趙慧巧，李桐銅，聶 旋，張永鵬，靳國(guó)印，盧年華

（河北北方學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075132）

濕生扁蕾為龍膽科扁蕾屬濕生扁蕾Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma的一年生干燥全草，具有清熱利濕，解毒之功效，主要用于感冒發(fā)熱、肝炎、膽囊炎、腸胃炎、小兒腹瀉等，是臨床常用藏醫(yī)藥之一[1]。關(guān)于濕生扁蕾的品質(zhì)研究多見(jiàn)于西北地區(qū)產(chǎn)地研究[2-3]，對(duì)河北地區(qū)濕生扁蕾的品質(zhì)研究鮮有報(bào)道。濕生扁蕾主要化學(xué)成分包括黃酮類成分、口山酮類、三萜類、有機(jī)酸類等[4]。其中，黃酮類成分具有多方面生理活性，常作為濕生扁蕾藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析研究[1]。而木犀草素作為濕生扁蕾中黃酮類成分之一，已被證實(shí)具有抗腹瀉、抗氧化、抗炎等多種生物活性[5]。

綜上，文章以木犀草素及總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)河北省張家口地區(qū)濕生扁蕾不同藥用部位、采收期和貯存條件進(jìn)行研究，以期為張家口地區(qū)野生藥材的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)：722s，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)：RE-52AA，上海亞榮生化儀器公司）；分析天平（型號(hào)：BS224S，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 材料

濕生扁蕾采自河北省張家口市，經(jīng)河北北方學(xué)院鑒定為龍膽科扁蕾屬濕生扁蕾Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma，樣品經(jīng)凈制干燥后，粉碎過(guò)40目篩，備用，見(jiàn)表1。木犀草素對(duì)照品（批號(hào)：191120，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：DSTDL001601，成都徳思特生物技術(shù)有限公司）；乙醇（批號(hào)：20210102，山東安捷高科消毒科技有限公司）；甲醇（批號(hào)：20170208，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；甲酸（批號(hào)：20180208，天津市化學(xué)試劑一廠）；乙酸乙酯（批號(hào)：20180228，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；亞硝酸鈉（批號(hào)20180108，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；硝酸銀（批號(hào)：20200507，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號(hào)：20210213，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水氯化鋁（批號(hào)：20190210，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；薄層硅膠板（批號(hào)：20210729，煙臺(tái)華陽(yáng)新材料科技有限公司煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；定量點(diǎn)樣毛細(xì)管。

表1 不同批次濕生扁蕾樣品及編號(hào)

2 方法

2.1 供試品溶液制備

稱取各組濕生扁蕾樣品10 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇浸泡藥材0.5 h，回流提取1.5 h，過(guò)濾，濾渣加8倍量70%乙醇提取1.5 h，過(guò)濾，合并2次濾液，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收乙醇，濃縮提取液得干浸膏，計(jì)算干浸膏率。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的木犀草素對(duì)照品2.000mg，加75%甲醇溶解并定容至2 mL容量瓶中，制成1mg/mL木犀草素的對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液。精密量取對(duì)照品溶液分別稀釋成5 μg/mL（簡(jiǎn)稱M1）和100 μg/mL（簡(jiǎn)稱M2）的木犀草素對(duì)照品溶液。

精密量取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.000 mg，加75%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 薄層色譜法檢測(cè)濕生扁蕾中木犀草素

精密稱取“2.1項(xiàng)下”各組濕生扁蕾干浸膏用75%甲醇配置成相當(dāng)于原藥材0.1 g/mL的樣品溶液，分別標(biāo)記為J1、J2、J3、J4、J5、G1、G2和G3。取各組濕生扁蕾樣品溶液和木犀草素對(duì)照品溶液M1和M2各10 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板，以甲酸-甲醇-乙酸乙酯-甲苯（0.7：1：6：10）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外燈254 nm下檢視，觀察樣品溶液與木犀草素對(duì)照品在相同位置出現(xiàn)斑點(diǎn)的顏色及大小。

2.4 可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)濕生扁蕾中總黃酮含量

2.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取“2.2項(xiàng)下”蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL與6 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加75%甲醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照品溶液，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程：y=0.012 3x-0.009 7（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5），見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 總黃酮含量測(cè)定

精密稱取“2.1項(xiàng)下”各組濕生扁蕾干浸膏用75%甲醇配置成相當(dāng)于原藥材0.1 g/mL的樣品溶液，分別標(biāo)記為J1、J2、J3、J4、J5、G1、G2和G3。精密量取0.6 mL，置25 mL容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自加75%甲醇至6 mL起，依法測(cè)定吸光度，利用蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濕生扁蕾樣品中總黃酮含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 篩選濕生扁蕾最佳藥用部位

20210827、20210912、20210925批次采收濕生扁蕾藥材為樣品，分別對(duì)其莖葉部位、根部開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，比較3批次濕生扁蕾樣品木犀草素含量均為莖葉部位＞根部；由表2可知，3批次濕生扁蕾總黃酮含量均為莖葉部位＞根部，干浸膏率為莖葉部位＞根部，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，濕生扁蕾最佳藥用部位為莖葉部位。

圖2 不同藥用部位濕生扁蕾木犀草素的薄層色譜圖

表2 不同藥用部位濕生扁蕾總黃酮含量和浸膏率（n=3）

3.2 篩選濕生扁蕾最佳采收期和貯存條件

取不同采收期、貯存條件下濕生扁蕾莖葉部位樣品開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，定性比較各組樣品中木犀草素含量，只有自然條件下貯存1年（J5）樣品中木犀草素含量顯著減少，其他各組木犀草素含量差異不大。

圖3 不同采收期、貯存條件濕生扁蕾莖葉部位薄層色譜圖

由表3可知，不同采收期樣品濕生扁蕾莖葉部分總黃酮含量和浸膏率存在顯著差異，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20210912批次樣品（J2）中總黃酮含量最高，20210827批次樣品（J1）中浸膏得率最高。由表4可知，不同貯存條件濕生扁蕾莖葉樣品總黃酮含量和浸膏率存在顯著差異，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)年樣品（J2）中總黃酮含量最高，陰涼干燥貯存1年樣品（J4）中浸膏得率最高。

表3 不同采收期濕生扁蕾中總黃酮含量和浸膏率（n=3）

表4 不同貯存條件下濕生扁蕾中總黃酮含量和浸膏率（n=3）

4 討論

可見(jiàn)分光光度法對(duì)供試液的穩(wěn)定性、儀器的精密度和測(cè)定方法的重復(fù)性，測(cè)定方法的準(zhǔn)確性分別進(jìn)行了考察，結(jié)果符合相關(guān)要求。文章分別采用薄層色譜法、可見(jiàn)分光光度法研究發(fā)現(xiàn)濕生扁蕾莖葉部位木犀草素含量、總黃酮含量均顯著高于根部，浸膏率亦得到了一致結(jié)論。因此，依據(jù)黃酮類成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，濕生扁蕾的最佳入藥部位應(yīng)為莖葉。在《中華本草》中濕生扁蕾以全株入藥，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)這種說(shuō)法可能欠妥。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)黃酮類成分開(kāi)展研究，對(duì)其他類成分是否也是莖葉部分更佳尚未考察。實(shí)驗(yàn)表明，8月底至9月底采收濕生扁蕾對(duì)木犀草素含量影響不大，但是總黃酮含量以9月中旬采收樣品含量最高，考慮到濕生扁蕾種子成活率很低，野生品采收期應(yīng)兼顧種子成熟及藥材產(chǎn)量，本研究初步擬定9月中下旬為最佳采收期。貯存條件對(duì)濕生扁蕾中黃酮類成分具有顯著影響，陰涼干燥處貯存顯著優(yōu)于自然環(huán)境貯存，且陰涼干燥處貯存1年與當(dāng)年樣品比較，木犀草素含量差異不大，總黃酮含量略有降低，濕生扁蕾最佳貯存條件應(yīng)為陰涼干燥處。綜上，濕生扁蕾應(yīng)以莖葉部位入藥，9月中下旬采收并置于陰涼干燥處保存。

采收期、藥用部位、貯存是影響植物類藥材的關(guān)鍵因素，對(duì)其進(jìn)行充分的研究有助于科學(xué)制定藥材采收和貯存方法[6]。對(duì)張家口地區(qū)野生藥材濕生扁蕾開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，為濕生扁蕾藥材的采、貯條件設(shè)定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)濕生扁蕾藥材的開(kāi)發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。