王青慧, 王曉黎, 李波, 胡傳翠, 聶明朝, 龐曉慶, 張亞芳

海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科(海南?？?570206)

宮頸癌是女性癌癥死亡的第四大病因,嚴(yán)重威脅女性患者的健康[1],雖然宮頸癌疫苗可有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生,但是宮頸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確,臨床上仍然沒有有效的方法治療和預(yù)測宮頸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2-3],所以需要探究更多調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,并尋找更多有效的宮頸癌治療靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,可調(diào)控腫瘤等多種疾病的病理過程[4],Chaichian等[5]研究表明,circRNA是一種新型宮頸癌生物標(biāo)志物。腫瘤微環(huán)境對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及耐藥等病理過程均有調(diào)控作用。腫瘤微環(huán)境組分復(fù)雜,包括多種基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞等,在宮頸癌等惡性腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞中,巨噬細(xì)胞是浸潤最為豐富的免疫細(xì)胞,被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,其功能及特征與M2型巨噬細(xì)胞相似,可介導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[6-7],并且Saili Duan研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能受circRNA的調(diào)控[8]。2021年9月至2023年3月本研究通過前期探究發(fā)現(xiàn)circRNA-1565在宮頸癌組織中高表達(dá),本文即探究了circRNA-1565對巨噬細(xì)胞極化的影響,旨在發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的新機(jī)制。研究經(jīng)海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過(HNWCMC倫審2022年第〔14〕號)。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞購自廣州欣源生物科技有限公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、白細(xì)胞介素-4(interleukin 6,IL-4)購自北京索萊寶科技有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR擴(kuò)增試劑盒購自北京聚合每生物科技有限公司;CD163、CD11B、GAPDH、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR抗體、山羊抗兔IGg購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與巨噬細(xì)胞誘導(dǎo) HeLa培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)RPMI 1640培養(yǎng)基中,THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含12%FBS、1%青霉素鏈霉素、50 μmol/L β巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)至回合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。THP1培養(yǎng)基中加入100 ng/mL PMA孵育48 h,誘導(dǎo)THP1分化為貼壁M0型巨噬細(xì)胞,M0型巨噬細(xì)胞與50 ng/mL LPS共孵育48 h,誘導(dǎo)其分化為M1型巨噬細(xì)胞,M0型巨噬細(xì)胞與20 ng/mL IL-4共孵育48 h,誘導(dǎo)其分化為M2型巨噬細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組 THP1分為THP1+PMA組、THP1+PMA+LPS組、THP1+PMA+IL-4組。THP1+PMA組為M0型巨噬細(xì)胞,THP1+PMA+LPS組THP1細(xì)胞與100 ng/mL PMA和50 ng/mL LPS共孵育48 h,THP1+PMA+IL-4組THP1細(xì)胞與100 ng/mL PMA和20 ng/mL IL-4共孵育48 h。

M0型巨噬細(xì)胞分為circRNA-1565組和Vector組,即M0型巨噬細(xì)胞使用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染circRNA-1565過表達(dá)質(zhì)粒以及Negative Control。

HeLa細(xì)胞分為M0+Vector組和M0+circRNA-1565組,即HeLa細(xì)胞分別與轉(zhuǎn)染circRNA-1565過表達(dá)質(zhì)粒以及Negative Control的M0型巨噬細(xì)胞共孵育48 h。

1.2.3 qRT-PCR 使用TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA,使用核酸定量儀檢測RNA濃度,取1 μg RNA,根據(jù)FastQuant RT Kit試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為:1 μL稀釋5倍的cDNA、5 μL SYBR Green Mix、引物F、R各0.2 μL,補(bǔ)足ddH2O。預(yù)變性95℃、30s,94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸 1 min,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)。GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。

表1 CD16、TLR2、CD206、CD14、circRNA-1565、GAPDH引物序列

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞CD163和CD11B表達(dá) 取circRNA-1565組和Vector組巨噬細(xì)胞,每組5×105個(gè)細(xì)胞于流式管中,每管加入200 μL PBS緩沖液,每管加入5 μL CD163-PE抗體,避光孵育10 min,加入5 μL CD11B-APC抗體混勻避光孵育5 min,單染管CD163-PE抗體和CD11B-APC抗體,使用PBS再次清洗后上機(jī)檢測各組細(xì)胞CD163和CD11B表達(dá)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) HeLa細(xì)胞接種于24孔板中,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞生長至回合率達(dá)90%時(shí),在24孔板中央輕輕劃痕,將孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為600 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,并在拍照記錄劃痕,Transwell中接種circRNA-1565組和Vector組細(xì)胞1×104個(gè),小室至于24孔板中,共培養(yǎng)48 h后,顯微鏡下拍照記錄細(xì)胞劃痕。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移與侵襲 用不含F(xiàn)BS RPMI 1640培養(yǎng)基將HeLa細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/mL,用于檢測細(xì)胞遷移和侵襲的Transwell小室中每孔接種100 μL細(xì)胞稀釋液。24孔板中接種1×105個(gè)轉(zhuǎn)染后的circRNA-1565組和Vector組巨噬細(xì)胞,細(xì)胞貼壁后,將24孔板中的培養(yǎng)基更換為600 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,小室至于6孔板中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,取出小室,小室底部清洗后用無水甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色10 min,清洗晾干后,于顯微鏡下觀察并拍照,比較各組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)。

1.2.7 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后的circRNA-1565組和Vector組巨噬細(xì)胞1×106個(gè)。加入100 μL細(xì)胞裂解液于冰上裂解10 min,12 000×g離心5 min,取上清液為總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取10 μg蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)至 0.45 μm的PVDF 膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉,p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗于4℃過夜孵育,山羊抗兔IgG室溫孵育2 h;TBST洗滌3次后進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad 8.0軟件用來進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪制相關(guān)圖片。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA-1565在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果(圖1)顯示,相比于THP1+PMA組細(xì)胞,THP1+PMA+LPS組細(xì)胞M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD16和TLR2表達(dá)顯著增加(P<0.001),M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206和CD14表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001),說明M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功,而THP1+PMA+IL-4組細(xì)胞M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD16和TLR2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001),M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206和CD14表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001),說明M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。相比于M0型巨噬細(xì)胞,M1型巨噬細(xì)胞中circRNA-1565表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001),而M2型巨噬細(xì)胞中circRNA-1565表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001),提示circRNA-1565可能參與M2型巨噬細(xì)胞的極化。

注:A:各組細(xì)胞CD16、TLR2、CD206和CD14表達(dá)檢測結(jié)果;B:M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)圖;C:各組巨噬細(xì)胞circRNA-1565表達(dá)比較(相比于M0型巨噬細(xì)胞,*P<0.001)

2.2 circRNA-1565調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化 qRT-PCR檢測結(jié)果(圖2-A)顯示,相比于Vector組,circRNA-1565組巨噬細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD16和TLR2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001),M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206和CD14表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖2-B)顯示,circRNA-1565組細(xì)胞中CD163+CD11B+細(xì)胞比例顯著高于Vector組(P<0.001),說明circRNA-1565可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。

注:A:各組細(xì)胞CD16、TLR2、CD206和CD14表達(dá)檢測結(jié)果;B:流式細(xì)胞數(shù)檢測各組細(xì)胞CD163和CD11B表達(dá);*與Vector組比較P<0.001

2.3 circRNA-1565調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化而影響宮頸癌細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果(圖3-A)顯示,相比于M0+Vector組,M0+circRNA-1565組HeLa細(xì)胞劃痕愈合率顯著增加(P<0.001)。Transwell小室檢測結(jié)果(圖3-B)顯示,M0+circRNA-1565組HeLa細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于M0+Vector組,說明circRNA-1565調(diào)控的M2型巨噬細(xì)胞極化可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移能力。

注:A:各組細(xì)胞劃痕愈合率比較(×20倍);B:各組細(xì)胞遷移數(shù)比較(×20倍);*與M0+Vector組比較P<0.001

2.4 circRNA-1565調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化而影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力 Transwell小室檢測結(jié)果(圖4)顯示,M0+circRNA-1565組HeLa細(xì)胞侵襲數(shù)顯著高于M0+Vector組,說明circRNA-1565調(diào)控的M2型巨噬細(xì)胞極化可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。

注:A:Transwell小室檢測結(jié)果(×20倍);B:柱狀圖;*與M0+Vector組比較P<0.001

2.5 circRNA-1565調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路而影響M2型巨噬細(xì)胞極化 Western blot檢測結(jié)果(圖5)顯示,相比于Vector組,circRNA-1565組巨噬細(xì)胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平均顯著升高,即circRNA-1565可激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,提示circRNA-1565可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

3 討論

CircRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA,可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移能力,也可以調(diào)控腫瘤微環(huán)境中多種免疫細(xì)胞的分型[9]。Chen等[10]研究指出,circFARSA通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移, Li等[11]研究指出,CircITGB6能夠通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化而調(diào)控卵巢癌的順鉑耐藥,Yi等[12]研究指出,CircPLCE1能夠通過介導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化而促進(jìn)結(jié)直腸癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)circRNA-1565在宮頸癌組織中顯著高表達(dá),所以我們推測circRNA-1565能夠調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展,本文即探究了circRNA-1565對M2型巨噬細(xì)胞極化的影響,以及對巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的宮頸癌轉(zhuǎn)移的影響,旨在為宮頸癌的研究提供幫助。

由于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型與M2型巨噬細(xì)胞相似,在體外研究中常以M2型巨噬細(xì)胞為模型而研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能。本研究將THP1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞,并且檢測發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞中顯著高表達(dá)circRNA-1565,所以我們推測circRNA-1565具有調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化的功能。為了探究circRNA-1565對巨噬細(xì)胞極化的影響,本研究將circRNA-1565過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至M0巨噬細(xì)胞,并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后M2型細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206和CD14表達(dá)顯著增加,并且CD163+CD11B+細(xì)胞比例顯著增加,說明circRNA-1565可顯著促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

Ding等[13]研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)淋巴管的生成而促進(jìn)宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移, Kawachi等[14]亦研究指出,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有用于宮頸癌診斷的潛力。 Guo等[15]研究表明,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤與患者的不良預(yù)后和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究將circRNA-1565組巨噬細(xì)胞與宮頸癌細(xì)胞HeLa共孵育后,HeLa細(xì)胞的劃痕愈合率、細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著增加,說明circRNA-1565可通過介導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

PI3K/Akt/mTOR途徑介導(dǎo)來自多個(gè)受體的信號,包括胰島素受體和病原體相關(guān)分子模式受體。因此,Akt途徑將炎癥和代謝信號匯聚在一起,以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的反應(yīng),從而調(diào)節(jié)其活化表型[16]。Zhao等[17]研究指出,PI3K/Akt信號通路的激活可激活M2型巨噬細(xì)胞的極化。本研究亦發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA-1565后巨噬細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平顯著增加,即PI3K/AKT/mTOR信號通路顯著激活,說明circRNA-1565可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述,circRNA-1565可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,其機(jī)制可能為激活巨噬細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2型極化,但其臨床應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:王青慧:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案、負(fù)責(zé)論文起草、分析數(shù)據(jù)、負(fù)責(zé)修訂;王曉黎、李波:負(fù)責(zé)采集 析數(shù)據(jù)負(fù)責(zé)論文起草;胡傳翠:負(fù)責(zé)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),負(fù)責(zé)論文起草;聶明朝:整理文獻(xiàn),負(fù)責(zé)論文起草;龐曉慶;負(fù)責(zé)采集、分析數(shù)據(jù);張亞芳提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案。