沈 怡，馬 萍，董邦健，彭崇勝，李曉波

四君子湯非多糖功效組分的體外人源腸、肝微粒體代謝研究

沈 怡，馬 萍，董邦健，彭崇勝，李曉波*

上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240

對四君子湯非多糖組分的主要活性成分進(jìn)行人源腸、肝微粒體中的代謝過程研究，明確其在腸、肝中的代謝輪廓及代謝差異，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)證據(jù)。應(yīng)用Acquity UPLC I-class/VION IMS QTOF技術(shù)分析四君子湯非多糖組分中主要活性成分（異甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷CK、白術(shù)內(nèi)酯III）在人源腸、肝微粒體孵育體系下的代謝產(chǎn)物以及代謝轉(zhuǎn)化途徑。甘草酸、甘草次酸在人源腸、肝微粒體中均以I相代謝為主；而甘草素、異甘草苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷CK則以腸II相代謝為主。白術(shù)內(nèi)酯III在腸、肝微粒體中代謝均不顯著，而四君子湯非多糖功效組分中其他化合物在腸微粒體中代謝速度均比在肝微粒體中更快。此外，甘草皂苷、人參皂苷主要進(jìn)行脫糖基反應(yīng)；異甘草苷以脫糖、羥基化等反應(yīng)為主；甘草素則以葡萄糖醛酸結(jié)合為主；白術(shù)內(nèi)酯III則主要發(fā)生水解、羥基化反應(yīng)。闡明了四君子湯非多糖組分中主要活性成分在人體腸道及肝臟中的代謝輪廓及代謝差異，為后續(xù)進(jìn)行四君子湯非多糖功效組分的藥效研究提供了數(shù)據(jù)支持，也為中藥復(fù)方的功效組分研究提供了思路和策略。

四君子湯；人源腸微粒體；人源肝微粒體；體外代謝；異甘草苷；甘草素；甘草酸；甘草次酸；人參皂苷Rb1；人參皂苷CK；白術(shù)內(nèi)酯III

四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，為中醫(yī)臨床治療脾虛證的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，四君子湯主要具有胃腸道調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)作用，包括改善胃腸運動、降低胃腸道炎癥及調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等[1]。課題組前期研究表明，四君子湯中的多糖和非多糖組分均是改善脾虛證的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中多糖活性組分S-3通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成及短鏈脂肪酸含量從而增強(qiáng)腸道免疫功能[2]，非多糖組分則顯著改善脾虛證大鼠的免疫低下、激素分泌異常及腸道菌群紊亂現(xiàn)象[3]。四君子湯非多糖組分化學(xué)組成復(fù)雜，主要包括黃酮、皂苷、萜類等成分，前期已定性鑒定了449個化合物，并定量分析了19個主要成分[4]。藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[5]人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd等在體內(nèi)保留時間較長，可能經(jīng)過多重代謝；而甘草素等黃酮苷元類成分具有明顯的肝腸循環(huán)，提示其在腸、肝中可能發(fā)生差異代謝；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及藥效學(xué)實驗證明甘草素、甘草次酸、異甘草苷、人參皂苷CK、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II能通過調(diào)節(jié)局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路發(fā)揮顯著的腸上皮修復(fù)作用；其中，具有顯著生物活性的人參皂苷CK為人參皂苷Rb1的代謝產(chǎn)物，甘草次酸為甘草酸的代謝產(chǎn)物，白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II和白術(shù)內(nèi)酯III發(fā)生相互轉(zhuǎn)換[4-5]。因此推測甘草酸、甘草次酸、異甘草苷、甘草素、人參皂苷Rb1、人參皂苷CK、白術(shù)內(nèi)酯III可能為四君子湯非多糖組分針對脾虛證引起的“納少、神失”起主要治療作用的功效物質(zhì)。但其在腸、肝中具體代謝過程及差異研究尚不完善。本研究對上述7個活性成分（異甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷CK、白術(shù)內(nèi)酯III）進(jìn)行人源腸微粒體（human intestine microsomes，HIM）、人源肝微粒體（human liver microsomes，HLM）中的I相和II相代謝研究，闡明其在HIM、HLM中的代謝輪廓以及二者的代謝差異，為臨床四君子湯治療脾虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

異甘草苷對照品（批號wkq17051906）購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品甘草素（批號DSTDG001001）、甘草酸（批號DST210620-006）、甘草次酸（批號DST180314-007）、人參皂苷Rb1（批號DSTDR000601）、白術(shù)內(nèi)酯III（批號DSTDB001601）、人參皂苷CK（批號DSTDR003001）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，上述對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸（3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-amm-onio]-1-propane sulfonate，CHAPS，批號HY-15435）購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽水合物（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrate，NADP，批號SLCG0842）、葡萄糖-6-磷酸鈉脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P-DH，批號SLCK2790）購自美國Sigma-Aldrich公司；六水合氯化鎂（批號20200509）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（uridine 5′-diphospho-glucuronic acid trisodium salt，UDPGA，批號C12209586）、-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽（-glucose-6-phosphate sodium salt，G-6-P，批號C12766997）均購自上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（批號GP21040152242）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；色譜級甲醇（批號203398）購自美國Fisher Chemical；HIM（批號1610314）、HLM（批號2010065）購自Xeno Tech有限責(zé)任公司（美國）。

1.2 儀器

Acquity I-class超高效液相-VION離子淌度四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；5417R型低溫高速離心機(jī)、恒溫震蕩器（德國Eppendorf公司）；G-560E型渦旋儀（美國BOHEMIA公司）；SPD2010型真空離心濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 樣品儲備液配制

取G-6-P-DH、NADP、G-6-P、UDPGA、CHAPS適量，并用100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）溶解，分別制備濃度為100 mmol/L、75 mmol/L、50 U/mL、42 mmol/L、62.5 mmol/L的儲備液；取六水合氯化鎂適量，用超純水溶解后制備得到濃度為833 mmol/L的儲備液；取對照品異甘草苷、甘草素、甘草酸、甘草次酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷CK、白術(shù)內(nèi)酯III適量，以70%甲醇溶解制備得到混合儲備液（ECS），其中甘草次酸濃度為1 mmol/L、白術(shù)內(nèi)酯III濃度為2 mmol/L，其他化合物濃度均為1.25 mmol/L。

2.2 I相代謝孵育體系配制

向1.5 mL離心管中分別加入100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）190 μL、HIM或HLM儲備液20 μL、NADP儲備液5 μL、G-6-P儲備液10 μL、六水合氯化鎂儲備液3 μL、供試品儲備液2 μL，將離心管放入恒溫振蕩器內(nèi)（37 ℃、300 r/min）預(yù)孵育5 min，再加入G-6-P-DH儲備液20 μL，形成I相反應(yīng)體系共250 μL。以空白溶劑作為陰性對照。樣品分別孵育0、15、30、60、90、120 min。其中反應(yīng)體積中有機(jī)相甲醇（由供試品儲備液引入）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1%。加入1 mL正丁醇（水飽和）并置于冰中終止反應(yīng)，再將樣品渦旋1 min后，4 ℃、14 000 r/min離心20 min；吸取上清液在真空離心機(jī)中濃縮揮干，以甲醇-水溶液（70∶30）80 μL復(fù)溶，復(fù)溶液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液7 μL進(jìn)樣分析。

2.3 II相代謝孵育體系配制

向1.5 mL離心管中依次加入100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）165 μL、HIM或HLM儲備液20 μL、NADP儲備液5 μL、G-6-P儲備液10 μL、氯化鎂儲備液3 μL、供試品儲備液2 μL、G-6-P-DH儲備液20 μL，形成250 μL的I相反應(yīng)體系從而啟動I相代謝反應(yīng)，將其置于恒溫振蕩器中，于37 ℃、300 r/min振蕩孵育20 min。再加入CHAPS儲備液5 μL，置于恒溫振蕩器中37 ℃、300 r/min振蕩預(yù)孵育10 min。最后加入UDPGA儲備液20 μL，于37 ℃、300 r/min振蕩孵育0、60、90、120 min。以空白溶劑作為陰性對照。其中反應(yīng)體積中有機(jī)相甲醇（由供試品儲備液引入）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1%。加入1 mL正丁醇（水飽和）并置于冰中終止反應(yīng)，再將樣品渦旋1 min后，4 ℃、14 000 r/min離心20 min；吸取上清液在真空離心機(jī)中濃縮揮干，以甲醇-水溶液（70∶30）80 μL復(fù)溶，復(fù)溶液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液7 μL進(jìn)樣分析。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

2.4.1 色譜條件 Waters BEH C18UPLC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），洗針液90%乙腈水溶液；梯度洗脫：0～3 min，5%～20% B；3～12 min，20%～100% B；12～19 min，100%～95% B；進(jìn)樣體積7 μL；柱溫45 ℃；體積流量0.4 mL/min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用MSE（低能量/高能量切換掃描）的采集模式；離子源為電噴霧正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；霧化氣溫度450 ℃；霧化氣體積流量900 L/h；錐孔反吹氣體積流量50 L/h；離子源溫度115 ℃；掃描范圍/50～1500；掃描速度0.2 s；采集間隔0.5 s；采集時間0.5 s；碰撞能量6 eV。

2.5 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采集的所有質(zhì)譜信息利用UNIFI軟件（美國Waters公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過文獻(xiàn)以及Chemspider等數(shù)據(jù)庫檢索ECS中所有原型成分及可能存在的代謝產(chǎn)物，建立ECS代謝產(chǎn)物庫（包含化合物名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量及化學(xué)結(jié)構(gòu)），將數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入UNIFI軟件并與質(zhì)譜信息比對。

將ECS中各化合物在腸、肝微粒體體系下孵育不同時間后的含量（峰面積）變化，以不同時間點各化合物含量（峰面積）/各化合物初始濃度即剩余底物濃度百分比對孵育時間作圖，得I、II相代謝消除曲線。

3 結(jié)果

3.1 ECS在HLM體系中相對含量隨時間的變化

ECS儲備液（甘草次酸終濃度為8 μmol/L、白術(shù)內(nèi)酯III終濃度為16 μmol/L，其余化合物均為10 μmol/L）經(jīng)HLMI、II相體系孵育后，空白對照、混合對照品以及不同孵育時間下ECS的總離子流見圖1。結(jié)果顯示，混合對照品中各單體化合物分離明顯且分離度良好，說明該色譜質(zhì)譜條件較為合適，可用于后續(xù)樣品檢測。

3.1.1 ECS在HLM I相孵育體系下各成分相對含量的變化 ECS中各化合物在肝微粒體下I相體系中孵育120 min的代謝消除曲線如圖2所示。人參皂苷Rb1在0～120 min內(nèi)含量持續(xù)下降，終濃度僅為初始濃度的15.99%，提示其在肝中發(fā)生顯著的I相代謝消除，生成多種I相代謝產(chǎn)物[6]；而人參皂苷CK在孵育時間段內(nèi)呈現(xiàn)出“降低-升高-降低”的變化趨勢，這提示可能存在人參皂苷CK作為中間代謝產(chǎn)物的復(fù)雜生物轉(zhuǎn)化[7]。人參皂苷CK孵育90 min后相較于30 min，相對含量增加了2.33%，推測人參皂苷CK可能由人參皂苷Rb1脫糖基轉(zhuǎn)化而來。甘草酸在0～120 min內(nèi)相對含量呈下降趨勢，且其在0～30 min內(nèi)變化較快，30 min時相對含量相較于初始濃度減少46.8%，而后在30～120 min內(nèi)含量變化幅度較小，提示其進(jìn)入肝臟后迅速發(fā)生I相代謝，而甘草次酸在30～60 min內(nèi)相對含量增加，并在孵育60 min后相較于30 min含量增加5.88%，這可能源于甘草酸在I相體系中代謝生成。異甘草苷在0～120 min內(nèi)表現(xiàn)出緩慢的下降趨勢，而甘草素整體波動不大，但甘草素在15～90 min內(nèi)相對含量略有上升，推測異甘草苷在15～60 min內(nèi)可能水解、異構(gòu)化后生成甘草素[8]。

逆城市化作為一種趨勢并沒有嚴(yán)格意義上的好壞之分，與之相隨的既有機(jī)遇也有挑戰(zhàn)。逆城市化是城市化進(jìn)程的必然結(jié)果，任何區(qū)域都需要一個人口閾值來規(guī)劃區(qū)域發(fā)展。只要沒有大幅超過或者低于這個閾值，人口的微小變化不會對區(qū)域發(fā)展規(guī)劃和空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生太大影響，但是一旦出現(xiàn)大規(guī)?；蛲蝗坏淖兓赡軙蛉司謸?dān)的市政設(shè)施和公共服務(wù)成本太高或者市政設(shè)施和公共服務(wù)規(guī)模無法滿足現(xiàn)有需要而導(dǎo)致城市崩潰。

1-異甘草苷 2-甘草素 3-人參皂苷Rb1 4-甘草酸 5-白術(shù)內(nèi)酯III 6-人參皂苷CK 7-甘草次酸，圖4同

圖2 ECS孵育后在HLM中的I相代謝消除曲線

人參皂苷、甘草皂苷類成分在體內(nèi)代謝率較大且發(fā)生初始反應(yīng)時間較短，而甘草中的黃酮類成分代謝周期較長，其中皂苷類成分大部分需經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化后再吸收入血發(fā)揮藥效作用[9]。

3.1.2 ECS在HLM II相孵育體系下各成分相對含量的變化 ECS中各化合物在肝微粒體II相體系中孵育后的代謝消除曲線如圖3所示。人參皂苷Rb1在0～120 min內(nèi)相對含量明顯減少，終濃度為初始濃度的58.91%，提示其在肝中繼續(xù)進(jìn)行II相結(jié)合，而人參皂苷CK在HLM II相體系下含量變化較小，推測是因為人參皂苷CK作為次生代謝產(chǎn)物在體內(nèi)直接被吸收利用，較少發(fā)生II相結(jié)合[10]。甘草酸在0～120 min內(nèi)相對含量持續(xù)降低；甘草酸在0～120 min也呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，尤其是在60～120 min內(nèi)，其在孵育120 min后相對含量減少了34.30%（相較于60 min），提示甘草酸進(jìn)入體內(nèi)后先經(jīng)I相代謝后進(jìn)行II相結(jié)合；而甘草次酸在孵育全過程中代謝幅度不大，推測甘草次酸可能以I相代謝為主，或可能與其作為甘草酸的代謝產(chǎn)物有關(guān)。異甘草苷及甘草素的相對含量均呈現(xiàn)降低趨勢，前者終濃度為初始濃度的83.73%，后者終濃度為初始濃度的73.04%，提示甘草素可能較依賴II相代謝[11]。

圖3 ECS孵育后在HLM中的II相代謝消除曲線

綜上，ECS中各化合物在HLMI相和II相孵育體系中的含量變化結(jié)果顯示，甘草酸及甘草次酸在I相體系下代謝消除更為顯著，尤其是甘草酸在HLM I相體系孵育120 min時剩余底物濃度為初始濃度的47.87%，而其在II相體系相同時間剩余底物濃度為初始濃度的65.19%。人參皂苷Rb1和人參皂苷CK在I相和II相體系下表現(xiàn)出一定差異，孵育120 min后，人參皂苷Rb1在I相孵育下終濃度僅為初始濃度的15.99%而在II相體系下終濃度卻為初始濃度的58.91%，提示其可能較為依賴I相代謝。異甘草苷在HLM I相體系下消除更為明顯，提示其作為黃酮苷主要以I相代謝為主；甘草素則在HLM II相體系下代謝更為顯著，最大消除量出現(xiàn)在120 min時為26.96%，而甘草素在I相體系下其最大消除量為16.94%，提示甘草素在體內(nèi)可能以II相代謝為主[11]。白術(shù)內(nèi)酯III在I相及II相體系下含量變化幅度較小，提示其經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)絕大部分以原型吸收[12]。提示四君子湯經(jīng)肝臟代謝時，甘草皂苷、人參皂苷類成分可能以I相代謝為主，而甘草黃酮類成分以II相代謝為主。

3.2 ECS在HIM體系中不同孵育時間點下相對含量的變化

將ECS（甘草次酸終濃度為8 μmol/L、白術(shù)內(nèi)酯III終濃度為16 μmol/L，其余化合物均為10 μmol/L）儲備液經(jīng)腸微粒體I、II相代謝孵育后，空白對照、混合對照品以及待測樣品在不同孵育時間下的總基峰色譜圖見圖4。結(jié)果顯示，混合對照品中各單體化合物分離明顯且分離度良好，說明該色譜質(zhì)譜條件較為合適，可用于后續(xù)樣品檢測。

3.2.1 ECS在HIM I相孵育體系下各成分相對含量的變化 ECS中各化合物在HIM I相體系中孵育120 min后的代謝消除曲線如圖5所示。甘草酸在HIM I相孵育120 min內(nèi)相對含量持續(xù)下降，終濃度僅為初始濃度的11.21%，而甘草次酸在孵育90 min后相對含量相較于初始濃度減少13.04%，而在孵育120 min后其相對含量相較于90 min增加8.59%，其微弱的變化可能與甘草酸水解生成甘草次酸有關(guān)。異甘草苷在0～120 min內(nèi)的相對含量持續(xù)降低，至120 min時相對含量比初始濃度減少了69.68%，說明其代謝周期較長，而在此過程中異甘草苷則生成多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物或許能夠直接對機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的藥效作用[13-14]。而甘草素在HIM I相孵育體系中的整體代謝幅度較?。ㄗ畲笙繛?0.37%）。就人參皂苷類成分而言，人參皂苷Rb1在孵育30 min后相對含量較其初始濃度減少了42.27%，同時人參皂苷CK在孵育30 min后相對含量相較于15 min增加4.15%，推測可能是因為人參皂苷Rb1在此時脫糖基生成人參皂苷CK。上述結(jié)果表明，甘草皂苷類成分在腸微粒體中I相反應(yīng)速度較快，而黃酮類成分代謝周期則相對較長。

圖4 ECS在HIM I(A)、Ⅱ (B)相體系下經(jīng)不同時間點孵育下總基峰色譜圖

圖5 ECS孵育后在HIM中的I相代謝消除曲線

3.2.2 ECS在HIM II相孵育體系下各成分相對含量的變化 ECS中各化合物經(jīng)HIM II相體系孵育后的代謝消除曲線如圖6所示。人參皂苷Rb1在孵育120 min時僅余初始濃度的24.07%，說明其可能在腸道中繼續(xù)發(fā)生II相代謝，而人參皂苷CK在HIM II相體系下變化不大，提示人參皂苷CK可能直接被機(jī)體吸收并發(fā)揮藥效作用[15]。異甘草苷孵育至120 min時僅余初始濃度的25.55%，而甘草素的相對含量在孵育時間內(nèi)持續(xù)降低至原始濃度的39.32%，提示甘草素可能以II相代謝為主。甘草酸在0～120 min內(nèi)相對含量持續(xù)下降且其在90～120 min內(nèi)下降速度更快，提示甘草酸在體內(nèi)由I相至II相代謝；而甘草次酸在孵育120 min內(nèi)含量變化不大，與其本身在體內(nèi)吸收利用度較高相符[16]。

圖6 各化合物在HIM中的II相代謝消除曲線

比較ECS中各化合物在HIM I相和II相孵育體系中的代謝趨勢，以揭示其在不同代謝階段中的代謝差異。結(jié)果顯示，甘草酸在I、II相體系下均呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，但其在I相中的轉(zhuǎn)變時間早于II相，推測其在體內(nèi)可能由I相至II相代謝；而甘草次酸在體內(nèi)能夠直接被吸收利用，結(jié)果也表明它在I、II相中相對含量幅度波動較小。人參皂苷Rb1在HIM II相中相對含量呈現(xiàn)較為明顯的變化，尤其孵育60 min后Rb1大量消除，提示其在腸道中以II相代謝轉(zhuǎn)化為主；而人參皂苷CK在HIM體系下相對含量變化較小，據(jù)研究，人參皂苷CK能夠直接對人體產(chǎn)生相應(yīng)的藥效作用[17]。異甘草苷在HIM I、II相孵育體系下均表現(xiàn)出持續(xù)性的代謝消除（I相120 min最大消除率為69.68%，II相120 min最大消除率為74.45%）；而甘草素則主要以HIM中的II相代謝消除為主（I相中最大消除量為20.37%，II相為60.68%）。綜上，在HIM中甘草酸先進(jìn)行I相代謝后再進(jìn)行II相代謝而甘草次酸作為其I相產(chǎn)物，在體內(nèi)能夠被大量吸收利用并發(fā)揮藥效作用。與之相反的是，人參皂苷Rb1、甘草素在HIM II相孵育下均表現(xiàn)出更為顯著的消除趨勢。

3.3 ECS經(jīng)HIM、HLM孵育后相對含量變化的比較

進(jìn)一步分析ECS中各化合物在HIM、HLM I、II相體系下的代謝差異。如圖7所示，ECS經(jīng)HIM、HLM I相孵育后，其組成成分中人參皂苷Rb1在HIM、HLM I相體系下均于0～30 min內(nèi)快速發(fā)生代謝消除（30 min相較于初始濃度分別減少了42.27%、30.00%），其后代謝趨為平緩；而其代謝產(chǎn)物人參皂苷CK在HIM、HLM I相體系下變化有所不同，它在HIM中15～30 min相對含量增加，并在HLM中30～90 min呈現(xiàn)出相對含量增加的趨勢，提示人參皂苷CK經(jīng)口服到達(dá)腸道后先在腸道發(fā)生I相代謝后經(jīng)腸肝循環(huán)繼續(xù)進(jìn)入肝臟代謝[18]。ECS中的甘草酸在HIM I相體系下發(fā)生顯著代謝，而其在肝微粒體中I相代謝主要發(fā)生在0～30 min，表明其主要在腸道中發(fā)生相關(guān)代謝[19]；其水解產(chǎn)物甘草次酸在HIM、HLM I相體系中的變化卻不顯著。異甘草苷的相對含量在HIM、HLM I相孵育體系中均呈降低趨勢，但它在HIM中的最大消除量（初始濃度的69.68%）尤為顯著，說明它I相孵育時以腸道代謝為主；而其代謝產(chǎn)物甘草素在腸、肝微粒體中僅發(fā)生少量代謝，提示甘草素可能以II相代謝為主。

圖7 ECS中各化合物在HIM、HLMI相體系下相對含量變化

如圖8所示，ECS經(jīng)HIM、HLM II相孵育后，人參皂苷Rb1在HIM體系下相對含量變化更為顯著，120 min時剩余底物濃度僅為初始濃度的24.07%，而其在HLM體系下終濃度為初始濃度的58.91%，提示其在腸道中更容易發(fā)生II相代謝；而其代謝產(chǎn)物人參皂苷CK在HIM、HLM II相體系下波動不大。異甘草苷和甘草素在HIM、HLM II相體系下孵育120 min內(nèi)均呈現(xiàn)持續(xù)性消除現(xiàn)象，而二者均于HIM體系中代謝消除更為顯著（異甘草苷在HLM、HIM體系最大消除量均出現(xiàn)在120 min，分別為16.27%、74.45%；甘草素在HLM、HIM體系下最大消除量同樣出現(xiàn)在120 min時，分別為26.96%、60.68%），這與文獻(xiàn)中異甘草苷及甘草素可能以腸微粒體中II相結(jié)合為主的結(jié)果一致[20]。相較于HLM體系，甘草酸在HIM II相體系下代謝更為顯著。推測其經(jīng)口服后大部分在腸道內(nèi)發(fā)生代謝，小部分入血后在肝臟中進(jìn)行II相反應(yīng)；而甘草次酸變化幅度較小。

圖8 ECS中各化合物在HIM、HLM Ⅱ相體系下相對含量變化

綜上，HIM、HLM I相孵育體系下，甘草酸、人參皂苷Rb1、異甘草苷均以腸道代謝為主；而人參皂苷CK、甘草次酸、甘草素在I相體系中代謝不明顯。HIM、HLM II相孵育體系下，甘草皂苷、人參皂苷類、甘草黃酮類成分主要以HIM中II相代謝為主，而白術(shù)內(nèi)酯III在HIM、HLM中相對含量波動幅度較小。由此提示，四君子湯經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)，原型皂苷、黃酮類成分先經(jīng)腸道代謝，后經(jīng)肝腸循環(huán)進(jìn)入肝臟代謝；極性大、相對分子質(zhì)量小的內(nèi)酯類成分可直接進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮作用；而代謝產(chǎn)物受原型成分代謝轉(zhuǎn)換的影響，消除量低、消除時間長，提示它們可能是體內(nèi)延長功效的主要活性物質(zhì)。

3.4 ECS中各化合物在HIM、HLM體系中的I、II相代謝產(chǎn)物及其代謝途徑

ECS分別經(jīng)HIM、HLM孵育后，共檢測到35個原型及代謝產(chǎn)物，其中分別在腸微粒體中檢測到30個（原型成分7個、代謝成分23個）、肝微粒體中檢測到32個（原型成分7個、代謝成分25個），二者共有成分27個。I相體系下主要發(fā)生氧化、脫氫、水解反應(yīng)，II相體系下發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合，與前人研究相符合[21-23]。ECS在HIM、HLM I、II相體系孵育下的代謝產(chǎn)物及碎片離子見表1。

表1 ECS中各化合物在HIM、HLM體系內(nèi)的代謝產(chǎn)物

續(xù)表1

續(xù)表1

M0為原型化合物，“—”代表原型化合物未進(jìn)入代謝階段，空格則代表未發(fā)現(xiàn)其進(jìn)行I/II相階段的代謝，*代表此前未見報道的、新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物

M0 is a prototype compound, “—” means that the prototype compound has not entered the metabolic stage, blank space means that it has not been found to undergo I/II phase metabolism, and * means a newly discovered metabolite that has not been reported before

3.4.1 異甘草苷代謝產(chǎn)物鑒定 異甘草苷及甘草素經(jīng)HIM、HLM體系孵育后，其二者的代謝途徑如圖9所示。M0的R為3.98 min，準(zhǔn)分子離子峰為/419.133 7 [M＋H]+，分子式為C21H22O9，與對照品比對后確定為異甘草苷。M1～M5均為其I相代謝產(chǎn)物，主要的代謝方式包括脫氫、羥基化等。M6～M9則為其II相代謝產(chǎn)物，主要進(jìn)行了葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)。M1的R為5.64 min，主要碎片離子包括/257.081 0、137.023 6 [M＋H]+，經(jīng)文獻(xiàn)對比后確定其為異甘草苷脫糖產(chǎn)物異甘草素[24]。M2的R為4.32 min，由準(zhǔn)分子離子峰/257.080 8 [M＋H]+，分子式為C15H12O4，并根據(jù)甘草素對照品的R、準(zhǔn)分子離子峰及主要碎片離子，確認(rèn)M2為甘草素。M3的R為3.90 min，準(zhǔn)分子離子峰為273.075 2 [M＋H]+，主要碎片離子包括273.075 2、247.132 2、229.121 7、153.069 8 [M＋H]+；M4的R為3.75 min，準(zhǔn)分子離子峰為/273.074 6 [M＋H]+，主要碎片離子包括/273.074 6、229.141 3 [M＋H]+，M3、M4相較于甘草素都增加了16，推測二者為M2的羥基化產(chǎn)物，且M3中碎片離子/153.069 8 [M＋H]+比甘草素A環(huán)特征碎片多16，提示其為A環(huán)羥基化產(chǎn)物。M5的R為4.04 min，準(zhǔn)分子離子峰/255.065 2 [M＋H]+確定其分子式為C15H10O4，結(jié)合文獻(xiàn)報道[8]，推測其可能在甘草素C環(huán)2、3位脫氫形成雙鍵。M6的R為3.33 min，準(zhǔn)分子離子峰為/595.163 5 [M＋H]+，比異甘草苷多176，推測其為異甘草苷葡萄糖醛酸產(chǎn)物，且其僅在HLM體系中檢測到。M7的R為11.97 min，準(zhǔn)分子離子峰為/628.184 4 [M＋NH4]+，比異甘草苷多192（包括加合離子NH4+），提示其在異甘草苷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)生了葡萄糖醛酸化及羥基化反應(yīng)。M8、M9的R分別為3.54、3.32 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為/455.092 9 [M＋Na]+、433.112 9 [M＋H]+，與甘草素/257.080 8 [M＋H]+對比后推測其進(jìn)行了葡萄糖醛酸結(jié)合，同時它們都具有特征性中性丟失176的離子/257.079 6 [M＋H]+，推測M8、M9均為甘草素的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，且其只在HIM孵育體系中發(fā)現(xiàn)。

圖9 異甘草苷在HIM、HLM體系下可能的代謝途徑

3.4.2 人參皂苷Rb1代謝產(chǎn)物鑒定 人參皂苷Rb1以及人參皂苷CK經(jīng)HIM、HLM體系孵育后，二者的代謝途徑如圖10所示。M0的R為5.37 min，準(zhǔn)分子離子峰1109.611 6 [M＋H]+，推測其分子式為C54H92O23，經(jīng)對照品比對后確定其為人參皂苷Rb1。M1的R為5.38 min，準(zhǔn)分子離子峰/947.556 8[M＋H]+確定其分子式為C48H82O18，其特征碎片離子/605.440 5為其脫去1個糖基生成，判斷其可能為人參皂苷Rd[25]；M2的R為11.86 min，準(zhǔn)分子離子峰/802.533 5 [M＋H]+確定其分子式為C42H72O13，碎片離子643.406 9為其丟失GluA片段，與人參皂苷F2相符[25]。M3的R為10.09 min，準(zhǔn)分子離子峰/623.454 0 [M＋H]+確定其分子式為C36H62O8，與對照品對比后確定其為人參皂苷CK[18,25]；M4的R為9.99 min，準(zhǔn)分子離子峰/461.400 1 [M＋H]+確定其分子式為C30H52O3，據(jù)文獻(xiàn)報道推測其為人參皂苷Rb1階段性脫糖的終產(chǎn)物PPD[25]。

圖10 人參皂苷Rb1在HIM、HLM體系下可能的代謝途徑

3.4.3 甘草酸代謝產(chǎn)物鑒定 甘草酸以及甘草次酸經(jīng)HIM、HLM體系孵育后，二者的代謝途徑如圖11所示。M0的R為6.43 min，準(zhǔn)分子離子峰823.409 4 [M＋H]+確定其分子式為C42H62O16，與對照品比對后確定其為甘草酸。M1的R為10.42 min，準(zhǔn)分子離子峰471.348 7 [M＋H]+，確定其分子式為C30H46O4，與對照品比對后確定其為甘草次酸。M2、M3的R分別為9.01、7.35 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為487.343 9、487.344 0 [M＋H]+，相比甘草次酸的相對分子質(zhì)量多了16，據(jù)報道甘草次酸在體內(nèi)代謝過程中極易發(fā)生羥基化反應(yīng)[24]，因此推測它們?yōu)楦什荽嗡崃u基化產(chǎn)物。M4的R為9.02 min，準(zhǔn)分子離子峰469.333 1 [M＋H]+，相比M1減少2，可能為甘草次酸的脫氫產(chǎn)物；M5的R為9.58 min，具有485.327 6 [M＋H]+準(zhǔn)分子離子峰，比M4大16，推測其為甘草次酸發(fā)生脫氫、加氧后的產(chǎn)物；M6的R為3.84 min，準(zhǔn)分子離子峰647.380 5 [M＋H]+，比甘草次酸多176，推測其可能為甘草次酸葡糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物，或者為甘草酸脫去1分子葡萄糖醛酸基團(tuán)所得。

圖11 甘草酸在HIM、HLM體系下可能的代謝途徑

3.4.4 白術(shù)內(nèi)酯III代謝產(chǎn)物鑒定 白術(shù)內(nèi)酯III在經(jīng)HIM、HLM孵育后檢測到8個代謝成分，其代謝途徑如圖12所示。M0的R為7.92 min，準(zhǔn)分子離子峰/249.149 8 [M＋H]+確定其分子式為C15H20O3，與對照品比對后確定其為白術(shù)內(nèi)酯III。M1的R為7.91 min，準(zhǔn)分子離子峰/231.139 3 [M＋H]+，確定其分子式為C15H18O2，據(jù)文獻(xiàn)可知其為白術(shù)內(nèi)酯III脫水后的產(chǎn)物白術(shù)內(nèi)酯I[26]。M2～M4的R分別為3.91、4.77、4.55 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為/265.142 6、265.142 4、265.142 7 [M＋H]+，均比白術(shù)內(nèi)酯III的相對分子質(zhì)量大16；且M2～M4的主要碎片離子/265.142 6、247.135 3、229.121 7 [M＋H]+同樣比M0特征碎片離子/249.149 8、231.138 7、213.128 7 [M＋H]+大16。將M2～M4中的特征性碎片離子/247.135 3、229.121 7 [M＋H]+與M0的A、B環(huán)特征性離子進(jìn)行對比后，發(fā)現(xiàn)其氧原子應(yīng)該加成在白術(shù)內(nèi)酯III的A、B環(huán)上[26]。M5的R為9.39 min，準(zhǔn)分子離子峰/289.142 2 [M＋Na]+，比M0多40（包括加合離子Na+），推測其可能為M0的水解產(chǎn)物；M6的R為2.90 min，具有/321.129 9 [M＋Na]+準(zhǔn)分子離子峰，比M0多72（包括加合離子Na+），推測其可能為白術(shù)內(nèi)酯III發(fā)生水解及二氧化后的產(chǎn)物。M7的R為7.17 min，準(zhǔn)分子離子峰/283.153 0 [M＋H]+，相比M0增加34，推測為M0單氧化及水解后產(chǎn)物，且其為白術(shù)內(nèi)酯III新出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物。它的碎片離子/201.046 9 [M＋H]+比M0的A環(huán)特征性離子/185 [M＋H]+大16，提示其在A環(huán)發(fā)生單氧化，該化合物首次檢測得到，且僅在HLM體系中檢測得到。M8的保留時間為6.93 min，準(zhǔn)分子離子峰/425.180 0 [M＋H]+，比M0大176，推測其在M0上加成1個葡萄糖醛酸基團(tuán)，為其II相葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

圖12 白術(shù)內(nèi)酯III在HIM、HLM體系下可能的代謝途徑

4 討論

中藥以口服為主，通過胃腸道處置后再經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟等器官進(jìn)行代謝而發(fā)揮作用。在這個過程中，80%藥物的代謝主要發(fā)生在肝臟或其他組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有豐富的藥物代謝酶，如細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450s）和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphoglucuronosyl transferases，UGTs），它們不僅存在于肝臟，小腸也是其主要部位，提示藥物在進(jìn)入肝臟代謝前可能首先經(jīng)過腸道代謝。但目前關(guān)于四君子湯代謝的研究以動物模型為主，這與人體代謝可能存在一定差異。本研究采用HIM、HLM孵育技術(shù)，探究ECS在HIM、HLM中的代謝輪廓及二者間代謝差異，發(fā)現(xiàn)ECS中甘草皂苷類成分主要進(jìn)行腸I相代謝，而人參皂苷類、甘草黃酮類成分則以腸II相代謝為主，此外，白術(shù)內(nèi)酯類成分在腸、肝中代謝均不顯著。

藥物在體內(nèi)代謝包括I相及II相2個階段，I相反應(yīng)包括氧化、還原以及水解，II相反應(yīng)以結(jié)合為主?；衔镌贗相反應(yīng)中暴露出極性基團(tuán)、極性增強(qiáng)并在II相體系下與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合并排出體外。研究表明甘草酸、人參皂苷Rb1作為原型化合物因相對分子質(zhì)量較大，口服進(jìn)入胃腸道后難以被直接吸收利用，生物利用度很低[24-25]，大多傾向于在腸道內(nèi)發(fā)生階梯式脫糖反應(yīng)[27]；而甘草次酸、人參皂苷CK作為它們的I相活性產(chǎn)物，也是它們在體內(nèi)重要吸收利用形式。同時有文獻(xiàn)提出甘草素主要以II相葡萄糖醛酸結(jié)合為主[11]，從而發(fā)揮抗炎等藥理活性。本研究結(jié)果顯示ECS在微粒體孵育體系下，甘草皂苷可能以I相代謝為主，且在腸道中代謝消除更為顯著，而甘草次酸作為其次級代謝產(chǎn)物在I相體系下相對含量變化不明顯，可能是因為它作為苷元經(jīng)皂苷母核水解后生成，極性增強(qiáng)，I相反應(yīng)減弱。此外，白術(shù)內(nèi)酯III在HIM、HLM體系下含量變化較小，這可能是因為其能夠直接被吸收并發(fā)揮改善神經(jīng)細(xì)胞損傷等作用[28]。研究表明，ECS中各化學(xué)成分原型以及代謝產(chǎn)物對于腸道修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)均具有一定的作用。如人參皂苷Rb1及其I相代謝產(chǎn)物人參皂苷CK能夠通過改變腸道菌群的組成比例進(jìn)而對腸道起到一定的保護(hù)作用[29-30]；也有報道提到甘草酸、甘草次酸（甘草酸水解產(chǎn)物）、異甘草苷、白術(shù)內(nèi)酯III對于減輕神經(jīng)毒性、改善神經(jīng)細(xì)胞損傷具有一定的作用[13-14,31-33]。四君子湯亦被證實具有保護(hù)腸道、減少神經(jīng)損傷作用[34]，這更體現(xiàn)出ECS作為其功效組分的重要意義。由此推測，四君子湯中的ECS經(jīng)口服進(jìn)入人體到達(dá)胃腸道后，皂苷類成分包括人參皂苷Rb1、甘草酸均先在腸道內(nèi)發(fā)生脫糖基反應(yīng)，后再吸收入血到達(dá)肝臟，此二者分別與其代謝產(chǎn)物人參皂苷CK、甘草次酸共同發(fā)揮抗炎、保護(hù)腸道等作用；異甘草苷進(jìn)入腸道后發(fā)生水解等反應(yīng)，生成相應(yīng)代謝產(chǎn)物，且其與代謝產(chǎn)物甘草素均能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞損傷起到一定的修復(fù)作用。

另外，本研究對ECS在HIM、HLM中的代謝輪廓也進(jìn)行了分析。ECS中化合物以脫氫、羥基化、氧化、水解、葡萄糖醛酸化為主[26,35-36]，與實驗結(jié)果相符。一直以來針對白術(shù)內(nèi)酯III的報道較少，M7為本研究新發(fā)現(xiàn)的I相代謝產(chǎn)物，為白術(shù)內(nèi)酯III發(fā)生單氧化及水解后生成，且僅在HLM體系中檢測發(fā)現(xiàn)，這可能源于肝臟中含有大量CYP450s供其結(jié)合并發(fā)生相應(yīng)代謝[37]，其生理活性有待進(jìn)一步研究。與此同時，在甘草素的代謝過程中，僅在HIM體系下發(fā)現(xiàn)了2種甘草素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，提示甘草素經(jīng)口服到達(dá)胃腸道后能夠快速發(fā)生代謝，且有研究發(fā)現(xiàn)，相較于肝臟，甘草素在腸道中更易產(chǎn)生多種葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物[38]。此外，四君子湯中人參皂苷Rb1、甘草酸等糖苷類物質(zhì)含量較高，且具有較強(qiáng)的修復(fù)腸道損傷等作用[39-40]，而苷元類成分雖在方劑中含量較低，卻能夠直接對機(jī)體發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，上述糖苷類物質(zhì)在腸道及肝臟中能夠與苷元發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)化，使得體內(nèi)苷元含量增加，進(jìn)而起到保護(hù)腸道、改善神經(jīng)損傷等作用，這體現(xiàn)了中藥多成分的協(xié)同作用及建立功效組分群的意義，也潛在證明了ECS或許能夠在很大程度上代表四君子湯非多糖物質(zhì)的藥效基礎(chǔ)。

本研究為更好地闡明ECS在人體內(nèi)的真實代謝過程，以ECS在HIM、HLM中的代謝過程為重要研究對象，闡明其代謝輪廓差異并預(yù)測其在人體內(nèi)的代謝路徑，為四君子湯非多糖功效組分的體內(nèi)研究提供了切實可靠的證據(jù)，同時也推動了其治療脾虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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metabolism of non-polysaccharide components in Sijunzi Decoction by human intestinal and liver microsomes

SHEN Yi, MA Ping, DONG Bang-jian, PENG Chong-sheng, LI Xiao-bo

School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

To study the metabolism of non-polysaccharide components of Sijunzi Decoction (四君子湯) in human intestinal and liver microsomes, clarify their metabolic profiles and metabolic differences, and provide support for their clinical application.Acquity UPLC I-class/VION IMS QTOF was applied to analyze the metabolites and metabolic transformation of non-polysaccharide components (isoliquiritin, liquiritigenin, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid, ginsenoside Rb1, ginsenoside CK, atractylenolide III) of Sijunzi Decoction in human intestinal and liver microsomes.Glycyrrhizic acid and glycyrrhetinic acid were mainly metabolized by phase I in human intestinal and liver microsomes, while isoliquiritin, liquiritigenin, ginsenoside Rb1, and ginsenoside CK were mainly metabolized by phase II in human intestinal microsomes. Atractylenolide III was less metabolized in both intestinal and liver microsomes, while other compounds in the non-polysaccharide components of Sijunzi Decoction were metabolized more rapidly in human intestinal microsomes than in liver microsomes. Glycyrrhizic acid and ginsenoside mainly underwent deglycosylation. Isoliquiritin mainly underwent deglycosylation and hydroxylation. Liquiritigenin mainly took combination reaction with glucuronic acid. Atractylenolide III mainly underwent hydrolysis and hydroxylation.This study elucidates the metabolic profiles and metabolic differences of the non-polysaccharide components of Sijunzi Decoction in human intestinal and liver microsomes, which is important for clarifying the metabolic transformation process of Sijunzi Decoction in the body, and also provides ideas and strategies for traditional Chinese medicine prescriptions.

Sijunzi Decoction; human intestinal microsome; human liver microsome;metabolism; isoliquiritin; liquiritigenin; glycyrrhizic acid; glycyrrhetinic acid; ginsenoside Rb1; ginsenoside CK; atractylenolide III

R285.61

A

0253 - 2670(2023)15 - 4905 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.016

2023-02-08

國家自然科學(xué)基金資助項目（81973441）

沈 怡（1998—），女，碩士研究生，研究方向為生藥學(xué)。E-mail: shenyi-2020@sjtu.edu.cn

通信作者：李曉波，女，博士，從事生藥學(xué)研究。E-mail: xbli@sjtu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]