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        miR-518e在鼻咽癌中的表達及意義*

        2023-08-04 11:45:52黃永塔李艷艷張力行張少杰劉霞葉秋容莫祥蘭
        廣東醫(yī)學(xué) 2023年7期
        關(guān)鍵詞:鼻咽鼻咽癌生存率

        黃永塔, 李艷艷, 張力行, 張少杰, 劉霞, 葉秋容, 莫祥蘭△

        廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 1病理科, 2耳鼻咽喉頭頸科(廣西南寧 530021)

        鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜的惡性上皮源性腫瘤,其發(fā)生與EB病毒感染密切相關(guān)。鼻咽癌具有明顯的地理分布特征,在東南亞發(fā)病率較高,我國占全球新發(fā)病例近40%,尤其好發(fā)于兩廣地區(qū)。由于鼻咽癌病變位置深,病變早期缺乏明顯的臨床癥狀、體征,容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。鼻咽癌對放療敏感,早發(fā)現(xiàn)、早治療可以延長患者生存時間。腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍是鼻咽癌治療失敗的首要原因,也是導(dǎo)致鼻咽癌總體生存率較低的主要原因[1]。遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是鼻咽癌預(yù)后差的獨立因素。因此,尋找能夠準確預(yù)測鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的分子標記物,進而對鼻咽癌進行預(yù)后危險度分層,篩選出高危患者進行早期干預(yù),有利于改善患者生存質(zhì)量。莫祥蘭等[2]研究證實,鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展與EB病毒感染導(dǎo)致的microRNA(miR)表達失調(diào)密切相關(guān)。本課題組前期鼻咽癌組織miR芯片篩選及小樣本驗證發(fā)現(xiàn),miR-518e在鼻咽癌組織異常表達,表達水平呈明顯上調(diào)趨勢。為了進一步檢測鼻咽癌miR-518e表達情況,探討miR-518e的臨床病理意義,本研究旨在檢測鼻咽癌組織的miR-518e表達水平,并分析miR-518e與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后的相關(guān)性,探討miR-518e作為預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移潛能和臨床預(yù)后分子標記物的應(yīng)用價值。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 收集我院有完整臨床和病理資料的鼻咽部未分化非角化性癌60例,并收集同期鼻咽黏膜慢性炎組織15例作為對照組。納入標準:(1)術(shù)前患者檢查資料完善,有鼻咽部及頸部MRI、胸部X線/CT、腹部B超及骨掃描等相關(guān)臨床檢查資料;(2)活檢標本均在放化療之前取材,經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定24 h,石蠟包埋,HE制片;(3)組織均行免疫組織化學(xué)染色和EB病毒編碼的RNA(EBER)原位雜交檢測;(4)由兩名病理專家診斷為鼻咽部未分化非角化性癌;(5)確診后均予常規(guī)放療或放療加化療聯(lián)合治療。排除標準:臨床病理資料不完善;鼻咽部鱗狀細胞癌或腺癌;鼻咽部未分化非角化性癌復(fù)發(fā)就診者;活檢標本取材時擠壓或燒灼變性明顯。

        本研究方案獲我院倫理委員會批準(編號:倫理-KY-ZC-2020-008號)。

        1.2 方法

        1.2.1 標本采集與處理 鼻咽癌患者均在行鼻咽鏡檢查時應(yīng)用活檢鉗鉗取病變黏膜組織3塊,對照組標本為鼻咽黏膜慢性炎患者活檢組織?;顧z標本置于4%中性緩沖福爾馬林液中固定24 h,石蠟包埋,HE制片。鼻咽活檢石蠟組織行免疫組化及EBER原位雜交檢測,切片均于顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察,進行病理診斷。

        1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測 采用miRNeasy FFPE kit (217504,購自Qiagen)提取人鼻咽癌組織石蠟切片總RNA;Nanodrop2000測定RNA提取液的D260吸光度值,計算純度和濃度;使用miscript ⅡRT kit(218161,購自Qiagen)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按照試劑盒說明書進行操作。CDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃ 60 min;95℃5 min;使用SYBR Green法檢測標本組織中miR-518e表達水平,用U6基因為內(nèi)參基因。miR-518e上游引物序列為5′-AAAGCGCTTCCCTCTAGA-3′,U6上游引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,通用下游引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:正、反向引物各2 μL,cDNA模板2 μL,SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,ddH2O補至20 μL。反應(yīng)條件:(1)95℃ 15 min;(2)94℃ 15 s;(3)55℃ 30 s;(4)70℃ 34 s,(2)~(4)步驟共40個循環(huán)。

        1.2.3 RT-PCR實驗結(jié)果分析 實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后,確認擴增曲線和溶解曲線,檢測每個試驗樣本的閾循環(huán)(threshold cycle,Ct)值,閾循環(huán)值隨模板濃度增大而減少;U6 snRNA作為實驗的內(nèi)參基因;ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,ΔΔCt=ΔCt實驗組目的基因-ΔCt對照組目的基因,目的基因miR-518e相對表達量以2-ΔΔCt表示。

        1.2.4 隨訪 以電話隨訪或門診復(fù)查的方式對鼻咽癌患者進行隨訪,隨訪時間60個月,記錄患者的病情發(fā)展情況,以病死或出現(xiàn)復(fù)發(fā)、新轉(zhuǎn)移病灶為隨訪終結(jié)。生存時間按月計算。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)[M(P25,P75)]表示,組間比較采用秩和檢驗;2檢驗分析miR-518e表達強度與臨床病理參數(shù)的關(guān)系;采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-518e對鼻咽癌的診斷價值;以Kaplan-Meier生存曲線分析miR-518e對患者預(yù)后的影響,Log-rank檢驗分析兩組生存率的差異;以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 臨床病理特征 60例鼻咽癌患者,男性41(68.3%)例,女性19(31.7%)例,年齡25~81歲,中位年齡46歲,39(65%)例年齡<50歲,21(35%)例年齡≥50歲;34(56.7%)例初診時僅發(fā)現(xiàn)鼻咽部原發(fā)病灶,26(43.3%)例除了鼻咽部原發(fā)病灶外,伴有肝、肺、骨等遠處部位轉(zhuǎn)移;14(23.3%)例初診時未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,46(76.7%)例初診時伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;T分期:15(25%)例為T1~2期,45(75%)例為T3~4期;依據(jù)UICC(2010)分期標準進行臨床分期,臨床Ⅰ~Ⅱ期5(8.3%)例,Ⅲ~Ⅵ期55(91.7%)例。

        2.2 miR-518e的表達水平 對照組鼻咽黏膜組織miR-518e相對表達量為1.14(0.33,3.70),鼻咽癌組織的miR-518e相對表達量為29.95(11.51,65.66)。鼻咽癌組織miR-518e異常表達上調(diào),其表達水平是鼻咽黏膜組織26.3倍, 表達水平顯著高于鼻咽黏膜組織(Z=-5.29,P=0.000)。miR-518e的表達情況見圖1。

        圖1 miR-518e在鼻咽癌組織和對照組的表達情況

        2.3 miR-518e與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 60例鼻咽癌組織不同程度表達miR-518e,相對表達量1.04~353.05,中位數(shù)為29.95。以miR-518e相對表達量中位數(shù)為截斷值,將60例鼻咽癌組織分為高表達組和低表達組。miR-518e表達強度與鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移均呈顯著相關(guān)(2=5.96,P=0.015;2=6.79,P=0.009),而miR-518e與患者性別、年齡、T分期、臨床分期均無相關(guān)性(P>0.05)。miR-518e表達強度與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

        表1 miR-518e表達強度與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

        2.4 miR-518e對鼻咽癌的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,鼻咽癌診斷的曲線下面積為0.941(95%CI:0.885~0.997,P=0.000),敏感度為 88.35%,特異度為93.3%,提示miR-518e對鼻咽癌診斷具有一定效能。miR-518e對于鼻咽癌診斷的最佳界限值為8.40。miR-518e對鼻咽癌診斷的ROC曲線分析見圖2。

        圖2 miR-518e對鼻咽癌診斷價值的分析

        2.5 miR-518e與臨床預(yù)后的關(guān)系 以miR-518e相對表達量中位數(shù)29.95為截斷值,將鼻咽癌患者分為miR-518e高表達組和低表達組。60例鼻咽癌患者隨訪4~60個月,中位隨訪時間為26.5個月,37例在隨訪期間出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或死亡。高表達組、低表達組患者中位無進展生存期(progression-free survival,PFS)分別為11.5個月、60個月。60例鼻咽癌患者5年總體生存率為41.7%,其中miR-518e高表達組、低表達組患者5年總生存率分別為30.0%、53.3%。經(jīng)Log-rank檢驗分析,miR-518e低表達組患者5年總生存率明顯高于高表達組(2=4.26,P=0.039)。鼻咽癌患者生存曲線分析見圖3。

        圖3 miR-518e對鼻咽癌患者5年總生存率的影響

        3 討論

        鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一。鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移、臨床分期晚、缺乏治療靶點以及放化療的不良反應(yīng)等是治療效果不佳的主要因素。鼻咽癌患者的臨床預(yù)后個體差異較大,即使是臨床分期相似的患者,其生存時間仍相差較大。探索鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制,對具有轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌患者及時采取有效的干預(yù)措施,對延長鼻咽癌患者生存時間有重要意義。因此,當(dāng)務(wù)之急是篩選出有助于鼻咽癌早期診斷、提高療效、改善臨床預(yù)后的分子靶標。miRNAs作為非編碼性小分子RNA,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用,參與調(diào)控腫瘤遷移、侵襲、黏附、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)修飾等轉(zhuǎn)移相關(guān)環(huán)節(jié),極大地影響癌癥患者的臨床預(yù)后[3]。

        近年來,miRNAs作為一種新的腫瘤分子標記物,引起了人們的極大興趣[4-6]。miRNA-629在鼻咽癌細胞中表達上調(diào),通過抑制PDCD4靶基因表達,促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移[7]。miRNA-23b在鼻咽癌細胞中過度表達,減弱癌細胞間黏附力,增強腫瘤細胞遷移能力[8]。miRNA-34a通過SMAD4/TGF-β途徑逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而抑制鼻咽癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。miR-584-5p表達失調(diào)可促進鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移,與患者臨床預(yù)后密切相關(guān)[10]。miR-518e位于人類第19號常染色體,是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的miRNA,在多種疾病中表達失調(diào),與腫瘤細胞增殖、遷移及耐藥等均有關(guān)系。miR-518e在進行性核上麻痹中異常表達,參與多種細胞功能調(diào)控,增加疾病風(fēng)險[11]。Kou等[12]的研究結(jié)果揭示,miR-518e可作為早期檢測繼發(fā)性伊馬替尼耐藥GIST的無創(chuàng)性生物標記物。miR-518e在多達50%肝細胞癌組織中持續(xù)性異常表達上調(diào),其表達水平較癌旁肝組織上調(diào)約4 096倍[13-14]。Wei等[15]報道,miR-518e在膀胱尿路上皮癌中表達顯著上調(diào),可能與Wnt通路、胰島素/IGF、PI3K和FGF等信號途徑異常激活有關(guān)。

        目前,中英文文獻均未檢索到關(guān)于miR-518e在鼻咽癌表達的研究報道。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-518e在鼻咽癌組織呈過表達趨勢。為了進一步驗證miR-518e在鼻咽癌組織的表達情況,分析miR-518e與臨床病理特征、患者預(yù)后的關(guān)系,我們率先檢測鼻咽癌組織的miR-518e表達水平。我們的研究結(jié)果證實,miR-518e在鼻咽癌組織中表達失調(diào),表達水平顯著上調(diào),其表達強度是對照組鼻咽黏膜組織26.3倍。不良飲食習(xí)慣、環(huán)境因素和遺傳易感性等是鼻咽癌發(fā)生的潛在危險因素,鼻咽癌miRNA表達失調(diào)與EB病毒感染、多種癌基因和抑癌基因異常狀態(tài)均有關(guān)系。因此,我們推測miR-518e在細胞生物學(xué)方面扮演癌基因的角色,可能是鼻咽癌發(fā)生中的早期分子生物學(xué)異常事件之一。我們的研究表明,鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織的miR-518e表達強度較非轉(zhuǎn)移組均有顯著上調(diào),揭示miR-518e不僅在鼻咽癌發(fā)生時起到重要作用,也在增強癌細胞的侵襲和遷移能力等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,與鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ROC曲線分析顯示,miR-518e對鼻咽癌診斷的曲線下面積為0.941,診斷敏感度、特異度分別為88.35%、93.3%,提示miR-518e是臨床診斷鼻咽癌較好的分子生物學(xué)指標。因此,作為具有癌基因功能的miRNAs之一,miR-518e與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移狀態(tài)及脈管侵犯等臨床病理特征一樣,可作為鼻咽癌臨床診斷及轉(zhuǎn)移風(fēng)險評估的分子標記物。

        miR-518e異常表達上調(diào)也能夠影響鼻咽癌患者的臨床預(yù)后。miR-518e高表達組和低表達組患者中位PFS分別為11.5、60個月,低表達組患者5年總生存率顯著高于高表達組(53.3%vs.30.0%)。miR-518e高表達組患者中位PFS短,5年總生存率相對較低,可能是由于miR-518e過表達更易于促進鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移所致。通過檢測鼻咽癌組織miR-518e表達情況,進而對患者進行預(yù)后危險度分層,篩選出高?;颊哌M行早期干預(yù),有望進一步延長鼻咽癌患者生存時間。因此,miR-518e作為鼻咽癌患者潛在的臨床預(yù)后評估因子值得關(guān)注。

        綜上所述,miR-518e表達失調(diào)可以促進鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展,與鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而,因本實驗獲取的樣本量有限,尤其是我們研究對象中臨床早期鼻咽癌病例較少,故miR-518e在鼻咽癌的臨床病理意義有待進一步擴大樣本量進行驗證。隨著對miR-518e生物學(xué)功能及作用機制的深入研究,miR-518e有望成為預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后的分子標記物。

        利益相關(guān)聲明:所有作者聲明不存在任何利益沖突。

        作者貢獻說明:黃永塔負責(zé)研究項目選題和實驗設(shè)計,負責(zé)論文撰寫、修訂;李艷艷參與病理資料的收集、整理,負責(zé)實驗實施;張力行參與臨床和病理資料匯總,采集實驗數(shù)據(jù);張少杰負責(zé)標本采集、臨床資料收集;劉霞參與課題設(shè)計、病理診斷;葉秋容負責(zé)實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析;莫祥蘭參與課題研究方案設(shè)計,審核實驗結(jié)果。

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