郝 晶,姚立蓉,汪軍成,司二靜,楊 軻,喬 巖,孟亞雄,馬小樂,李葆春1,,尚勛武,王化俊

(1.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學農學院,甘肅 蘭州 730070;3.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院,甘肅 蘭州 730070)

干旱是長期存在的世界性難題,其導致的作物減產超過了其他因素所造成減產的總和[1]。甘肅省是我國優(yōu)質啤酒大麥的生產基地及啤酒花第二大產區(qū),啤酒大麥是甘肅最具特色的優(yōu)勢釀造作物,主要分布于隴東至河西西部的廣闊地帶,尤其是河西走廊地區(qū),種植面積約占我國啤酒大麥種植面積的30%[2],該地區(qū)屬于典型的干旱、半干旱地區(qū),水資源缺乏是制約大麥產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素[3]。因此,通過解析大麥的抗旱生理機制,為篩選和選育適應當?shù)厣a條件的抗旱大麥品種奠定基礎迫在眉睫。

干旱脅迫對植物的影響是一個復雜的生理生化過程,植株生長情況和生理狀態(tài)的變化可直接或間接反映其抗旱能力的強弱。光合能力影響作物產量和品質的提高,不同水分條件下,植株光合特性表現(xiàn)有所不同,而葉片葉綠素含量是直接反映植株光合能力的重要指標[4-6]。根系是影響作物產量的重要器官[7],是連接地上部與土壤水分、養(yǎng)分的橋梁,發(fā)揮著固持地上組織和汲取地下水分、養(yǎng)分的雙重作用[8]。通過觀察植物根部形態(tài),可以了解根系發(fā)育狀況,尤其是幼苗階段根系的形態(tài)特征可以更直觀地反映植株的抗旱能力。國內外學者通過抗旱系數(shù)、抗旱指數(shù)等直接評價方法,分析了不同作物在苗期對干旱脅迫的響應指標,大致可以歸納為兩類:一是根長、葉長、根冠比等形態(tài)指標,二是根系活力、葉片相對含水量、葉綠素含量等生理生化性狀[9-10]。近年來,不少學者對大麥的抗旱生理開展了大量研究。汪軍成等[11]、杜歡等[12]的研究表明,干旱脅迫會導致大麥幼苗生長受阻、植株矮小。徐銀萍等[13]發(fā)現(xiàn),干旱脅迫后大麥葉片葉綠素含量呈明顯下降趨勢,在復水后存在顯著的補償效應。聶石輝[14]的研究表明,干旱脅迫條件下大麥葉綠素a與葉綠素b的比值總體呈下降趨勢,并且干旱敏感型品種下降速度高于抗旱型品種。

植物水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)又稱為水孔蛋白,是位于質膜和液泡膜上運輸水分及一些小分子物質的主要內在蛋白,運輸?shù)孜?、表達模式、修飾水平的差異以及其他基因調節(jié)的原因,使不同水通道蛋白之間產生了差異,其具有豐富性和多樣性[15-16]。目前,水通道蛋白已經在擬南芥[17]、水稻[18]等多種植物中被克隆鑒定。PIPs(Plasma membrane intrinsic proteins)是AQP的一類亞家族,它在植物水分調節(jié)方面起著很大作用[19],主要分為PIP1和PIP2兩個亞類,植物通過控制AQPs的活性來抵御各種逆境脅迫,已報道的逆境脅迫因子包括干旱、冷害、高鹽和淹水缺氧等非生物因子[15]。大麥水通道蛋白PIPs研究最初發(fā)現(xiàn)的10個大麥PIP基因中,PIP1和PIP2亞族各有5個基因,冷脅迫下PIPs基因的響應已有報道[20],但是關于HvPIPs對干旱脅迫響應的研究還較少。

本試驗通過研究4份不同基因型啤酒大麥在PEG-6000模擬干旱脅迫下形態(tài)特征和光合特性的變化,分析抗旱型材料與干旱敏感型材料對干旱脅迫響應的差異;并通過對不同抗性的大麥品種進行PIPs的實時定量分析,研究水通道蛋白AQPs基因與干旱脅迫之間的應答關系,以期為大麥苗期的抗旱育種提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試種質材料為對63份不同基因型啤酒大麥進行連續(xù)3年抗旱性篩選后得到的4個優(yōu)質高產品種,由甘肅農業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室提供。供試的63份大麥品種種植在甘肅省敦煌試驗站,設干旱脅迫(土壤相對含水量為田間持水量的30%～40%)和正常灌水(土壤相對含水量為田間持水量的70%～80%) 2個處理,重復3次。試驗材料采用點播,行長1 m,每行30粒,每個品種3行,行距0.2 m,走道寬0.3 m,保護行寬1 m。每個小區(qū)土壤肥力中等均勻,地勢平坦,灌溉方便。灌溉方式為漫灌,正常灌水試驗田與干旱脅迫試驗田除灌溉外其他管理措施保持一致。收獲后通過對各品種大麥形態(tài)指標及籽粒品質性狀進行綜合分析,篩選出2個高抗品種(ZDM5430和ZDM5458)及2個干旱敏感型品種(7DCADA和IL-12)作為參試品種。

1.2 試驗設計

每個品種選取飽滿、大小均勻一致的種子150粒,清洗干凈置于紙床發(fā)芽盒,于25℃、14 h光照/10 h黑暗氣候室中培養(yǎng)。7 d后,將幼苗轉移至白色水培箱中進行水培,水培選用霍格蘭德營養(yǎng)液[21],并使用氧氣泵,置于25℃、14 h光照/10 h黑暗的人工氣候室發(fā)育。7 d后對水培幼苗進行不同處理,干旱脅迫用PEG-6000濃度為15%的霍格蘭德營養(yǎng)液培養(yǎng),4個品種(ZDM5430、7DCADA、ZDM5458、IL-12)分別表示為T1、T2、T3、T4;對照僅用霍格蘭德營養(yǎng)液培養(yǎng),4個品種分別表示為CK1、CK2、CK3、CK4,共8個處理,各設3個重復。在水培箱中培養(yǎng)21 d,并分別于干旱脅迫7、14 d和21 d后取樣測定各項指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 苗長測定 各處理選取5株長勢均勻一致的大麥植株,用鋼卷尺測量(精度0.1 cm)植株地上部分高度,即為苗長。

1.3.2 葉綠素含量測定 分別于干旱處理后7、14、21 d采樣,參照丁富功等[22]方法各處理稱取新鮮收集的小麥旗葉1.0 g,研磨成勻漿狀后浸提、過濾、定容至25 mL,采用紫外光分光光度計測定其在645 nm和663 nm波長下吸光值。試驗設3個重復,每個重復測定3次,使用Amon法公式計算葉綠素含量:

葉綠素a含量(mg·g-1)=(12.71×A663-2.59×A645)×V/W

葉綠素b含量(mg·g-1)=(22.88×A645-4.67×A663)×V/W

可見，在醫(yī)學教學過程中單純采用PBL一種教學方法，固然提高了學生的獨立學習和解決問題能力，但又隨之而帶來了新的問題，不利于醫(yī)學生的全面可持續(xù)發(fā)展；為了解決這一問題，我們將導師責任制結合PBL教學模式引入本科生臨床醫(yī)學教育，以彌補培訓中單獨使用PBL 教學模式的不足。

葉綠素總含量(mg·g-1)=(8.04×A663+20.29×A645)×V/W

式中,A663和A645分別表示樣品在645 nm和663 nm波長下吸光值,V為提取液體積(ml),W為葉片鮮質量(g)。

1.3.3 根系形態(tài)測定 干旱處理后7、14、21 d,各處理分別選取長勢一致的3株幼苗,利用EPSON掃描儀掃描樣品根系,而后用WinRHIZO Program根系分析系統(tǒng)進行總根長、根表面積、根體積指標的測定。

1.3.4 根系活力測定 參照朱秀云等[23]的方法,稱取根系樣品0.500 g,采用氯化三苯基四氮唑法獲得提取液,用分光光度計比色測定485 nm波長下光密度值,計算根系活力,公式如下:

C=9.0427OD-0.033

ACT= (C×m)/(W×h)

式中,C為四氮唑還原量(μg),OD為光密度值;ACT為根系活力(μg·g-1·h-1),W為根鮮質量(g),h為反應時間(h),m為提取液稀釋倍數(shù)。

1.3.5 相對含水量、干物質積累量和根冠比測定 各處理取3株幼苗,參照馮舉伶等[24]、馬富舉等[25]的方法,用分析天平稱量植株地上部鮮質量、葉鮮質量和根鮮質量后,放入烘箱中105℃殺青30 min,80℃烘干至恒重,稱量其地上部干質量、葉干質量和根干質量,并計算幼苗的各器官(根、葉)相對含水量、干物質積累量和根冠比。

相對含水量=(鮮質量-干質量)/(飽和鮮質量-干質量)×100%

干物質積累量=地上部干質量+根干質量

1.4 qRT-PCR

參照周練等[20]的方法,分別收集不同處理大麥根系并立即在液氮中冷凍,采用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)的操作說明提取大麥根總RNA并逆轉錄得到cDNA。設計定量引物時,參考段瑞君等[26]的HvPIPs實時定量分析所使用的基因特異性引物(表1)。qRT-PCR中利用大麥Actin基因在各個cDNA樣品中的表達量作為內參,樣品間同一基因的相對表達量通過以下公式計算:F=2-ΔΔCt,式中,F為基因的相對表達量;ΔCt為目的基因與內參基因達到設定閾值循環(huán)數(shù)的差值;ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理和作圖,采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下不同品種大麥幼苗生長指標的差異

圖1及表2為各處理大麥苗期植株形態(tài)變化及苗長、葉鮮質量、根鮮質量、根含水量、葉含水量、干物質積累量和根冠比的統(tǒng)計分析。如圖1A所示,干旱脅迫7 d時,與對照相比,4個品種的大麥生長均受到抑制,對照組與處理組之間地上部的差異比較明顯,根系差異較小。由表2可知,干旱脅迫7 d時,處理組的苗長、葉鮮質量和葉含水量較對照組均有所下降,其中,T4下降最明顯,其苗長與CK4相比降低了25.58%,葉鮮質量和葉含水量分別為0.46 g和0.37 g,均低于其他處理;與對照組相比,處理組的根鮮質量和根含水量也呈下降趨勢,且T1和T3的下降幅度明顯小于T2和T4;各品種脅迫處理與相應對照之間干物質積累量差異不大,僅T2較對照顯著下降83.3%;各品種間以及對照組與處理組之間的根冠比差異均不明顯。

注:圖A為干旱脅迫7 d的大麥形態(tài),圖B為干旱脅迫14 d的大麥形態(tài),圖C為干旱脅迫21 d的大麥形態(tài)。

如圖1B所示,干旱脅迫14 d時,處理與對照組之間植株形態(tài)差異明顯,其中,IL-12受干旱脅迫的影響最顯著,其根長、苗長均有明顯下降,其他3個品種的生長也受到不同程度的抑制。結合表2可知,干旱脅迫14 d時,與對照組相比,各處理的苗長均降低,T1下降幅度最大;葉鮮質量和根鮮質量也呈下降趨勢,其中T4分別為0.47 g和0.45 g,低于其他處理;葉含水量和根含水量都顯著降低,且品種間差異較大,其中,T3葉含水量最大,較對照降幅最小,為23.46%,其次為T1,降幅為30.80%;不同品種間干物質積累量的差異比干旱脅迫7 d時更為明顯,其中,T2的干物質積累量最少。隨著干旱脅迫時間的延長,各品種的根冠比較本時期的對照組均呈上升趨勢,且T2和T4的增幅大于T1和T3,T4的根冠比最高,為0.96。

如圖1C所示,干旱脅迫21 d時,對照與處理組之間植株形態(tài)的差異更加顯著,隨著干旱脅迫時間延長,地上部葉片開始發(fā)黃,根系生長受到抑制,根系形態(tài)也發(fā)生明顯變化,其中ZDM5430品種處理和對照的差異最小。由表7可知,干旱脅迫21 d時,除苗長和根冠比外,T1和T3其余性狀的表現(xiàn)均優(yōu)于T2和T4,說明干旱脅迫對大麥苗期的生長總體表現(xiàn)為抑制作用。

2.2 干旱脅迫下不同品種大麥幼苗根系形態(tài)的差異

由表3可知,干旱脅迫下不同品種的大麥幼苗根系形態(tài)指標之間均有差異,隨著干旱脅迫時間的延長,ZDM5430、7DCADA和IL-12的總根長基本呈下降趨勢,ZDM5458的總根長則有所增加,其脅迫7、14、21 d的總根長分別為0.68、0.77和0.76。各大麥品種根表面積總體隨著干旱脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢,ZDM5458根表面積增加和下降的幅度均較大,脅迫14 d和7 d之間、14 d和21 d之間差值分別為0.22和0.16。隨干旱脅迫時間延長,不同品種根體積變化趨勢存在差異,ZDM5430和IL-12的根體積均呈逐漸上升趨勢,其中,ZDM5430上升幅度最大,脅迫21 d較脅迫7 d上升0.26;7DCADA和ZDM5458的根體積則表現(xiàn)為先增加后下降。由此可見,隨著干旱脅迫時間的延長,各品種的總根長、根表面積和根體積都發(fā)生了變化,4個品種變化情況有所不同,除總根長部分時期略小于ZDM5458外,ZDM5430的各指標值始終最高,說明干旱脅迫對該品種根系形態(tài)的影響較小。

2.3 干旱脅迫下不同品種大麥幼苗葉綠素含量的差異

植物葉片葉綠素含量對光合作用有重要影響。如圖2A所示,ZDM5458和ZDM5430脅迫處理的葉片葉綠素a含量均隨干旱脅迫時間的延長而增加,與對照組的差異也較小,7DCADA和IL-12處理的葉綠素a含量則隨干旱脅迫時間的延長呈先升高后下降的趨勢,在干旱脅迫14 d時含量達到最大值,與對照組趨勢相同,但含量低于對照組。

由圖2B可知,干旱脅迫處理下不同大麥品種葉片葉綠素b含量變化存在顯著差異,ZDM5430、7DCADA和ZDM5458葉綠素b含量均隨著干旱脅迫時間的增加呈現(xiàn)升高趨勢,品種IL-12則呈逐漸下降趨勢。其中,ZDM5430和ZDM5458處理組和對照組之間的葉綠素b含量差異較小,而7DCADA和IL-12在干旱脅迫21 d時葉綠素b含量分別為24 mg·g-1和15 mg·g-1,均顯著低于對照組。

表2 干旱脅迫下不同品種大麥幼苗形態(tài)指標的變化

表3 干旱脅迫下不同大麥品種根系形態(tài)的變化

如圖2C所示,干旱脅迫處理下不同大麥品種葉片總葉綠素含量變化情況有所不同,ZDM5430和ZDM5458隨脅迫時間增加而升高,7DCADA和IL-12則表現(xiàn)為先升高后降低;干旱脅迫處理7 d時,抗旱品種對照組與處理組間葉片總葉綠素含量差異顯著,干旱敏感型品種處理間差異不顯著;處理14 d和21 d時,除7DCADA外,其余品種處理和對照間差異均達顯著水平。與對照組相比,各品種處理總葉綠素含量下降幅度表現(xiàn)為:7DCADA>IL-12>ZDM5430>ZDM5458,說明隨著干旱脅迫程度的加劇,葉綠素合成受阻,分解速率增大,導致葉片葉綠素含量下降,但大麥品種ZDM5430和ZDM5458的葉綠素含量受干旱脅迫的影響較小,有較強的的抗逆能力。

注:不同小寫字母表示相同脅迫天數(shù)下處理間差異達顯著水平(P<0.05)。

2.4 干旱脅迫下不同品種大麥幼苗根系活力的差異

由圖3可知,4個不同基因型的大麥在干旱處理后,根系活力均低于相應對照,說明大麥苗期根系對水分較為敏感,干旱脅迫會降低其活力。不同處理時間下,各品種干旱脅迫初期根系活力受到的影響較小,處理14 d仍高于處理7 d的根系活力,處理21 d時各品種的根系活力均有下降趨勢,其中ZDM5430的下降幅度最小;隨著干旱脅迫時間的增加,處理組與對照組之間根系活力的差異也越來越大,差異最顯著的是IL-12和7DCADA。對于不同大麥品種,干旱脅迫7 d時,7DCADA的根系活力明顯高于其他品種;干旱脅迫處理14 d時,根系活力的大小為:ZDM5458>ZDM5430>IL-12>7DCADA,7DCADA根系受到干旱脅迫的抑制最為明顯;處理21 d時,4個品種根系活力均有所下降,但ZDM5430和ZDM5458的根系活力明顯更具優(yōu)勢。

2.5 干旱脅迫下大麥根系水通道蛋白PIPs基因的變化

如圖4所示,各大麥品種在持續(xù)干旱脅迫21 d后,根中相對表達量最高的水通道蛋白是HvPIP1;4和HvPIP1;5,最低的是HvPIP2;4。隨干旱脅迫時間的延長,各品種根系中HvPIP1;1、HvPIP1;2、HvPIP2;1和HvPIP2;5的相對表達量呈逐漸下降趨勢,干旱21 d時,7DCADA和IL-12這2個品種的HvPIP2;1相對表達量顯著小于其他2個品種;HvPIP1;4、HvPIP1;5和HvPIP2;2在干旱脅迫后相對表達量呈上升趨勢,其中,ZDM5430在各階段HvPIP1;4和HvPIP1;5的相對表達量均顯著高于其他3個品種;對于HvPIP1;3和HvPIP2;4,其相對表達量隨干旱脅迫時間增加呈先增加后降低的趨勢。綜上可知,ZDM5430和ZDM5458這2個品種在相同處理條件下的HvPIPs表達量均明顯高于7DCADA和IL-12。

3 討 論

3.1 干旱脅迫對不同大麥品種幼苗生長特性的影響

作物的生長發(fā)育既受遺傳因素的影響,又受外界環(huán)境的影響。當生存條件發(fā)生顯著變化時,大麥會通過調節(jié)相應的功能和結構做出響應,因此其幼苗的生長動態(tài)可視為經過體內許多變化及自適應后最終表現(xiàn)出的綜合效應。本研究中,干旱脅迫對大麥苗期的農藝性狀各指標總體上表現(xiàn)出抑制作用,其中變化最為顯著的是苗長和根冠比;隨著干旱脅迫時間的延長,大麥幼苗生長受到的影響越來越明顯。這與陳雪[27]、徐銀萍等[28]的研究結果一致。干旱脅迫后,所有參試品種的葉片含水量都呈下降趨勢,其中抗旱品種ZDM5430和ZDM5458降低幅度較小,干旱脅迫后葉片仍能保持較高含水量。冉生斌等[29]通過研究干旱對不同基因型啤酒大麥生長發(fā)育的影響,也得出了相關的結論;說明大麥的抗旱能力越強,在逆境下越能保持較好的生長狀態(tài),可有效抵御干旱脅迫對其產生的影響。根系是植物直接吸收和利用土壤中水分與養(yǎng)分的器官,地下根系的生長狀況很大程度上決定了地上部植株的生長。根系發(fā)達的植株能更好地吸收環(huán)境中的水分和養(yǎng)分[30]。本研究中,干旱脅迫處理后,抗旱型品種(ZDM5430和ZDM5458)的根長均較相應對照有所增加,干旱敏感型品種(7DCADA和IL-12)根長則較相應對照顯著降低,說明根系生長情況可以表征植株的抗旱能力。根冠比為作物的抗旱性指標之一,本研究中隨著干旱脅迫時間的延長,各參試品種的根冠比都出現(xiàn)較為顯著的變化,抗旱能力強的品種在受到水分脅迫時能保持較大的根冠比,這與代小冬[31]的研究結果一致。

注:不同小寫字母表示不同脅迫時間差異達顯著水平(P<0.05)。

注:不同小寫字母表示品種間差異達顯著水平(P<0.05)。

葉片是植物進行光合作用的主要器官,葉綠素是光合作用的主要色素,葉綠素含量一定程度上可以衡量植物抗逆性強弱。有研究表明,干旱脅迫會使葉綠素分解,導致葉綠素含量降低[20]。本試驗參試的4個大麥品種在干旱脅迫后總葉綠素含量較對照組均呈下降趨勢,這與劉義國等[6]、汪軍成等[11]在大麥上的研究結果一致。植物葉片中葉綠素a含量較高,有利于植株在脅迫下保持較高的光合強度;葉綠素b含量較高,表明其在脅迫下降解速度緩慢[32-33]。本研究中,在干旱脅迫下,ZDM5430和ZDM5458葉綠素a含量和葉綠素b含量與對照組差異較小,而7DCADA和IL-12則顯著低于相應對照。降幅不同反映了品種抗旱性的差異,抗旱性強的品種可在干旱脅迫條件下保持較高的功能葉葉綠素含量。

3.2 干旱脅迫下不同大麥品種苗期根系水通道蛋白PIPs基因的變化

根系是植物的主要水通道,缺水條件下水通道蛋白的功能和調控研究一直備受關注。長期接觸缺水土壤的植株根系中水通道蛋白的活性會受到抑制,以阻止水分從根細胞向干燥土壤反向運輸[34]。相反,早期干旱條件可誘導水通道蛋白的表達和活性的提升,促進植物吸收土壤中的水分[35]。對擬南芥中35個水通道蛋白基因表達的分析表明,干旱條件下大多數(shù)PIPs和TIPs(Tonoplast intrinsic proteins)基因表達水平較高,而NIP(Nodulin 26-like intrinsic proteins)表達水平較低[18]。另外,一些水通道蛋白基因(AtPIP2;6、AtSIP1;1等)在缺水條件下表現(xiàn)為組成型表達或不敏感。不同植物的比較轉錄組研究表明,干旱處理主要誘導水通道蛋白PIPs和TIPs亞類上調表達[36]。以上結果與本研究結果相似。干旱脅迫下大麥水通道蛋白PIPs基因受到的影響較為明顯,2個亞家族的基因大多上調,只有HvPIP1;1、HvPIP1;2、HvPIP2;1和HvPIP2;5有下降趨勢。部分基因在干旱脅迫初期出現(xiàn)上調,但是脅迫時間延長至21 d時出現(xiàn)下降趨勢,可能是干旱脅迫時間過長影響了大麥根系的活力。在相同處理條件下,4個不同品種的大麥HvPIPs的變化趨勢基本相似,但是ZDM5430和ZDM5458的轉錄表達量明顯高于其他2個品種,說明這2個品種的抗旱性更好。

4 結 論

1)苗期干旱對不同基因型大麥植株根鮮質量和根冠比的影響最大;葉綠素和根系活力也隨著干旱脅迫時間的延長而顯著下降?？购敌推贩N(ZDM5430和ZDM5458)在干旱脅迫下可以通過根系形態(tài)的變化,減小水分虧缺對植株產生的影響,并保持相對較高的葉綠素含量和根系活力。

2)HvPIPs基因參與了大麥抗旱的調控機制,其中,HvPIP1;3、HvPIP1;4、HvPIP1;5和HvPIP2;2、HvPIP2;3和HvPIP2;4的表達量在干旱脅迫后呈顯著上調趨勢,并且在抗旱型品種中的表達量顯著高于干旱敏感型品種(7DCADA和IL-12)。