解能力。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)30、60 d的降解,兩種地膜處理組膜片均出現(xiàn)不同程度的裂紋與孔洞,且隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng),膜片表面孔洞與溝壑更明顯。白色透明地膜經(jīng)過(guò)菌株M2的降解,平均水接觸角有一定程度的降低但降幅較小;而黑色地膜的平均水接觸角在降解后顯著降低,即疏水性顯著降低,說(shuō)明黑色地膜表面在菌株M2的作用下可能被氧化產(chǎn)生了親水基團(tuán),有利于菌株大量附著,為其進(jìn)一步降解地膜提供了條件[29]。通過(guò)傅里葉紅外光譜分析,黑色地膜在降解過(guò)程中被引入了新的極性官能團(tuán)羥基C—OH和醚鍵C—O—C,而白色透明地膜僅被引入了醚鍵C—O—C,說(shuō)明菌株M2更容易影響黑色地膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究證實(shí)了淡紫紫孢菌M2對(duì)聚乙烯地膜的降解能力,豐富了聚乙烯降解微生物的菌種資源,為進(jìn)一步開(kāi)展聚乙烯地膜微生物降解機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

將青海大學(xué)農(nóng)科院植保所提供的一株有降解聚乙烯潛力的菌株M2作為研究對(duì)象,通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法鑒定其為淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)。經(jīng)過(guò)M2降解后的白色透明地膜和黑色地膜,其表面水接觸角變小,親水性增加;表面微觀(guān)形貌發(fā)生了變化,產(chǎn)生了孔洞、裂痕和凹坑;M2在降解過(guò)程中引入了新的官能團(tuán)羥基和醚鍵;通過(guò)測(cè)定地膜質(zhì)量損失發(fā)現(xiàn)M2對(duì)白色透明地膜的降解率為7.27%,對(duì)黑色膜片的降解率可達(dá)8.45%。以上結(jié)果均表明M2可以降解白色透明和黑色聚乙烯地膜,且其對(duì)黑色地膜的降解能力更強(qiáng)。