曾加義, 劉艷君, 湯延淋, 張長(zhǎng)征, 葉楚津, 余玉明△

南方醫(yī)科大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室(廣東廣州 510515); 3南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)泌尿外科(廣東廣州 510080)

腎細(xì)胞癌 (RCC) 是泌尿系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤[1],其發(fā)病率正逐步升高[2]。腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型,占RCC的80%以上[3]。ccRCC 具有相對(duì)特殊的免疫學(xué)特征[4],其對(duì)常規(guī)化療和放療均不敏感,而免疫治療的低反應(yīng)率也限制了其治療效果[5]。因此,我們需要尋找新的治療靶點(diǎn)來(lái)改善ccRCC的預(yù)后。表觀遺傳改變是目前公認(rèn)的癌癥標(biāo)志[6],其由染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子 (CRs) 驅(qū)動(dòng)。CRs已被證明是表觀遺傳學(xué)不可或缺的上游調(diào)節(jié)因子[7]。已有的研究表明,CRs的突變和異常調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、腫瘤異質(zhì)性和細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥[8-12]。然而,CRs在ccRCC中的作用及價(jià)值尚不清楚。本研究希望通過(guò)生物信息學(xué)方法研究ccRCC中CRs的表達(dá)譜和預(yù)后價(jià)值,構(gòu)建CRs相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)模型,為臨床預(yù)測(cè)ccRCC患者的預(yù)后和開(kāi)發(fā)有效的治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理 從癌癥基因組圖譜(https://portal.gdc.cancer.gov/,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了ccRCC和相應(yīng)正常腎組織的轉(zhuǎn)錄組信息以及患者的臨床信息。TCGA中不具有完整的臨床參數(shù)和生存時(shí)間<30 d的樣本被排除,最終得到499例ccRCC樣本,并以7∶3的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練隊(duì)列和測(cè)試隊(duì)列。從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)獲取了E-MTAB-1980 隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組信息和臨床信息,其包含101例ccRCC樣本,并作為外部測(cè)試隊(duì)列。這些樣本的臨床特征見(jiàn)表1。

表1 患者的臨床特征 例(%)

1.2 差異表達(dá)的CRs的鑒定 從前人發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得了870個(gè)CRs[7]。在TCGA數(shù)據(jù)集中執(zhí)行“l(fā)imma”R包來(lái)鑒定ccRCC與正常腎組織之間差異表達(dá)的CRs,篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|>1 和false discovery rate (FDR) <0.001。

1.3 CR相關(guān)的預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 對(duì)差異表達(dá)的CRs進(jìn)行單因素Cox回歸分析,顯著性過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為P<0.001,由此得到預(yù)后相關(guān)的CRs。然后進(jìn)行多因素Cox回歸分析,并在訓(xùn)練隊(duì)列中構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=Σ(Coefi×Expi),其中Expi和Coefi和分別表示每個(gè)基因的表達(dá)量和風(fēng)險(xiǎn)回歸系數(shù)。

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier生存曲線用于比較兩組的預(yù)后,并使用受試者工作特征(ROC)曲線對(duì)應(yīng)的曲線下面積(AUC)值來(lái)評(píng)估模型的效率。測(cè)試隊(duì)列及E-MTAB-1980外部隊(duì)列用于進(jìn)一步驗(yàn)證模型的性能。

1.4 獨(dú)立預(yù)后分析 將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為一個(gè)預(yù)后因素,與年齡、性別、T分期、M分期、組織學(xué)分級(jí)和AJCC分期進(jìn)行單變量和多變量Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析,以評(píng)估各個(gè)參數(shù)對(duì)患者總生存期的影響,并判斷風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否可以作為獨(dú)立預(yù)后因素。

1.5 免疫特征 使用ESTIMATE算法計(jì)算所有樣本的TME評(píng)分(免疫評(píng)分、間質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分)以評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的TME差異?！癎SVA ”包和“GSEABase”包用于執(zhí)行ssGSEA以評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間16種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)和13種免疫相關(guān)通路的活性。

1.6 組織樣本和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 我們既往收集了18例ccRCC樣本和6例相應(yīng)的癌旁樣本,并根據(jù)制造商的協(xié)議進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,依據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證基因的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Wilcoxon檢驗(yàn)用于兩組之間差異的比較,差異表達(dá)基因的鑒定基于配對(duì)t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析方法和R軟件包均在R 4.0.4版本中進(jìn)行,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC與癌旁組織中差異表達(dá)的CRs的鑒定 我們從TCGA數(shù)據(jù)中提取了870個(gè)CRs的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過(guò)“l(fā)imma”包最終共鑒定出89個(gè)差異表達(dá)的CRs,其中包括58個(gè)上調(diào)的CRs和31個(gè)下調(diào)的CRs。這些基因的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖1。

圖1 89個(gè)CRs在ccRCC與癌旁組織中的表達(dá)熱圖

2.2 Cox回歸分析及預(yù)后基因鑒定 我們對(duì)89個(gè)差異表達(dá)的CRs進(jìn)行單因素Cox回歸分析,得到33個(gè)與ccRCC預(yù)后顯著相關(guān)的CRs:CDC6、UHRF1、RIT1、KMT5C、TSPYL4、APOBEC3H、C17orf49、TTK、RAD51、BUB1、PBK、PRC1、RAD54L、APOBEC3D、KAT2A、LMNB1、TOP2A、PYGO1、SP140、FOXP3、ERCC6L、L3MBTL1、ZHX3、PPARGC1A、HJURP、GLYATL1、AURKB、NCOA7、HDAC10、CDK3、ASF1B、TOX3、EZH2(圖2)。然后進(jìn)行多因素Cox回歸分析,最終鑒定到具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的4個(gè)CRs(圖3),并在圖4中展示了這些基因的mRNA水平。隨后根據(jù)4個(gè)CRs的回歸系數(shù)在訓(xùn)練隊(duì)列中構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。

圖2 單因素Cox回歸分析

圖3 多因素Cox回歸分析

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=1.101×TTK表達(dá)量+0.976×L3MBTL1表達(dá)量-0.201×GLYATL1表達(dá)量-0.627×TOX3表達(dá)量。

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier生存分析表明高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS較短(圖5)。1、3、5年的ROC曲線的AUC值分別為0.722、0.677、0.762,表明模型具有良好的預(yù)測(cè)性能(圖6)。

圖5 TCGA訓(xùn)練隊(duì)列生存分析

圖6 TCGA訓(xùn)練隊(duì)列ROC曲線

2.3 預(yù)后模型的驗(yàn)證 Kaplan-Meier分析顯示,在測(cè)試隊(duì)列和E-MTAB-1980外部隊(duì)列中,與低風(fēng)險(xiǎn)組的患者相比,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的OS較短(圖7、8)。在測(cè)試隊(duì)列中,預(yù)后模型1、3、5年的AUC值分別為0.700、0.756和0.714(圖9)。在E-MTAB-1980外部隊(duì)列中,模型1、3、5年的AUC值分別為0.866、0.857、0.829(圖10),顯示出優(yōu)越的預(yù)測(cè)性能。

圖7 TCGA測(cè)試隊(duì)列生存分析

圖8 E-MTAB-1980隊(duì)列生存分析

圖9 TCGA測(cè)試隊(duì)列ROC曲線

圖10 E-MTAB-1980隊(duì)列ROC曲線

2.4 用于構(gòu)建模型的4個(gè)CRs的表達(dá)水平的驗(yàn)證 我們既往的測(cè)序結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)集的結(jié)果完全一致,TTK和L3MBTL1在ccRCC中高表達(dá),GLYATL1和TOX3在ccRCC中低表達(dá)(圖11)。

注:A:TTK;B:L3MBTL1;C:TOX3;D:GLYATL1

2.5 基于4個(gè)CRs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因素 我們使用單變量和多變量 Cox 回歸分析來(lái)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否可以作為獨(dú)立預(yù)后因素。單變量 Cox 回歸分析表明,年齡、組織學(xué)分級(jí)、AJCC 分期、T分期、M分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是ccRCC生存不良的獨(dú)立因素(圖12)。在使用多變量Cox 回歸分析調(diào)整其他混雜因素后發(fā)現(xiàn),風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分仍是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(圖13)。

圖12 單變量 Cox 回歸分析

圖13 多變量 Cox 回歸分析

2.6 高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫特征 ESTIMATE的評(píng)估結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組的患者擁有更高的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分(圖14)。ssGSEA結(jié)果表明,高風(fēng)險(xiǎn)組通常具有較高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平,尤其是CD8+T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,T輔助細(xì)胞等(圖15)。此外,高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫相關(guān)通路活性也更高,9種免疫途徑在高風(fēng)險(xiǎn)組的活性均高于低風(fēng)險(xiǎn)組(圖16)。

圖14 TME評(píng)分

圖15 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平

圖16 免疫通路活性

3 討論

ccRCC是一種相對(duì)特殊的腫瘤。與大多數(shù)腫瘤不同的是,其表觀遺傳調(diào)節(jié)因子頻繁突變(如SETD2、PBRM1和 BAP1),而其他常見(jiàn)癌癥的突變基因通路(如 RAS、BRAF、TP53、RB)在很大程度上不存在[13-16]。已有的研究證明,表觀遺傳改變?cè)赾cRCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17-18]。然而,驅(qū)動(dòng)表觀遺傳改變的CRs在ccRCC中如何發(fā)揮作用以及它們對(duì)預(yù)后的影響仍然未知。

在本研究中,我們首先在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到89個(gè)在ccRCC組織和正常腎組織之間差異表達(dá)的CRs,單變量Cox 回歸分析顯示33個(gè)CRs與ccRCC預(yù)后相關(guān),這表明CRs可能在ccRCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。隨后,我們通過(guò)執(zhí)行多變量Cox 回歸分析最終確定了4個(gè)具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值的CRs(TTK、L3MBTL1、GLYATL1和TOX3)并成功構(gòu)建了一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型。生存分析和ROC曲線表明該模型具有良好的預(yù)測(cè)性能,并在測(cè)試隊(duì)列和外部數(shù)據(jù)集中被驗(yàn)證。TTK也稱(chēng)為Mps1,其對(duì)有絲分裂關(guān)卡和染色體附著的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道,TTK在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TTK可通過(guò)激活PKCα/ERK1/2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,通過(guò)失活PI3K/Akt通路抑制腫瘤分化[19]。另一項(xiàng)研究也表明,TTK以p53依賴(lài)的方式激活A(yù)kt/mTOR通路,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[20]。此外,Liu等[21]發(fā)現(xiàn)TTK在ccRCC組織中高水平表達(dá),并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。在哺乳動(dòng)物中,L3MBTL1被證明是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子和可疑的腫瘤抑制基因[22-23]。L3MBTL1與Tel/Etv6相互作用并參與調(diào)節(jié)成人的造血過(guò)程[24]。L3MBTL可能是人類(lèi)髓系惡性腫瘤中20 號(hào)染色體 q12缺失的關(guān)鍵基因[25]。Gurvich等[26]認(rèn)為L(zhǎng)3MBTL1的缺失通過(guò)誘導(dǎo)復(fù)制應(yīng)激、DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性而導(dǎo)致20q(-)造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。Zeng等[27]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中L3MBTL1的高表達(dá)與低級(jí)別和激素受體陽(yáng)性相關(guān),且與低風(fēng)險(xiǎn)的疾病復(fù)發(fā)和死亡相關(guān)。甘氨酸-N-?；D(zhuǎn)移酶樣1 (GLYATL1)是GLYATL基因家族成員之一,其位于線粒體,編碼一種參與催化芳基乙酰基轉(zhuǎn)移的酶[28]。研究表明,GLYATL1不僅參與正常的生理代謝,還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。高GLYATL1啟動(dòng)子甲基化可能抑制GLYATL1的表達(dá)水平,進(jìn)而導(dǎo)致HCC的發(fā)生,且與較差的OS相關(guān)[29]。另一項(xiàng)研究也報(bào)道了GLYATL1在原發(fā)性前列腺癌中過(guò)度表達(dá),且受ETS 轉(zhuǎn)錄因子 ETV1 的調(diào)節(jié)[30]。作為T(mén)OX基因家族成員之一,TOX3在各種人類(lèi)疾病尤其是惡性腫瘤中異常表達(dá)或突變。TOX3在乳腺上皮細(xì)胞祖細(xì)胞中的表達(dá)可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[31]。TOX3表達(dá)升高與肺腺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期顯著相關(guān)[32]。此外,在ccRCC中,TOX3可通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控SNAI1和SNAI2來(lái)抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[33]。這些證據(jù)表明,我們識(shí)別到的4個(gè)CRs可能是包括ccRCC在內(nèi)的多種腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。有趣的是,我們通過(guò)腫瘤標(biāo)本的高通量測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了4個(gè)CRs的表達(dá)情況。單變量和多變量 Cox分析的結(jié)果也表明,基于4 個(gè)CRs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以獨(dú)立預(yù)測(cè)ccRCC的生存結(jié)果。

越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。本研究結(jié)果表明現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組的患者擁有更高的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分,表明它們可能擁有更高含量的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。ssGSEA分析結(jié)果表明,高風(fēng)險(xiǎn)組通常具有較高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平和免疫通路活性,這與前人的研究[34]結(jié)果一致。然而,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后更差,這表明了ccRCC微環(huán)境的復(fù)雜性。一方面,高風(fēng)險(xiǎn)組的ccRCC患者可能是具有特殊的免疫表型。盡管它擁有較多的免疫細(xì)胞,但這些免疫細(xì)胞不能滲透到腫瘤細(xì)胞內(nèi)核,而是被限制在腫瘤細(xì)胞的外圍基質(zhì)[35]。另一方面,微環(huán)境中的免疫細(xì)胞可以被多種信號(hào)通路誘導(dǎo)進(jìn)而發(fā)生功能障礙[36-38]。基于這些原因,微環(huán)境中的免疫細(xì)胞無(wú)法發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。一些新的研究表明,癌細(xì)胞代謝和免疫細(xì)胞代謝的相互作用能夠調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫和影響免疫治療的反應(yīng)[39]。ccRCC的特征之一是參與代謝途徑的靶基因發(fā)生突變[40],從而表現(xiàn)出不同的代謝模式。我們推測(cè)CRs可能通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境的免疫特征和代謝模式,進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。這表明靶向CRs或許可以調(diào)控腫瘤微環(huán)境,增強(qiáng)免疫治療療效,成為新的治療策略。

不得不承認(rèn)的是,本研究存在一些局限性。首先,我們分析的數(shù)據(jù)來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù),這需要在前瞻性的隊(duì)列中去驗(yàn)證。其次,CRs調(diào)控ccRCC的生物學(xué)行為的具體機(jī)制可能需要在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。

綜上所述,本研究結(jié)果表明CRs與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?；谌旧|(zhì)調(diào)節(jié)因子相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)ccRCC的預(yù)后。靶向CRs可能是未來(lái)治療ccRCC的一種潛在策略。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:曾加義參與研究設(shè)計(jì),統(tǒng)計(jì)分析,解釋數(shù)據(jù),起草論文。劉艷君、葉楚津、張長(zhǎng)征、湯延淋參與實(shí)施研究,整理數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)分析。余玉明參與醞釀和研究設(shè)計(jì),對(duì)論文的知識(shí)性?xún)?nèi)容做批評(píng)性審閱,指導(dǎo)工作。