沈夢(mèng)浩，劉 博，喬躍輝，帖金鑫，鄭閃閃，白 冰，楊 靖，倪建彬

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 寧波卷煙廠，浙江 寧波 315504)

有機(jī)酸在卷煙煙氣中有相當(dāng)重要的作用，其種類及含量與吸食品質(zhì)有著密切聯(lián)系[1-2]。由于主流煙氣的成分種類復(fù)雜且含量較低，為了簡(jiǎn)化研究對(duì)象并能聚焦關(guān)鍵成分，在研究時(shí)通常利用多級(jí)分離制備技術(shù)對(duì)煙氣成分進(jìn)行有效分割。張啟東等[3]利用凝膠滲透色譜(GPC)和高效液相色譜(HPLC)逐級(jí)分離主流煙氣粒相物中的水溶性成分，確定了煙氣中烤甜香組分；米冠杰等[4]利用中壓和高壓兩級(jí)液相制備色譜對(duì)津巴布韋煙葉煙氣中酸性成分進(jìn)行了分離制備；賈春曉等[5]通過(guò)優(yōu)化半制備HPLC 的分離條件，對(duì)卷煙煙氣的中性香味成分進(jìn)行了有效分離。

分子感官科學(xué)是在成分復(fù)雜的體系中尋找關(guān)鍵成分和表征香氣風(fēng)格特征的有效方法[6]，近年來(lái)在食品科學(xué)領(lǐng)域已有大量研究報(bào)道[7]，在煙草科學(xué)領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外也先后進(jìn)行了相關(guān)研究，如：利用感官導(dǎo)向分析技術(shù)研究了煙葉及煙氣中的關(guān)鍵酸味和甜味物質(zhì)[8-11]；利用香氣活力值技術(shù)確定主流煙氣中關(guān)鍵酸性和堿性物質(zhì)[12-13]；利用香氣活力值研究卷煙主流煙氣中的清香、辛香、焦甜香和煙熏香成分[14-17]；通過(guò)香氣活力值確定福建尤溪煙葉提取物中的重要香氣成分[18]；通過(guò)對(duì)比不同化學(xué)成分的香氣活力值，確定煙用香精中的關(guān)鍵物質(zhì)[19]；采用香氣活力值對(duì)比3 種酸性香料在不同加香方式下的感官貢獻(xiàn)度[20]；利用香氣活力值對(duì)比巨豆三烯酮4 種同分異構(gòu)體和不同濃度薄荷醇在主流煙氣中的貢獻(xiàn)度[21-22]。

加拿大煙葉具有明亮度高、香氣優(yōu)雅、勁頭適宜等優(yōu)質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)于彰顯卷煙醇和淡雅、柔綿細(xì)膩的風(fēng)格特征的貢獻(xiàn)非常大，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)其煙氣酸性成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于分子感官科學(xué)剖析加拿大煙葉的煙氣關(guān)鍵酸性香氣成分，以期為原料的開(kāi)發(fā)和替代提供支撐，也為開(kāi)發(fā)具有加拿大煙葉風(fēng)格特征的煙用香料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

加拿大煙葉由浙江中煙技術(shù)中心提供。二氯甲烷購(gòu)自山東禹王和天下新材料有限公司；濃鹽酸和氫氧化鈉購(gòu)自天津市凱通公司；反式-2-己烯酸購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司；異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、庚酸、辛酸、壬酸、苯乙酸和肉桂酸購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；2,6-二甲基苯酚、苯甲酸和肉豆蔻酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糠酸購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；苯丙酸購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 主要儀器

RM20H 轉(zhuǎn)盤式自動(dòng)吸煙機(jī)(德國(guó)Borgwaldtkc 公司)、7890A-5977B 型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent 公司)、Sepacore 中壓制備系統(tǒng)(瑞 士Buchi 公司)、MS205DU 型精 密電 子天 平(感量0.000 01 g，瑞士梅特勒—托利多公司產(chǎn))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 主流煙氣酸性特征組分的制備

按GB/T 19609—2004[23]規(guī)定的方法抽吸煙支，采用文獻(xiàn)[24]的方法獲得主流煙氣粒相物酸性組分。在轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)上，采用劍橋?yàn)V片捕集1 萬(wàn)支加拿大優(yōu)質(zhì)煙葉卷煙的主流煙氣總粒相物。以異丙醇為萃取劑，采用超聲萃取法萃取劍橋?yàn)V片上粒相物中的成分，超聲萃取30 min，重復(fù)3 次，合并得到的異丙醇萃取液，旋干待用。

將上述所得用二氯甲烷溶解，用5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液萃取5 次；合并氫氧化鈉溶液，用二氯甲烷洗滌3 次；向氫氧化鈉溶液中滴加20% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸溶液，調(diào)至pH=1，用二氯甲烷萃取5 次，合并二氯甲烷相，即為酸性香氣組分。

使用硅膠柱層析技術(shù)對(duì)上述煙氣酸性香氣組分進(jìn)行一級(jí)分離，以200～300 目硅膠作為固定相，石油醚∶乙酸乙酯為流動(dòng)相，依次按100∶1、60∶1、20∶1、1∶1 和0∶1 進(jìn)行梯度洗脫，各比例洗脫體積為1 200 mL，收集洗脫餾分，記為組分A～E；對(duì)各組分進(jìn)行感官評(píng)吸，并以總酸性組分為對(duì)照樣，確定酸性特征組分。

使用中壓制備液相色譜對(duì)確定的B 和D 組分進(jìn)行二級(jí)分離，以薄層層析硅膠為填料、石油醚∶乙酸乙酯為流動(dòng)相，B 組分依次按照80∶1(600 mL)和60∶1 (400 mL)進(jìn)行梯度洗脫，每200 mL 為1 個(gè)餾分，收集餾分，記為組分B1～B5，對(duì)各組分進(jìn)行感官評(píng)吸，并以組分B 為對(duì)照樣，進(jìn)一步確定酸性特征組分；D 組分依次按照4∶1 (600 mL)和1∶1 (400 mL)進(jìn)行梯度洗脫，每200 mL 為1 個(gè)餾分，收集餾分，記為組分D1～D5，對(duì)各組分進(jìn)行感官評(píng)吸，并以組分D 為對(duì)照樣，進(jìn)一步確定酸性特征組分。

1.3.2 樣品感官評(píng)價(jià)

空白卷煙為浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供的未加香加料的單料煙，將分離的組分用無(wú)水乙醇稀釋為70 mg/mL 的溶液，采用香精注射機(jī)注射至空白卷煙中，注射量為每支10 μL，注射后的卷煙置于溫度(22±2) ℃、相對(duì)濕度(60±5)%的環(huán)境下平衡 48 h，待用。由7 位評(píng)價(jià)人員按照《卷煙 中式卷煙風(fēng)格感官評(píng)價(jià)方法》(YC/T 497—2014)[25]對(duì)分離的組分進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)合GC-MS 分析結(jié)果，確定具有加拿大煙葉風(fēng)格特征的組分。

1.3.3 重要酸性香氣成分的確定

根據(jù)GC-MS 定性結(jié)果并綜合香氣描述[26-28]，結(jié)合已有文獻(xiàn)[1-2,4,13,15,18,20,24]確定特征組分中的重要酸性香氣成分，使用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)重要酸性香氣成分進(jìn)行定量分析。

準(zhǔn)確稱取反式-2-己烯酸80.45 mg，用二氯甲烷定容至100 mL，配成酸性內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確稱取異丁酸57.70 mg、丁酸98.31 mg、異戊酸398.60 mg、戊酸137.70 mg、3-甲基戊酸200.80 mg、4-甲基戊酸222.78 mg、庚酸143.00 mg、辛酸194.20 mg、壬酸68.00 mg、苯乙酸1 244.02 mg、肉桂酸465.21 mg、2,6-二甲基苯酚227.14 mg、苯甲酸346.30 mg、肉豆蔻酸29.40 mg、糠酸132.54 mg 和苯丙酸471.36 mg 于容量瓶中并用二氯甲烷定容至100 mL，得到酸性混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別用移液管準(zhǔn)確量取0.01、0.05、0.10、0.50、0.70、1.00、3.00、5.00、7.00 和9.00 mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 個(gè)10 mL的容量瓶中，分別加入1 mL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二氯甲烷定容至刻度，配置成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

選取經(jīng)1.3.1 節(jié)確定的具有加拿大煙葉風(fēng)格特征的組分100 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 并定容至10 mL，采用GC-MS 分析其中的香氣成分。GC 分析條件為：DB-WAX (60.00 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為He (≥99.999%)；恒流流速1.0 mL/min；升溫程序設(shè)置初始溫度為40 ℃，保持10 min，以4 ℃/min 升至96 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升至210 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至240 ℃，保持15 min；分流比為10∶1，進(jìn)樣量1.0 μL。MS 分析條件為：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為電子轟擊電離(EI)；電離能量70 eV，溶劑延遲6.0 min；采用全掃描監(jiān)測(cè)，掃描范圍為35～500 amu，定量時(shí)采用選擇離子檢測(cè)(SIM)掃描，采用NIST 20 譜庫(kù)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行化合物定性。

1.3.4 關(guān)鍵酸性香氣成分的確定

根據(jù)定量結(jié)果和嗅覺(jué)閾值數(shù)據(jù)[29-31]計(jì)算重要酸性香氣成分中各物質(zhì)的香氣活力值(odor activity value，OAV)，確定關(guān)鍵香氣成分。通常認(rèn)為OAV≥1 的化合物對(duì)整體香氣的呈現(xiàn)有貢獻(xiàn)，且化合物OAV 越大，其對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)度越大[6]。OAV 計(jì)算公式為：OAV=香味物質(zhì)在體系中的含量/香味物質(zhì)的嗅覺(jué)閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙氣酸性特征組分的分離

對(duì)一級(jí)分離的各組分進(jìn)行感官評(píng)吸，結(jié)果表明：對(duì)照樣具有獨(dú)特的加拿大卷煙風(fēng)格特征，濃度大，清甜感較明顯；組分A 和組分E 香氣變化不明顯，且雜氣和刺激性增加，對(duì)煙氣有一定的負(fù)面作用；組分B 和組分D 清甜感較明顯，余味舒適，煙氣較柔和，煙氣濃度較大；組分C 香氣有所提高，但刺激性大，余味不舒適。綜合來(lái)看，組分B 和組分D 與對(duì)照樣評(píng)價(jià)結(jié)果較相似。

采用GC-MS 對(duì)組分B 和組分D 進(jìn)行定性分析，結(jié)果(表1)顯示：組分B 中共鑒定出32 種成分，主要是揮發(fā)性的羧酸，這些化合物在煙氣中的作用是增加酸味、突出甜感和提升香氣質(zhì)；組分D 中共鑒定出26 種成分，主要為半揮發(fā)脂肪酸、酚類和芳香族酸類，這些化合物在煙氣中所帶來(lái)的甜感及柔和煙氣、改善余味的作用與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。綜合感官評(píng)吸和GC-MS 分析結(jié)果可以確定組分B 和組分D 為體現(xiàn)加拿大卷煙特征的有效組分。

表1 2 個(gè)重要組分的定性分析Tab.1 Qualitative analysis of two important groups

對(duì)組分B 和組分D 進(jìn)一步分離后的各二級(jí)組分進(jìn)行感官評(píng)吸，結(jié)果(表2)顯示：組分B1、B2 和B5 對(duì)煙氣的改善均不明顯或有負(fù)面作用；組分B3 和B4 均有酸感，與對(duì)照樣接近，但B4 煙氣沉悶，香氣風(fēng)格不突出，而B(niǎo)3 與對(duì)照樣相似，煙氣更加清晰且酸甜感突出；組分D1 和D5 煙氣濃度較低，香氣不足，對(duì)煙氣的改善效果不明顯；組分D2、D3 和D4 香氣質(zhì)和煙氣濃度均有提高，但D4 效果更為明顯，香氣質(zhì)及煙氣擴(kuò)散性提升尤為明顯，與對(duì)照樣更加相似。

表2 各二級(jí)餾分感官評(píng)價(jià)Tab.2 Sensory evaluation of secondary fractions

對(duì)組分B3 和組分D4 進(jìn)行GC-MS 分析，結(jié)果(表3)顯示：組分B3 中共有15 種化合物，主要是碳數(shù)在4～9 之間的低級(jí)脂肪酸，這類酸在煙支燃燒時(shí)可以直接進(jìn)入煙氣，具有焦糖的、甜的和黃油的香韻，可使煙氣更具香料煙煙葉的香味風(fēng)格，和感官評(píng)價(jià)結(jié)果相一致；組分D4 中共鑒定出12 種化合物，主要是芳香族酸，可產(chǎn)生優(yōu)美的香味和一定的甜味，與烤煙型香味比較協(xié)調(diào)。綜合感官評(píng)吸和GC-MS 分析結(jié)果可以確定組分B3 和組分D4 為煙氣酸性特征組分。

表3 組分B3 和D4 GC-MS 分析結(jié)果Tab.3 Analysis results of B3 and D4 components by GC-MS

2.2 重要酸性香氣成分的定量分析

確定了16 種對(duì)煙氣感官質(zhì)量有積極作用的關(guān)鍵酸性香氣成分，其中組分B3 中9 種，組分D4 中7 種(表4)。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法建立了16 種待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果(表5)顯示：線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性范圍較大，可滿足檢測(cè)要求。

表4 16 種重要酸性香氣成分香氣描述Tab.4 Aroma description of 16 important acidic aroma components

表5 16 種重要酸性香氣成分的工作曲線Tab.5 Work curve of 16 important acidic aroma components

2.3 重要酸性香氣成分的OAV 及關(guān)鍵成分的確定

由表6 可知：16 種酸性香氣成分的OAV 介于2～64 400 之間，均大于1，說(shuō)明這些酸性物質(zhì)對(duì)煙氣風(fēng)格特征均有貢獻(xiàn)。其中，苯乙酸的OAV最高(64 400)，苯甲酸的OAV 最低(2)，最高值和最低值相差5 個(gè)數(shù)量級(jí)，表明不同酸性香氣成分對(duì)煙葉風(fēng)格特征的貢獻(xiàn)度有很大差異。

表6 顯示：組分B3 中，異戊酸的質(zhì)量濃度最高(1.09 mg/mL)，其次是4-甲基戊酸(0.66 mg/mL)，質(zhì)量濃度最低的是異丁酸(0.12 mg/mL)，兩者之間的差異不大，但閾值最小的異戊酸(0.09 mg/kg)和閾值最大的庚酸(21.23 mg/kg)相差2 個(gè)數(shù)量級(jí)，導(dǎo)致OAV 差異較大。通過(guò)OAV 對(duì)比可知：雖然異戊酸的含量?jī)H占總含量的31.87%，但它的閾值最小，故異戊酸的OAV 最高(12 111.11)，占總OAV 的77.92%，說(shuō)明這種物質(zhì)在彰顯煙氣風(fēng)格中有著尤為關(guān)鍵的作用。

表6 還顯示：組分D4 中，苯乙酸的質(zhì)量濃度最高(6.44 mg/mL)，肉豆蔻酸的質(zhì)量濃度最低(0.07 mg/mL)，兩者之間相差2 個(gè)數(shù)量級(jí)，但閾值最大的苯甲酸(340.00 mg/kg)和閾值最小的苯乙酸(0.10 mg/kg)之間相差3 個(gè)數(shù)量級(jí)，因此各成分的OAV 相差較大。苯甲酸的含量占總含量的6.81%，但其閾值最大，故其OAV 最小(2.00)；苯乙酸的含量占總含量的64.46%，且其閾值最小，故其OAV (64400.00)遠(yuǎn)大于其他化合物，占總OAV 的93.20%，說(shuō)明其對(duì)彰顯煙葉風(fēng)格特征也有著非常重要的貢獻(xiàn)。

總體來(lái)看，16 種物質(zhì)中異戊酸和苯乙酸的OAV 遠(yuǎn)高于其他物質(zhì)，說(shuō)明這2 種物質(zhì)是加拿大卷煙煙氣的關(guān)鍵酸性香氣成分。低質(zhì)量濃度異戊酸具有甜的果香、酒香以及奶酪香氣，在卷煙中可以起到平和煙氣的作用，使煙氣具有香料煙的醇和特征；而苯乙酸具有強(qiáng)烈的蜂蜜樣甜香，可以明顯增加卷煙煙氣的清甜感。

3 討論

卷煙中的揮發(fā)性酸和半揮發(fā)性酸可直接進(jìn)入煙氣，從而影響卷煙的吃味和香味，因此對(duì)煙草及煙草制品中有機(jī)酸的相關(guān)研究一直備受關(guān)注。已有研究主要聚焦于有機(jī)酸的成分和含量分析，并發(fā)現(xiàn)烤煙中揮發(fā)性酸性香氣成分含量最高的是甲酸和乙酸，半揮發(fā)性酸性香氣成分主要是棕櫚酸和油酸，雖然通過(guò)比較這些數(shù)據(jù)的差異可以在一定程度上說(shuō)明香氣風(fēng)格不同的原因，但并未說(shuō)明究竟是哪些成分對(duì)煙葉香氣起關(guān)鍵作用，其對(duì)卷煙風(fēng)格特征的貢獻(xiàn)程度研究也鮮有報(bào)道?？梢?jiàn)，僅以香味成分在煙氣中的含量衡量其對(duì)體系的貢獻(xiàn)度，無(wú)法在技術(shù)層面上全面且準(zhǔn)確地判定不同成分之間的差異，對(duì)于卷煙煙氣而言，香味成分對(duì)體系的貢獻(xiàn)不僅僅取決于其含量，也與其閾值密切相關(guān)，因此需基于OAV 進(jìn)行綜合判定。

范武等[15]利用三點(diǎn)選配法測(cè)定了21 種酸香成分在乙醇中的嗅覺(jué)閾值，并結(jié)合其在卷煙煙氣粒相物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算了14 個(gè)品牌卷煙煙氣粒相物中各酸香成分的OAV，推測(cè)了21 種酸香成分的貢獻(xiàn)度，認(rèn)為異戊酸和乙酸對(duì)烤煙型卷煙主流煙氣酸香貢獻(xiàn)最大；陳芝飛等[12]根據(jù)OAV確定了黃金葉品牌卷煙煙氣酸性香氣成分中貢獻(xiàn)最大的是乙酸，異戊酸、戊酸、4-甲基戊酸和癸酸對(duì)卷煙香氣特征的表達(dá)也有重要作用。以上2 項(xiàng)研究的酸性化合物主要集中于脂肪羧酸，忽略了芳香族羧酸的貢獻(xiàn)。冒德壽等[8]采用味覺(jué)活力值分析技術(shù)對(duì)51 份煙葉樣本主流煙氣中的27種有機(jī)酸進(jìn)行了測(cè)定，鑒定出煙氣中的關(guān)鍵酸味物質(zhì)為異戊酸、乙酸和戊酸等。盡管該研究的對(duì)象包括苯乙酸等芳香族羧酸，但它主要從酸性物質(zhì)的味覺(jué)感受角度研究其對(duì)煙氣的共獻(xiàn)，忽略了酸性物質(zhì)的香氣特質(zhì)，實(shí)際上，由于煙氣中的短鏈脂肪酸含量較低，其對(duì)味覺(jué)的影響要遠(yuǎn)小于對(duì)嗅覺(jué)的影響。

上述研究通過(guò)OAV 技術(shù)對(duì)主流煙氣進(jìn)行直接分析，確定了異戊酸等短鏈脂肪酸為卷煙的關(guān)鍵酸性組分；而本研究采用柱層析和中壓制備技術(shù)對(duì)主流煙氣中的酸性香氣成分進(jìn)行了分離制備，結(jié)合感官評(píng)價(jià)、OAV 及GC-MS 分析結(jié)果，確定了彰顯加拿大煙葉香氣特征的關(guān)鍵成分除了異戊酸等揮發(fā)性脂肪族羧酸外，還有苯乙酸等半揮發(fā)性芳香族羧酸成分。加拿大煙葉明亮度高、香氣優(yōu)雅、勁頭適宜、清甜香突出，具有獨(dú)特的“濃中透清”的煙氣風(fēng)格，而國(guó)內(nèi)煙葉則是以清(青)香或濃香為主體香韻，加拿大煙葉與國(guó)內(nèi)煙葉煙氣酸性香氣成分差異可能是其獨(dú)特風(fēng)格特征的成因。可見(jiàn)，采用OAV 技術(shù)有助于揭示煙葉香氣風(fēng)格形成的內(nèi)在因素。

4 結(jié)論

加拿大煙葉中的關(guān)鍵酸性組分是小分子羧酸和芳香族酸，其中的16 種重要香氣成分中，苯乙酸和異戊酸的含量最高；16 種成分對(duì)加拿大煙葉的風(fēng)格特征均有貢獻(xiàn)，其中異戊酸和苯乙酸的OAV 遠(yuǎn)大于其他成分，這2 種物質(zhì)可以判斷為彰顯加拿大煙葉風(fēng)格特征的關(guān)鍵酸性香氣成分。