黃秀艷,栗俊波,廖 冰,傅雪琳,何 平

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

水稻是我國主要的糧食作物,而水資源短缺是目前影響水稻生產(chǎn)的重要因素之一。干旱嚴(yán)重影響水稻植株的生長發(fā)育,導(dǎo)致其產(chǎn)量及品質(zhì)下降[1]。水稻的抗旱性是復(fù)雜的、多基因控制的數(shù)量性狀,植物通過調(diào)控自身生長發(fā)育及調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)含量來應(yīng)對干旱環(huán)境。當(dāng)受到干旱脅迫時,植物的根、葉形態(tài)發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為葉片卷曲、枯黃和生長延緩等,根系的形態(tài)建成也會受到影響,脅迫嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株死亡[2-3];此外,受到干旱脅迫時,植物體細(xì)胞會產(chǎn)生大量的O2-和H2O2,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,植物通過調(diào)節(jié)可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量等滲透物質(zhì)來抵抗干旱脅迫[4]。

聚乙二醇(PEG)作為常見的滲透調(diào)節(jié)劑,被廣泛用于篩選抗旱指標(biāo)和鑒定作物的抗旱性[5-8]。目前,采用PEG模擬干旱環(huán)境進(jìn)行作物種子抗旱性等方面的研究有較多報道。Wang等[9]利用20% PEG-6000溶液對雜草稻和栽培稻品種進(jìn)行了耐旱發(fā)芽試驗。Binodh等[10]利用不同濃度的PEG溶液對85個傳統(tǒng)水稻地方品種和15個改良品種及1個耐旱(IR 64 Drt1)與旱敏感(IR 64)材料種子萌發(fā)過程中的水分脅迫耐受力進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn),種子萌發(fā)受PEG脅迫的影響很大,在脅迫下出現(xiàn)根和芽長度顯著縮短的現(xiàn)象,PEG引起的水分脅迫降低了萌發(fā)種子的滲透勢。馮舉伶等[11]為研究春小麥的萌發(fā)期耐旱性,利用20% PEG-6000的滲透脅迫性,從119份春小麥資源中篩選出了2份耐旱性較好的材料。李靜靜等[12]為研究小麥的萌發(fā)期耐旱性,利用20% PEG-6000溶液對不同材料進(jìn)行滲透脅迫,并通過主成分分析和綜合評價值法對20份小麥進(jìn)行抗旱性綜合評價,篩選出‘晉麥47’、‘運旱618’、‘長治6406’、‘石4185’和‘旱選10號’等抗旱性較強(qiáng)的品種。

野生稻種通常能更好地適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境,并能耐受許多生物和非生物脅迫,本研究的供試材料為單片段代換系(Single chromosome segments substitution lines,SSSLs),這些SSSLs上攜帶有供體野生稻的基因片段,其中可能含有豐富的新基因。在水稻芽期利用濃度為20%的PEG-6000脅迫劑模擬干旱環(huán)境,對60份SSSLs及其受體‘華粳秈74’(‘HJX74’)萌發(fā)期抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行測定和QTL鑒定分析,以擴(kuò)充水稻耐旱種質(zhì)資源,獲得新的優(yōu)異基因,為水稻耐旱育種提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021年在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室光照培養(yǎng)箱進(jìn)行,供試材料為以‘華粳秈74’(‘HJX74’)為受體親本、分別以展穎野生稻和南方野生稻為供體親本構(gòu)建的60份單片段代換系(SSSLs),其中包括15份編號為X開頭的展穎野生稻SSSLs,45份編號為M開頭的南方野生稻SSSLs,均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院傅雪琳教授提供。

1.2 種子發(fā)芽與處理方法

發(fā)芽與處理采用培養(yǎng)皿發(fā)芽試驗法進(jìn)行。每個材料選取成熟、飽滿且均勻一致的健康種子150粒,置于45℃恒溫干燥箱烘種5 d以打破種子休眠,將種子用75%酒精浸泡30 s后,倒去酒精溶液,用蒸餾水清洗3～4遍,濾紙吸干種子表面水分,置于直徑7.5 cm的培養(yǎng)皿中,標(biāo)記材料編號。每個培養(yǎng)皿內(nèi)放置20粒種子,加入20 mL蒸餾水進(jìn)行浸種,待種子破胸露白后,將其轉(zhuǎn)移到墊有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,其中對照組每皿加10 mL蒸餾水,處理組每皿加10 mL 20% PEG-6000溶液,1個培養(yǎng)皿為1次重復(fù),每個處理設(shè)3次重復(fù)。在發(fā)芽過程中,每天更換20% PEG-6000和蒸餾水。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(28℃;12 h光照,光強(qiáng)18 000 Lux,12 h黑暗)培養(yǎng)至第8天,從每個培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑取10 粒發(fā)芽種子測量芽長、根數(shù)、胚芽鞘長、根長;將剪取的根和芽分別放置在105℃的鼓風(fēng)干燥箱中殺青1 h,80℃烘干至恒重,稱量根干質(zhì)量及芽干質(zhì)量。以各性狀的相對值(處理與對照的比值)作為評價指標(biāo),包括相對根長(Relative root length,RRL)、相對芽長(Relative shoot length,RSL)、相對根數(shù)(Relative root number,RRN)、相對胚芽鞘長(Relative coleoptile length,RCL)、相對芽干質(zhì)量(Relative shoot dry weight,RSDW)以及相對根干質(zhì)量(Relative root dry weight,RRDW)。

1.3 SSSLs耐旱性評價方法

SSSLs耐旱性綜合評價采用隸屬函數(shù)值法,參考段永紅等[13]的方法,計算公式如下:

U(Xij)=(Xij-Xijmin)/(Xijmax-Xijmin)

(1)

Xi=∑U(Xij)/n

(2)

式中,U(Xij)表示i材料j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,Xij表示i材料j指標(biāo)的測定值,Xijmin表示第j個指標(biāo)在所有供試材料中的最小測定值,Xijmax表示第j個指標(biāo)在所有供試材料中的最大值;n為測定指標(biāo)個數(shù),Xi表示i材料n個指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值(Mean membership function values,MMFV),Xi值大小與材料耐旱性呈正相關(guān)關(guān)系。

1.4 耐旱SSSLs QTL鑒定

在P<0.01水平,將供試材料的性狀指標(biāo)值進(jìn)行單因素方差分析及Duncan’s多重比較,再結(jié)合各SSSLs平均隸屬函數(shù)值大小,篩選出性狀值顯著高于‘HJX74’的SSSLs,以這些SSSLs的各項指標(biāo)進(jìn)行耐旱性QTL鑒定。對有重疊片段的SSSLs通過代換作圖的方法確定QTL所在區(qū)間。QTL的命名參考Mccouch等[14]的命名原則。參考Eshed等[15]的方法計算QTL的加性效應(yīng)及表型貢獻(xiàn)率:

加性效應(yīng)=(SSSL表型值-‘HJX74’表型值)/2

加性效應(yīng)表型貢獻(xiàn)率(%)=(加性效應(yīng)/‘HJX74’表型值)×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

需要分析的數(shù)據(jù)取各指標(biāo)的相對值,以降低試驗材料的基礎(chǔ)差異[16]。數(shù)據(jù)采用Excel 2016整理及作圖,利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和單因素方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用Duncan’s字母標(biāo)記法,QTL在染色體上的分布圖用Mapchart 2.3軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSSLs群體及受體‘HJX74’芽期耐旱指標(biāo)相對值的變化

20% PEG-6000處理條件下水稻SSSLs芽期6個耐旱指標(biāo)的相對值頻次分布顯示(圖1),干旱脅迫處理后的6個相關(guān)性狀在SSSLs之間存在遺傳差異,均呈現(xiàn)出顯著的正態(tài)分布特點,變異幅度較大,其中相對芽長的分布范圍為0.36～0.80,相對根長的分布范圍為0.20～1.15,相對胚芽鞘長的分布范圍為0.70～1.38,相對根數(shù)的分布范圍為0.35～1.15,相對根干質(zhì)量的分布范圍為0.20～0.80,相對芽干質(zhì)量的分布范圍為0.25～0.65。

2.2 耐旱指標(biāo)相對值與平均隸屬函數(shù)值相關(guān)性分析

通過對60個SSSLs及受體‘HJX74’在20% PEG-6000處理條件下的6個耐旱指標(biāo)(相對芽長、相對根長、相對胚芽鞘長、相對根數(shù)、相對根干質(zhì)量、相對芽干質(zhì)量)與平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析(表1)可知,相對芽長與相對根數(shù)、相對芽干質(zhì)量極顯著正相關(guān)(P<0.01),與相對根干質(zhì)量顯著正相關(guān)(P<0.05),表明芽長生長與根數(shù)量、地上部分和地下部分的干物質(zhì)積累有密切關(guān)系,均能作為水稻芽期耐旱性鑒定和評價指標(biāo)。相對根長與相對根數(shù)、相對根干質(zhì)量極顯著正相關(guān)(P<0.01),與相對胚芽鞘長顯著正相關(guān)(P<0.05),表明根的生長主要受根系數(shù)量和干物質(zhì)積累的影響。相對根數(shù)與相對根干質(zhì)量極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明根系數(shù)量的形成與根部干物質(zhì)積累有關(guān)。相對根干質(zhì)量與相對芽干質(zhì)量顯著正相關(guān)(P<0.05)。平均隸屬函數(shù)值與各指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,可作為水稻芽期耐旱性鑒定和評價指標(biāo)。

2.3 隸屬函數(shù)法綜合指標(biāo)分析

平均隸屬函數(shù)值能綜合反映各性狀指標(biāo)受干旱影響的程度,平均值越大表明其受干旱影響越小,說明品種的抗旱性越強(qiáng)。通過對60個SSSLs與受體‘HJX74’的平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行比較,最終確定其抗旱性的強(qiáng)弱排序。如表2所示,平均隸屬函數(shù)值大于0.60的SSSLs有8個,其耐旱能力較強(qiáng);平均隸屬函數(shù)值為0.50～0.60的SSSLs有29個,其耐旱能力中等;平均隸屬函數(shù)值小于0.50的SSSLs有24個,其耐旱能力較弱。受體‘HJX74’平均隸屬函數(shù)值為0.58,介于0.50～0.60,其耐旱脅迫能力中等;平均隸屬函數(shù)值最大的材料是X8,達(dá)0.71,說明其抗旱性較強(qiáng);平均隸屬函數(shù)值最小的材料是M113,為0.14,說明其抗旱性最弱。

2.4 耐旱性SSSLs篩選及QTL鑒定

2.4.1 耐旱性SSSLs的QTL鑒定材料篩選 以SSSLs單個性狀指標(biāo)相對值與‘HJX74’的相對值進(jìn)行單因素方差分析及多重比較,在P<0.01水平,篩選出與‘HJX74’性狀值差異顯著的SSSLs,用于QTL鑒定。若其中某個SSSL的某性狀相對值顯著大于‘HJX74’,則認(rèn)為該SSSL材料以該性狀為指標(biāo)表現(xiàn)出耐旱特性,其代換片段上攜帶相應(yīng)的耐旱性QTL。

在P<0.01水平、20% PEG-6000溶液處理條件下,以各SSSLs的6個指標(biāo)相對值進(jìn)行單因素方差分析及多重比較發(fā)現(xiàn),供試SSSLs種子發(fā)芽第8天的相對芽長、相對根數(shù)與‘HJX74’存在顯著差異,其余4個指標(biāo)的相對值分析結(jié)果無顯著差異,因此選擇相對芽長與相對根數(shù)指標(biāo)作為耐旱QTL鑒定材料的篩選指標(biāo)。以相對芽長為性狀指標(biāo)時,X24、X8材料的芽長顯著高于‘HJX74’,表明這2個材料的耐旱性較強(qiáng);以相對根數(shù)為性狀指標(biāo)時,M77、M120、M133、M142材料的總根數(shù)顯著多于‘HJX74’,表明這4個材料的耐旱性較強(qiáng)(圖2)。由表2可知,相對芽長耐旱SSSLs中,X24、X8的平均隸屬函數(shù)值分別為0.65、0.71,在總材料中分列第6和第1;相對根數(shù)耐旱SSSLs中,M77、M120、M133、M142材料的平均隸屬函數(shù)值分別為0.66、0.67、0.56和0.55,在總材料中分列第5、第4、第20和第23。所有材料的綜合排名均較靠前,說明根據(jù)各材料相對芽長與相對根數(shù)可以篩選出耐旱SSSLs。

2.4.2 相對芽長QTLs鑒定及其遺傳效應(yīng) 利用代換作圖法對含有重疊片段的不同SSSLs進(jìn)行QTL定位,SSSLs遺傳效應(yīng)方向一致,則認(rèn)為該重疊片段存在QTL,若其中一個SSSL中檢測到QTL,另一個未檢測到,則認(rèn)為置換片段的非重疊片段上存在QTL。根據(jù)SSSLs QTL鑒定原理,以相對芽長作為耐旱指標(biāo)進(jìn)行QTL鑒定,X24、X8材料的單片段在1號染色體上存在重疊片段RM490-RM572(圖3A),認(rèn)為這2份SSSLs的代換片段上攜帶有來自展穎野生稻的耐旱QTL;該區(qū)間可能存在一個共同的QTL,為qRSL1-1(圖4A);單片段材料X24、X8的QTL的加性效應(yīng)分別為0.07和0.08,表型貢獻(xiàn)率分別為11.17%和13.85%(表3)。

表1 SSSLs芽期各耐旱指標(biāo)間及其與平均隸屬函數(shù)值間的相關(guān)系數(shù)

表2 不同SSSLs在PEG脅迫下耐旱指標(biāo)的隸屬函數(shù)值與平均隸屬函數(shù)值綜合結(jié)果

2.4.3 相對根數(shù)QTLs鑒定及其遺傳效應(yīng) 以相對根數(shù)作為耐旱指標(biāo)進(jìn)行QTL鑒定,M77、M120材料的單片段在10號染色體上存在重疊片段PSM406-PSM164(圖3B),認(rèn)為這2份SSSLs的代換片段上攜帶有來自南方野生稻的耐旱QTL,該區(qū)間可能存在一個共同的QTL,為qRRN10-1(圖4B)。單片段材料M77、M120的QTL加性效應(yīng)分別為0.24、0.17,表型貢獻(xiàn)率分別為36.34%、25.03%;M133、M142材料分別攜帶來自11號和12號染色體耐旱QTL,分別為qRRN11-1和qRRN12-1(圖3C、3D,圖4C、4D),加性效應(yīng)分別為0.16、0.11,表型貢獻(xiàn)率分別為23.59%、16.64%(表3)。

注:* 表示供試材料的相關(guān)性狀值與‘HJX74’在P<0.01水平差異顯著。

圖3 耐旱SSSLs中QTLs的替換圖譜

表3 PEG處理條件下耐旱SSSLs的相對芽長及相對根數(shù)QTLs及其遺傳效應(yīng)

3 討論與結(jié)論

干旱是作物生長及其產(chǎn)量增加的重要限制因素,因此進(jìn)行抗旱品系篩選與研究具有重要意義[17]。Han等[18]利用20% PEG-6000模擬干旱條件,發(fā)現(xiàn)水稻發(fā)芽期第6天根長、根數(shù)、苗高和胚芽鞘長等指標(biāo)均受到干旱脅迫條件的抑制。Li等[19]研究表明在15% PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫下,旱稻‘IRAT109’和低地水稻‘Yuefu’兩品種的種子發(fā)芽勢、幼苗根長和芽長均顯著降低。熊雪等[20]利用20% PEG-6000模擬干旱環(huán)境,采用隸屬函數(shù)法對相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長、相對胚芽長、相對鮮質(zhì)量及抗旱指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行耐旱性分析,采用綜合指標(biāo)對21份谷子材料進(jìn)行耐旱性綜合評價,篩選出抗旱性最強(qiáng)的品種為‘承谷9’。本研究以平均隸屬函數(shù)值作為水稻SSSLs芽期耐旱性標(biāo)準(zhǔn)來評價各SSSLs的耐旱性,發(fā)現(xiàn)各SSSLs在20% PEG-6000模擬干旱條件下的芽長、根長、胚芽鞘長、根數(shù)、干物質(zhì)量等指標(biāo)均受到一定程度的影響,不同基因型水稻對干旱脅迫的反應(yīng)有所不同,且不同材料評價指標(biāo)代表的耐旱能力也不完全相同,這與熊雪等[20]研究結(jié)果較為一致。田敬園[21]利用土壤干旱法探究抗旱復(fù)合劑對谷子幼苗生長發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)抗旱復(fù)合劑處理組的谷子幼苗根長和芽長受到的影響較小,而未處理組谷子幼苗根長和芽長顯著減小。Yamane等[22]采用育苗盤對5個水稻品種進(jìn)行干旱脅迫處理,結(jié)果表明耐旱性強(qiáng)的水稻品種芽長較長、種子干物質(zhì)重較低。本研究在20% PEG-6000模擬干旱條件下,以相對芽長為耐旱指標(biāo)時,篩選出2個SSSLs的相對芽長顯著高于受體‘HJX74’,表明芽長可作為耐旱性的評價指標(biāo)。綜上可知,利用高滲溶液進(jìn)行干旱脅迫處理的效果與土壤干旱相似,能夠起到模擬干旱脅迫的作用。前人對于水稻耐旱性的評價多采用單一指標(biāo),無法全面有效評價品種的耐旱性,本研究選用20% PEG-6000模擬干旱條件下與耐旱性相關(guān)的6個指標(biāo),以平均隸屬函數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn),通過單因素方差分析及多重比較得出相對芽長、相對根數(shù)可作為SSSLs芽期耐旱性QTL鑒定的指標(biāo),以這兩個指標(biāo)對SSSLs 進(jìn)行耐旱QTL的初步鑒定,結(jié)果更為可靠。

水稻干旱基因調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,應(yīng)對干旱的效應(yīng)QTL在不同時期發(fā)揮的作用可能不同,有些效應(yīng)QTL在特定的時期才會發(fā)揮作用被檢測出來[23-24]。關(guān)于水稻苗期相關(guān)性狀定位有較多報道,主要集中在對水稻的胚芽鞘長、胚根長、根表面積、體積等方面進(jìn)行遺傳分析與QTL定位。王嬌[25]以雜交組合構(gòu)建重組自交系為試驗材料,在20% PEG-6000模擬干旱條件下檢測到發(fā)芽勢與苗高有關(guān)的QTLqGV3-2和Qsh5-2,表型貢獻(xiàn)率分別為14.98%和15.61%。田彪等[26]利用秈稻‘9311’和粳稻‘日本晴’(Nipponbare,NPB)為親本構(gòu)建的148個重組自交系群體為材料,共檢測到26個控制最長根長、總根系長、根表面積、根體積和根直徑的QTLs;其中在第4號染色體上檢測到控制最長根長的QTLqLRL4,利用InDel標(biāo)記在IND4-1和IND4-3之間將其精細(xì)定位,長約68.23 kb。姜雪[27]以‘珍汕97 B’(‘ZS97B’)和‘IRAT109’構(gòu)建的重組自交系RIL為試驗材料,利用18% PEG-6000模擬干旱條件在水稻苗期開展耐旱QTL定位試驗,脅迫處理條件下共檢測到26個生理生化相關(guān)的QTLs,其中在1號染色體RM220-RM490區(qū)間檢測到過氧化氫(H2O2)相關(guān)位點,該區(qū)間包含在本研究鑒定的相對芽長QTLqRSL1-1的區(qū)間RM490-RM572,表明水稻1號染色體該區(qū)間存在與植株地上部耐旱相關(guān)的QTL;同時在10號染色體RM216-RM311區(qū)間檢測到總抗氧化能力(AOC)和過氧化氫(H2O2)相關(guān)位點,3個相鄰區(qū)間RM222-RM216、RM311-RM467和RM216-RM311定位到2個丙二醛(MDA)和1個總抗氧化能力(AOC)相關(guān)位點,其中包含本研究鑒定的相對根數(shù)QTLqRRN10-1的區(qū)間RM406-PSM164,表明水稻10號染色體該區(qū)間存在與植株地下部耐旱相關(guān)的QTL。徐穎[28]利用導(dǎo)入系群體進(jìn)行水稻耐旱性QTL定位,在每穗總粒數(shù)、千粒重性狀定位到抗旱QTL,均位于11號染色體的RM260位置,包含在本研究鑒定的相對根數(shù)QTLqRRN11-1的區(qū)間RM202-PSM415內(nèi),表明水稻11號染色體該區(qū)間存在與水稻耐旱相關(guān)的QTL。王江旭[29]對水稻劍葉面積、凈光合速率進(jìn)行多環(huán)境聯(lián)合分析,在12號染色體的RM1300-RM1310區(qū)間定位到耐旱加性QTL,同時株高在該區(qū)間也檢測到QTL,包含在本研究鑒定的相對根數(shù)QTLqRRN12-1的區(qū)間PSM465-PSM193內(nèi)。Xu等[30]在不同年份干旱處理條件下定位到株高、穗長QTLs,分別為qPHP-12和qPL-12-1,依次位于12號染色體的RM2529-RM1337區(qū)間和RM270-RM3455區(qū)間,均包含在本研究鑒定的相對根數(shù)QTLqRRN12-1的區(qū)間PSM465-PSM193內(nèi),表明水稻12號染色體該區(qū)間存在控制耐旱性狀的數(shù)量基因簇。

本研究以構(gòu)建的單片段代換系為供試材料,極大地減少了遺傳背景的干擾,通過20% PEG-6000溶液模擬干旱條件,在水稻抗旱性評價重要時期芽期進(jìn)行耐旱指標(biāo)篩選及耐旱性鑒定,采用的平均隸屬函數(shù)值能綜合反映各性狀指標(biāo)受干旱影響的程度;篩選出相對芽長、相對根數(shù)作為耐旱QTL鑒定材料的指標(biāo),在這2個指標(biāo)上共鑒定到4個耐旱QTLs,這些QTLs均表現(xiàn)出正的加性效應(yīng),同時篩選出了耐旱性較強(qiáng)的SSSLs。此外,試驗在室內(nèi)開展,操作方法簡便,結(jié)果可靠性強(qiáng)。今后可將篩選出的芽期耐旱材料進(jìn)一步應(yīng)用于苗期及大田試驗,為探索作物耐旱機(jī)制、篩選和培育水稻耐旱品系提供參考和指導(dǎo)。