白巖, 運(yùn)濤, 徐杰, 邢國(guó)強(qiáng), 趙國(guó)剛
天津市第五中心醫(yī)院普外一科(天津 300450)
結(jié)直腸癌(colorectal cancer)為常見消化道惡性腫瘤之一,好發(fā)于中老年患者,發(fā)病率在消化道系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌,而病死率則僅次于食管癌。目前,結(jié)直腸癌預(yù)后不佳主要與尚未完全探明結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制有關(guān),因此探究結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)機(jī)制并尋找新治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者預(yù)后尤為重要[1-2]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)系一種模式識(shí)別受體,同時(shí)也為一種免疫系統(tǒng)感受器分子,機(jī)體感染病毒或細(xì)菌時(shí),會(huì)生成AIM2炎性小體,參與機(jī)體免疫應(yīng)答[3]。核不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB,hnRNP AB)屬于核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)家族一員,主要參與RNA剪切、DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及端粒體生成等過(guò)程[4]。近年來(lái)研究顯示,AIM2、hnRNP AB在多種惡性腫瘤中異常表達(dá),且與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)為一類糖原蛋白,最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌組織中,早期用于結(jié)直腸癌的特異性診斷,但近年來(lái)研究顯示,CEA在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)狀態(tài),因此,CEA雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標(biāo),但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)等方面,仍有重要臨床價(jià)值[5]。為此,本研究回顧性分析了老年結(jié)直腸癌患者組織中的AIM2、hnRNP AB表達(dá)與血清CEA及臨床病理參數(shù)的關(guān)系,旨在為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新思路,報(bào)告如下。
1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理活檢確診為原發(fā)性結(jié)直腸癌患者;(2)年齡≥65歲;(3)術(shù)前未行放、化療、免疫治療;(4)臨床資料完整;(5)自愿參與研究。
排除標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<65歲;(2)合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙患者;(3)入組前已接受治療患者;(4)臨床資料不完整;(5)合并自身免疫病患者;(6)合并除結(jié)直腸癌外其他惡性腫瘤患者;(7)合并嚴(yán)重感染性疾病患者;(8)不愿參與本研究患者。
研究經(jīng)本院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)倫理審核通過(guò)(WZX-EC-KY2017001)。
1.2 一般資料 回顧性分析2017年6月至2020年6月收治的78例老年結(jié)直腸癌患者臨床資料。其中,男43例、女35例,年齡為65~85歲,平均(75.62±12.65)歲。
1.3 方法
1.3.1 臨床病理參數(shù)收集 回顧性收集78例老年患者的臨床病理參數(shù),包括性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、浸潤(rùn)程度、TNM分期、大體分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。
1.3.2 標(biāo)本來(lái)源 所有患者入院后均行結(jié)直腸癌根治術(shù),術(shù)前1 d清晨抽取3 mL空腹?fàn)顟B(tài)外周血,3 000 r/min離心處理10 min,分離血清,-80℃冷存待檢;術(shù)后留存新鮮(離體30 min內(nèi))癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5 cm)標(biāo)本,置入EP管,液氮冷凍并于-80℃下冷藏待測(cè)。
1.3.3 主要試劑及儀器 兔抗人AIM2多克隆抗體(德國(guó)Novus,貨號(hào):NBP1-87179)、兔抗人hnRNP A2/B1多克隆抗體(美國(guó)Abbkine,貨號(hào):ABP51546)、CEA定量測(cè)定試劑盒[電化學(xué)發(fā)光法,羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2014第3404885號(hào)]、免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品、全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏,Cobas e601型)。
1.3.4 檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本中的AIM2、hnRNP AB陽(yáng)性表達(dá)情況,采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)患者術(shù)前血清CEA水平,詳細(xì)步驟見表1。
表1 AIM2、hnRNP AB陽(yáng)性表達(dá)及術(shù)前血清CEA檢測(cè)方法
1.3.5 結(jié)果判讀 結(jié)果由2位高年資病理醫(yī)師雙盲法單獨(dú)閱片,于高倍光學(xué)顯微鏡鏡下(×400)隨機(jī)選擇5處視野,每處視野選取100個(gè)細(xì)胞,以陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度乘積判定AIM2、hnRNP AB陽(yáng)性表達(dá)情況,具體標(biāo)準(zhǔn)見表2。血清CEA>5.0 μg/L視為陽(yáng)性。
表2 AIM2、hnRNP AB表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Kendall相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 78例老年結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)分布 本研究共納入的78例老年結(jié)直腸癌患者的臨床病理參數(shù)分布見表3。
表3 78例老年結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)分布
2.2 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)及術(shù)前血清CEA水平 免疫組化顯示,AIM2主要分布于腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi),hnRNP AB主要分布于細(xì)胞核內(nèi);78例腫瘤組織中AIM2陽(yáng)性29例(37.18%),明顯低于癌旁組織的63例(80.77%),hnRNP AB陽(yáng)性55例(70.51%),明顯高于癌旁組織的17例(21.79%),術(shù)前CEA水平陽(yáng)性34例(43.59%),明顯高于癌旁組織的5例(6.41%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。
表4 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)及術(shù)前血清CEA水平 例(%)
2.3 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)及術(shù)前血清CEA水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)及術(shù)前血清CEA水平均與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、大體分型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)(P>0.05),而與浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)(P<0.05),見表5~7。
表5 結(jié)直腸癌組織中AIM2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)
表6 結(jié)直腸癌組織中hnRNP AB表達(dá)與與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)
表7 術(shù)前血清CEA水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)
2.4 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平相關(guān)性 Kendall相關(guān)分析顯示,結(jié)直腸癌組織中AIM2表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.211,P<0.01),而結(jié)直腸癌組織中hnRNP AB表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平呈正相關(guān)(r=0.291,P<0.01),見表8。
表8 結(jié)直腸癌組織中AIM2、hnRNP AB表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平相關(guān)性
結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿,進(jìn)展迅速,多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期,出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。早期診斷并積極干預(yù)有利于改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后。因此,尋找用于結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物成是目前臨床研究熱點(diǎn)[6]。
近年來(lái)研究顯示,多種新型生物標(biāo)志物和結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[7]。AMI2系一種分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的感受器,由C端OB結(jié)構(gòu)域及N端PYD結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,可特異性識(shí)別自身及外源性雙鏈DNA(dsDNA),并形成AIM2炎性小體,激活固有免疫應(yīng)答或細(xì)胞凋亡[8]。早期研究認(rèn)為,AMI2為腫瘤抑制因子,其過(guò)表達(dá)可抑制纖維原細(xì)胞增殖過(guò)程,從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。AIM2在肺癌、鼻咽癌、口腔鱗癌等中表達(dá)較高,在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等中表達(dá)較低,而在結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌中存在AMI2基因錯(cuò)義突變及移碼[9]。本研究結(jié)果表明,AMI2在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁正常組織明顯更低,提示AMI2低表達(dá)或缺失可能為結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展的因素之一。分析原因?yàn)閇10]:結(jié)直腸癌中存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)現(xiàn)象,MSI升高會(huì)累積突變癌基因,使得錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失,而高水平錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失會(huì)引發(fā)AIM2基因錯(cuò)義突變或移碼,從而降低其表達(dá)水平。進(jìn)一步分析AIM2表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),AIM2表達(dá)降低和性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、大體分型等無(wú)關(guān),而與腫瘤浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān),具體表現(xiàn)為浸潤(rùn)程度越深、TNM分期越晚,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中AIM2表達(dá)越低,表明AIM2表達(dá)降低增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞侵襲性,使得結(jié)直腸癌組織向更高等級(jí)發(fā)展,并改變細(xì)胞間黏附性增強(qiáng)結(jié)直腸癌組織遷移能力,因而表現(xiàn)出浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移參數(shù)差異[11]。
hnRNP AB屬于RNA結(jié)合蛋白hnRNPs家族一員,由2個(gè)RNA結(jié)合域及1個(gè)富含甘氨酸輔助域構(gòu)成,包含p37、p42兩種亞型,而此兩種亞型又因結(jié)合RNA、DNA潛能差異,在細(xì)胞中呈現(xiàn)不同功能[12]。Yao等[13]研究發(fā)現(xiàn),hnRNP AB及其亞群在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織水平,而沉默hnRNP AB基因能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲。本研究結(jié)果表明,hnRNP AB在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁正常組織明顯更高,說(shuō)明hnRNP AB可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程。進(jìn)一步分析hnRNP AB表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),hnRNP AB表達(dá)升高和性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、大體分型等無(wú)關(guān),而與腫瘤浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān),具體表現(xiàn)為浸潤(rùn)程度越深、TNM分期越晚,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中hnRNP AB表達(dá)越高,表明hnRNP AB表達(dá)升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,促進(jìn)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchy-mal transition,EMT)過(guò)程,并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,使TNM分期升高,因而表現(xiàn)出浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移參數(shù)差異[14]。
CEA為一類糖蛋白,在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等方面發(fā)揮重要作用。目前,CEA主要用于結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)、預(yù)后評(píng)估當(dāng)中。 郭萍等[15]研究表明,CEA可調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏附過(guò)程,過(guò)表達(dá)CEA會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu)并抑制組織分化。蔣曉芬等[16]研究顯示,CEA通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮促癌作用。而李世龍等[17]報(bào)道則提出,CEA通過(guò)抑制自然殺傷細(xì)胞(NK)殺傷腫瘤細(xì)胞并促進(jìn)NK細(xì)胞凋亡參與多種惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)程。本研究結(jié)果表明,癌組織術(shù)前血清CEA水平較癌旁組織明顯更高,表明CEA和結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步分析術(shù)前血清CEA水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),術(shù)前血清CEA表達(dá)升高和性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、大體分型等無(wú)關(guān),而與腫瘤浸潤(rùn)程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān),具體表現(xiàn)為浸潤(rùn)程度越深、TNM分期越晚,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的術(shù)前血清CEA水平越高。以上結(jié)果表明,當(dāng)術(shù)前血清CEA水平明顯升高時(shí),患者多處于中晚期,且伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差[18]。
此外,本研究通過(guò)Kendall相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中AIM2表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平呈負(fù)相關(guān),而結(jié)直腸癌組織中hnRNP AB表達(dá)與術(shù)前血清CEA水平呈正相關(guān),而CEA水平又為評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)之一,表明AIM2低表達(dá)、hnRNP AB高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)。
綜上所述,老年結(jié)直腸癌患者組織AIM2、hnRNP AB表達(dá)與血清CEA水平密切相關(guān),浸潤(rùn)程度越深、TNM分期越晚,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中AIM2表達(dá)降低、hnRNP AB表達(dá)升高,AIM2、hnRNP AB可能成為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。本研究局限在于樣本量較少,隨訪時(shí)間較短,且為回顧性分析,可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚,且僅探討AIM2、hnRNP AB表達(dá)血清CEA水平及臨床病理參數(shù)相關(guān)性,未探討以上指標(biāo)與預(yù)后的相關(guān)性,以上局限有待進(jìn)一步大樣本、多中心、前瞻性隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)予以完善。
利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:白巖,運(yùn)濤負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫。徐杰提出研究思路,分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核。邢國(guó)強(qiáng)負(fù)責(zé)實(shí)施研究過(guò)程,資料收集整理,論文修改。趙國(guó)剛進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,課題設(shè)計(jì)。