李玉澤，張東東，姜 祎，鄧 翀，王 薇，劉建利，宋小妹*

? 化學(xué)成分 ?

小桃兒七中2個(gè)新的甾體類(lèi)化合物

李玉澤1，張東東1，姜 祎1，鄧 翀1，王 薇1，劉建利2，宋小妹1*

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046 2. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069

研究小桃兒七中的甾體類(lèi)成分及其細(xì)胞毒性。采用多種現(xiàn)代分離色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，根據(jù)MS、IR和NMR等數(shù)據(jù)鑒定新化合物的結(jié)構(gòu)，采用MTT法對(duì)新化合物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行篩選。從小桃兒七的正丁醇部位分離鑒定了2個(gè)甾體類(lèi)化合物，分別鑒定為(25)-27--β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羥基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷（1）和3β,14β-二羥基-3β-(2-羥基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯（2），化合物2對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L?；衔?和2均為新化合物，分別命名為鐵筷子苷M（thibetanoside M）和鐵筷子苷N（thibetanoside N）；化合物2表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性。

小桃兒七；甾體皂苷；強(qiáng)心苷；細(xì)胞毒性；鐵筷子苷M；鐵筷子苷N

小桃兒七是毛茛科鐵筷子屬植物鐵筷子Franch.的根及根莖，屬于秦巴特色草藥“太白七藥”之一。鐵筷子屬植物全世界約有20余種，其中鐵筷子為我國(guó)特產(chǎn)，分布于陜西、甘肅、湖北、四川等地，在陜西主要分布于秦嶺山南北坡，具有清熱解毒、活血散瘀、消腫止痛之功效，主要用于治療跌打損傷、尿道炎及瘡癤腫毒等[1]。

文獻(xiàn)研究表明小桃兒七的主要化學(xué)成分為強(qiáng)心苷類(lèi)、甾體皂苷類(lèi)和植源性蛻皮甾酮類(lèi)等[2-4]，具有強(qiáng)心、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌及對(duì)呼吸中樞的興奮等藥理作用[5-6]。其中強(qiáng)心苷類(lèi)成分是小桃兒七抗腫瘤的主要活性成分，逐漸受到國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注[7-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)小桃兒七主要活性成分集中在正丁醇萃取部位，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)小桃兒七正丁醇部位進(jìn)行分離純化，從中鑒定了2個(gè)新化合物分別為(25)-27-- β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羥基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷[(25)-27--β-- glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside，1]和3β,14β-二羥基-3β-(2-羥基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯 [3β,14β- dihydroxy-3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide，2]，命名為鐵筷子苷M和鐵筷子苷N；細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物2表現(xiàn)出較好的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。

1 儀器與材料

島津半制備液相色譜儀（檢測(cè)器：SAD-20A；泵：LC-6AD）；半制備液相色譜柱Ultimate XB-C18（250 mm×10 mm，5 μm，月旭科技上海股份有限公司）；Bruker AVANCE 400型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；色譜純甲醇、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；分析純甲醇、三氯甲烷、石油醚（60～90 ℃）和正丁醇等試劑（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氟尿嘧啶（5-FU，上海生物工程有限公司）；水為娃哈哈純凈水。人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116（ATCC目錄號(hào)：CCL-247）、人肺癌細(xì)胞A549（ATCC目錄號(hào)：CCL-185）、人肝癌細(xì)胞HepG2（ATCC目錄號(hào)：HB-8065）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

小桃兒七藥材于2016年6月購(gòu)于陜西眉縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王薇教授鑒定為毛茛科鐵筷子屬植物鐵筷子Franch.的根及根莖，藥材標(biāo)本（20160915）保存于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)本館。

2 方法

2.1 提取與分離

干燥的小桃兒七15 kg，粉碎后用10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至浸膏，用水分散后，分別用石油醚和正丁醇萃取3次，得石油醚部位（20 g）和正丁醇部位（1.5 kg）。取正丁醇部位（500 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇-水（100∶0∶0～65∶35∶1）洗脫，合并相同流分，分別得到10個(gè)組分Fr.1～10。Fr. 1（40 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（1∶0～3∶1）梯度洗脫，得到3個(gè)組分Fr.1-1～1-3。Fr.1-3（1.3 g）再經(jīng)凝膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到化合物2（8.3 mg）。Fr. 9（200 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇（100∶0～2∶1）梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr. 9-1～9-4。Fr. 9-2（650 mg）經(jīng)高效液相色譜（HPLC），乙腈-水（24∶76）洗脫得到化合物1（9.2 mg，R＝56 min）。

2.2 酸水解實(shí)驗(yàn)

化合物1稱(chēng)取3 mg，采用課題組前期水解和衍生化方法得到糖的衍生物[10-11]，經(jīng)Agilent 7890B氣相色譜儀分析，色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度100 ℃，10 ℃/min升溫至240 ℃，1 ℃/min 升溫至260 ℃，保溫10 min，2 ℃/min 升溫至280 ℃，保溫5 min；進(jìn)樣溫度250 ℃；載氣：氮?dú)?。測(cè)得各單糖的保留時(shí)間分別為21.30 min（-葡萄糖）和19.28 min（-阿拉伯糖）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)信號(hào)

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù) (400/100 MHz, C5D5N)

4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

根據(jù)課題組前期研究[4]，采用MTT法分別測(cè)定化合物1和2對(duì)HCT116細(xì)胞、A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，5-FU為陽(yáng)性藥。結(jié)果化合物2對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值分別為（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L；化合物1對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50值均大于100 μmol/L；5-FU對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為（24.1±2.5）、（18.9±2.8）、（41.7±1.6）μmol/L。

圖3 化合物2的關(guān)鍵HMBC和NOESY相關(guān)信號(hào)

表2 化合物2的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(400/100 MHz, C5D5N)

5 討論

本實(shí)驗(yàn)從小桃兒七中共分離鑒定了2個(gè)新的甾體類(lèi)化合物，生物活性表明化合物2對(duì)3種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性，后期可針對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行深入研究。以上結(jié)果豐富了小桃兒七化學(xué)成分，為進(jìn)一步闡明小桃兒七藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Two new steroidal constituents from roots and rhizomes of

LI Yu-ze1, ZHANG Dong-dong1, JIANG Yi1, DENG Chong1, WANG Wei1, LIU Jian-li2, SONG Xiao-mei1

1. School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China

To study the steroidal constituents from the roots and rhizomes ofand their cytotoxicity.A variety of modern separation chromatography techniques were used for separation and purification, and the structures of the new compounds were identified by MS, IR and NMR data, and their cytotoxic activities were screened by MTT method.Two new steroidal components were obtained from n-butanol fraction of ethanol extract ofand namely (25)-27--β--glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside (1) and 3β,14β-dihydroxy- 3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide (2). The half inhibitory concentration (IC50) of compound 2 on human colon cancer HCT116 cells, human lung cancer A549 cells and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, respectively, was (10.8±0.4), A549 cells (4.8±0.7) and HepG 2 cells (45.3±1.8) μmol/L.Compounds 1 and 2 are new compounds named thibetanoside M and thibetanoside N, among which compound 2 exhibited moderate cytotoxicity.

Franch.; steroidal saponin; bufadienolide; cytotoxicity; thibetanoside M; thibetanoside N

R284.1

A

0253 - 2670(2023)15 - 4769 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.001

2023-03-09

陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2021-02-22-017）；陜西省教育廳項(xiàng)目（22JK0344）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2023-CXTD-05）

李玉澤（1990—），男，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: lyz1990yeah@163.com

通信作者：宋小妹（1963—），女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: songxiaom@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]