楊文靜, 劉巖, 朱萌萌, 李燦, 阿迪拉·艾沙, 張園

1新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(新疆烏魯木齊830011); 2新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(附屬腫瘤醫(yī)院) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心(新疆烏魯木齊 830011)

肺癌(lung cancer)是最常見的惡性腫瘤之一,已成為全球范圍內(nèi)惡性腫瘤致死的首要原因[1-2]。非小細(xì)胞肺癌癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC) 約占所有肺癌病例的 85%,其中肺腺癌占NSCLC中的70%左右[3]。超過一半的肺腺癌患者在最初診斷時(shí)即顯示出局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中位生存期僅為10個(gè)月[4-6]。盡管手術(shù)、化療、放療、靶向治療、免疫治療等多種治療方法不斷發(fā)展,肺腺癌患者的總體5年生存率仍低至 25%[7],伴有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移僅接受化療的患者總體5年生存率為 6%[8]。因此,篩選出具有高度組織特異度和敏感度的肺腺癌腫瘤標(biāo)記物,對肺腺癌的早期診斷、預(yù)后判斷和精確治療有著重要的意義。驅(qū)動蛋白家族4A(kinesin family member 4A,KIF4A)是驅(qū)動蛋白超家族(KIFs)的成員之一,發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,在細(xì)胞有絲分裂過程中調(diào)控染色體的凝聚及分離[9]。已有研究報(bào)道,KIF4A 的異常表達(dá)會導(dǎo)致紡錘體異常分離,并和非整倍體子的形成有密切聯(lián)系[10]。既往研究表明,KIF4A在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用,在多種腫瘤中KIF4A表達(dá)異常升高,發(fā)揮原癌基因的作用,如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳腺癌等,在部分腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用,如胃癌[11-12]。在肺腺癌中,KIF4A顯著升高,沉默KIF4A的表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移和促進(jìn)凋亡[13]。然而,KIF4A的異常表達(dá)是否與肺腺癌危險(xiǎn)因素、腫瘤免疫細(xì)胞浸潤、患者疾病特異性生存相關(guān)尚不完全清楚。因此,在2022年1月至2022年5月我們利用生物信息學(xué)方法結(jié)合免疫組織化學(xué)染色法分析KIF4A在肺腺癌中的表達(dá)差異性,研究KIF4A表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系,探討KIF4A表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料 兔多抗KIF4A,山羊抗兔IgG H&L, abcam,美國。

1.2 臨床組織樣本 收集肺腺癌組織標(biāo)本73例,取手術(shù)切除或穿刺的肺腺癌組織及遠(yuǎn)端正常組織標(biāo)本,全部病例均通過臨床、影像學(xué)、病理診斷,術(shù)前未進(jìn)行輔助治療,臨床隨訪資料齊全。獲取標(biāo)本前告知患者并簽署知情同意書。本研究己獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)(K-2021021)。

1.3 數(shù)據(jù)獲取及方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫的Pan-Cancer Project中下載RNA序列數(shù)據(jù)(Level 3 HTseq-FPKM)。另外,從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載肺腺癌RNA序列數(shù)據(jù),對配對(57對)和非配對(535個(gè)肺腺癌組織和59個(gè)相鄰正常肺組織)進(jìn)行KIF4A差異分析。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟水化,加3%H2O2室溫處理10 min,在枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中微波加熱10 min(92～98 ℃)進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻后5%小牛血清室溫處理10 min,分別滴加1∶100稀釋的KIF4A一抗抗體,4 ℃孵育過夜,再分別滴加1∶200稀釋的二抗,室溫處理30 min,再加SP(1∶100)工作液室溫處理30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片后光鏡下觀察并攝片。

1.5 預(yù)后分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取臨床資料。FIGO分期、年齡、性別、殘余腫瘤為臨床特征;生存數(shù)據(jù)包括總生存期(OS)、疾病特異性生存期(DSS)和無進(jìn)展時(shí)間間隔(PFI)。我們測定了肺腺癌患者中KIF4A的中位表達(dá),并利用該值創(chuàng)建了“高KIF4A”和“低KIF4A”組。Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)提示兩組生存結(jié)局(OS、DSS、PFI)存在差異。此外,使用單因素和多因素Cox回歸分析來確定獨(dú)立預(yù)后變量。利用R軟件包“RNA”生成nomogram KIF4A預(yù)后價(jià)值可視化圖。采用ROC曲線和校正曲線來檢驗(yàn)兩者的區(qū)別和校正。

1.6 免疫細(xì)胞浸潤分析 使用R包gsa(3.6版)和腫瘤免疫評估資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)中的單樣本GSEA (ssGSEA)方法全面研究宮頸癌中腫瘤免疫相互作用的分子特征。在文獻(xiàn)中,我們利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)研究了KIF4A表達(dá)對免疫細(xì)胞浸潤的影響。為探討KIF4A表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞豐度的相關(guān)性,采用Wilcoxon秩和Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)計(jì)算P值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Spearman秩和檢驗(yàn)兩組表達(dá)差異和相關(guān)性。采用Log-rank檢驗(yàn),Kaplan-Meier生存曲線分析生存結(jié)局。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(HR)。采用GraphPad Prism8和R version 3.6.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF4A在泛癌和肺腺癌組織中的表達(dá) 首先,我們確定了KIF4A在各類腫瘤中的mRNA表達(dá)情況,并著重研究了肺腺癌。研究結(jié)果表明KIF4A在泛癌患者中的表達(dá)存在顯著差異(31/33,P<0.05,圖1-A)。此外,通過結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中的正常組織樣本和肺腺癌組織對KIF4A的表達(dá)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)KIF4A在肺腺癌組織中表達(dá)升高(P<0.001)(圖1-B)。同時(shí),在配對樣本中也觀察到KIF4A在肺腺癌組織中顯著上調(diào)(圖1-C)。進(jìn)一步收集臨床標(biāo)本,對KIF4A進(jìn)行蛋白免疫組化染色,結(jié)果顯示肺腺癌組織中KIF4A的蛋白表達(dá)水平較高(圖2-A),正常樣本中KIF4A蛋白表達(dá)較低(圖2-B)。這些數(shù)據(jù)表明KIF4A基因表達(dá)在肺腺癌中異常高表達(dá)。

注:A:KIF4A在泛癌組織中的表達(dá);B:TCGA數(shù)據(jù)庫KIF4A非配對樣本的差異表達(dá);C:TCGA數(shù)據(jù)庫KIF4A配對樣本的差異表達(dá)。*與正常組織比較P<0.001

注:A:肺腺癌組織;B:正常組織

2.2 KIF4A表達(dá)與臨床特征相關(guān)性的鑒定 將KIF4A表達(dá)與相應(yīng)臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明,KIF4A與 TNM分期(圖3-A～C)、年齡(圖3-D)、病理分期(圖3-E)、性別(圖3-F)、煙齡(圖3-G)、殘余腫瘤(圖3-H)顯著相關(guān)(P<0.05)。同時(shí),以KIF4A表達(dá)中位數(shù)為因變量,logistic回歸分析顯示,高表達(dá)的KIF4A與T分期(晚期分期與早期,P<0.05)、N分期(N0vs. N1～3,P<0.05)、年齡(>65歲和≤65歲,P<0.05)、病理分期(Ⅰ期和Ⅱ～Ⅳ期,P<0.05)、性別(男與女,P<0.05)、煙齡(≥40年和<40年,P<0.05)相關(guān)。見表1。

表1 KIF4A表達(dá)與臨床特征的logistic回歸分析

注:A:T分期;B:N分期;C:M分期;D:年齡;E:病理分期;F:性別;G:煙齡;H:殘余腫瘤。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns P>0.05

2.3 KIF4A對肺腺癌患者的生存預(yù)后價(jià)值 對肺腺癌患者的總生存期(OS)進(jìn)行單因素和多因素Cox分析。單因素Cox分析結(jié)果顯示,T分期(P=0.002)、N期(P<0.001)、病理分期(P<0.001)、KIF4A表達(dá)(P=0.007)與肺腺癌患者的OS相關(guān)。在多變量Cox模型中,我們發(fā)現(xiàn)病理分期(P<0.05)和KIF4A表達(dá)(P=0.044)仍與預(yù)后差有關(guān)(表2)。并通過結(jié)合顯著性因素進(jìn)行多變量分析,構(gòu)建列線圖(圖4-E)。為了進(jìn)一步探討KIF4A的預(yù)后價(jià)值,我們對臨床亞組進(jìn)行了生存分析。根據(jù)KIF4A表達(dá)的中位數(shù),并以此選擇“高KIF4A”組和“低KIF4A”組,采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)提示兩組患者的生存(OS、DSS、PFI)差異。根據(jù)KM圖,KIF4A mRNA表達(dá)高的患者的存活時(shí)間明顯低于KIF4A mRNA低表達(dá)組(OS,P=0.007,圖4-A;DSS,P=0.008,圖4-B;PFI,P=0.044,圖4-C)。此外,我們還分析了KIF4A在狀態(tài)(腫瘤或正常)中的預(yù)測價(jià)值,ROC曲線結(jié)果顯示,KIF4A具有很好的預(yù)測性能(AUC:0.983,圖4-D)。同時(shí)根據(jù)時(shí)間變化評估KIF4A預(yù)測肺腺癌的預(yù)后敏感度和特異度,結(jié)果顯示ROC曲線1、3、5年的 OS 的曲線下面積 (area under curve,AUC) 分別為 0.619、 0.605、0.601 (圖4-F),提示 KIF4A 預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的敏感度和特異度較高。因此,KIF4A可能成為肺腺癌患者預(yù)后的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。

表2 肺腺癌預(yù)后因素的單因素和多因素Cox分析

注:Kaplan-Meier生存分析(A:OS;B:DSS;C:PFI);D:狀態(tài)(腫瘤或正常)的ROC曲線分析;E:列線圖;F:時(shí)間變化的ROC曲線分析

2.4 KIF4A與肺腺癌免疫浸潤的關(guān)系 免疫細(xì)胞浸潤是肺腺癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測因素。因此,我們通過R語言包中的ssGSEA算法和Spearman′s來研究KIF4A表達(dá)水平與24種免疫細(xì)胞之間的潛在聯(lián)系。結(jié)果顯示,除了Th1細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、Cytotoxic細(xì)胞、Neutrophils細(xì)胞和Tem細(xì)胞外,與其他細(xì)胞具有顯著相關(guān)性(圖5-A)。進(jìn)一步根據(jù)KIF4A的中位表達(dá)值將所有肺腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,結(jié)果顯示除Th1細(xì)胞、Tem細(xì)胞、Neutrophils細(xì)胞、Treg細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、Cytotoxic細(xì)胞、Tcm細(xì)胞、NK CD56dim細(xì)胞外,其余細(xì)胞組間差異均顯著,P<0.05 (圖5-B～D)。此外,ESTIMATE分析顯示,低KIF4A組比高KIF4A組有更高的免疫和基質(zhì)評分(圖5-E)。

注:A:對24個(gè)免疫細(xì)胞和KIF4A表達(dá)進(jìn)行Spearman分析;B～D:KIF4A不同表達(dá)與24個(gè)免疫細(xì)胞的差異表達(dá)分析;E:比較基于ESTIMATE工具的基質(zhì)評分、免疫評分和ESTIMATE評分。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, ns P>0.05

3 討論

近年來,隨著高通量測序和生物信息學(xué)的發(fā)展,形成了一種新的研究模式[14]?？蒲腥藛T根據(jù)自己感興趣的領(lǐng)域?qū)ο嚓P(guān)的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分類和下載[15]。同時(shí),研究人員進(jìn)一步整合和比較不同實(shí)驗(yàn)室的類似實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),挖掘出潛在的有用數(shù)據(jù)。

肺腺癌是一種惡性程度高、預(yù)后差的肺癌,其特征是發(fā)生胸部、肝臟、骨骼甚至顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的可能性增加[16]。目前,大多數(shù)肺腺癌患者被診斷為晚期,由于存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無法進(jìn)行手術(shù)治療,盡管放化療可以改善癥狀,但不良反應(yīng)是顯著的[17]。因此,有必要在早期發(fā)現(xiàn)更準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物并監(jiān)測疾病進(jìn)展,高通量基因測序和生物信息學(xué)可能為肺腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供新的途徑。在本研究中,我們分析了KIF4A在肺腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值以及KIF4A的表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系,試圖探索KIF4A促作為分子生物標(biāo)志物的可行性。

根據(jù)之前的研究,KIF4A參與了多種細(xì)胞過程,如細(xì)胞中的運(yùn)輸功能和細(xì)胞分裂功能[18]。越來越多的證據(jù)表明,KIF4A是多種惡性腫瘤的致癌基因。例如,KIF4A可以誘導(dǎo)p21介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程,從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[19]。在肝細(xì)胞癌中,KIF4A通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲發(fā)揮致癌作用[20]。此外,KIF4A在前列腺癌中表達(dá)上調(diào),與臨床預(yù)后不良相關(guān)[21]。在本研究中,我們分析了KIF4A在泛癌中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)KIF4A mRNA的表達(dá)水平在大多數(shù)癌癥類型中上調(diào),通過免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的癌旁正常組織比較,肺腺癌組織中KIF4A蛋白的表達(dá)水平顯著升高,進(jìn)一步驗(yàn)證了KIF4A對肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的致癌作用,與多數(shù)研究研究結(jié)果一致。

本研究采用logistic回歸分析方法探討KIF4A表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)KIF4A表達(dá)與T分期、N分期、年齡、病理分期、性別、煙齡顯著相關(guān)。此外,單因素Cox分析顯示T分期、N期、病理分期和KIF4A表達(dá)與肺腺癌患者的OS相關(guān)。在多變量Cox分析中,我們發(fā)現(xiàn)病理分期和KIF4A表達(dá)是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。并通過結(jié)合顯著性因素進(jìn)行多變量分析,構(gòu)建列線圖有助于更加直觀地了解 KIF4A 表達(dá)水平在肺腺癌預(yù)后預(yù)測方面的重要性。同時(shí)通過分析KIF4A 高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存預(yù)后,結(jié)果顯示 KIF4A 高表達(dá)組患者的OS、DSS、PFI的生存時(shí)間短于低表達(dá)組患者。Taniwaki等[22]研究表明,KIF4A 是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Song等[13]研究發(fā)現(xiàn),KIF4A高表達(dá)患者在LUAD中的生存周期較低表達(dá)患者顯著降低,本研究結(jié)果與其一致。上述研究結(jié)果和ROC曲線分析表明,KIF4A 高表達(dá)提示肺腺癌患者預(yù)后差,有可能成為肺腺癌患者預(yù)后預(yù)測的潛在分子標(biāo)志物。

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)由多種類型的免疫細(xì)胞組成,在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性中發(fā)揮重要作用[23]。值得注意的是,現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,一些驅(qū)動蛋白家族成員,如KIF18A和KIF20A,已有研究報(bào)道表明參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤[24],而關(guān)于KIF4A在免疫浸潤方面的作用尚不完全清楚。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的組成對腫瘤微環(huán)境和腫瘤的行為有重要影響。先天免疫細(xì)胞包括NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞,在抑制和監(jiān)測腫瘤中起著關(guān)鍵作用,適應(yīng)性免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和T記憶細(xì)胞,對抗癌免疫治療很重要[25]。在本研究中,我們分析了KIF4A的表達(dá)是否與肺腺癌的免疫浸潤水平有關(guān),研究結(jié)果顯示,KIF4A表達(dá)與來自先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的6個(gè)免疫效應(yīng)細(xì)胞的腫瘤浸潤呈正相關(guān),13個(gè)免疫效應(yīng)細(xì)胞的腫瘤浸潤呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示,肺腺癌微環(huán)境中KIF4A的高表達(dá)可能伴隨免疫監(jiān)測降低,發(fā)生免疫逃逸,從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。

綜上所述,KIF4A在肺腺癌組織中高表達(dá),與肺腺癌患者不良臨床特征和預(yù)后顯著相關(guān),可能與腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤水平與腫瘤免疫逃逸存在一定相關(guān)性。因此,KIF4A可作為肺腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物,為肺腺癌的預(yù)后評估及治療策略提供了一定的依據(jù)。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:楊文靜、張園:確定選題、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、論文撰寫;劉巖、朱萌萌、阿迪拉·艾沙:數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理;張園:論文審核、項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助。