周思佳，韓佃剛，董 俊，楊云慶，葉玲玲，李 靜，張 沖，信吉閣

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南 昆明 650228)

牛病毒性腹瀉病是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種世界性重要傳染病[1-2]。臨床表現(xiàn)包括高燒、嚴(yán)重腹瀉、黏膜糜爛和壞死，甚至在發(fā)病后數(shù)日內(nèi)死亡；孕牛感染則會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒畸形和持續(xù)性感染等[3]。BVDV 屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，僅有1 個(gè)血清型；依據(jù)其5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR)及基因組結(jié)構(gòu)差異已鑒定出3 個(gè)基因型，依次為BVDV-1、BVDV-2 和HoBi-like，BVDV-1 又 進(jìn)一步區(qū)分出22 個(gè)基因亞型，BVDV-2 有4 個(gè)基因亞型[1,4-6]。近年來(lái)對(duì)中國(guó)各地區(qū)開(kāi)展的多項(xiàng)BVDV 流行病學(xué)調(diào)查研究顯示：中國(guó)主要流行的BVDV 亞型是BVDV-1a、BVDV-1c 和BVDV-1m[7-9]。2014 年GONG 等[10]對(duì)中國(guó)青海牦牛BVDV基因分型進(jìn)行研究，分離鑒定其基因型為BVDV-1b、BVDV-1d 和BVDV-1q?？梢?jiàn)，中國(guó)BVDV 流行毒株主要為1 型。

BVDV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)[1]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法是針對(duì)病原的檢測(cè)，不受動(dòng)物機(jī)體本身免疫力的影響，是病毒檢測(cè)最常用的方法之一。中國(guó)已經(jīng)有BVDV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)研究[11-12]，但病毒基因的不斷加速變異導(dǎo)致傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)檢和漏檢，故需要對(duì)病原基因進(jìn)行全面分析并及時(shí)更新檢測(cè)方法。中國(guó)牛病毒性腹瀉流行毒株主要為1 型，目前特異性檢測(cè)BVDV-1 型的方法較少，且沒(méi)有特異性針對(duì)BVDV-1 型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，不足以支持對(duì)BVDV-1 的研究和流行情況的了解。

本研究通過(guò)對(duì)近5 年流行的BVDV-1 全基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)針對(duì)BVDV-1 的特異性引物和探針，經(jīng)反應(yīng)條件、體系優(yōu)化和檢測(cè)效果測(cè)試，建立BVDV-1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，并對(duì)云南省部分地區(qū)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，以期為BVDV-1 的調(diào)查研究提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 病毒和臨床樣品

供試BVDV 病毒、藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus，BTV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)和口蹄疫病毒(foot-andmouth disease virus，F(xiàn)MDV) O 型疫苗均由昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存，通過(guò)病毒DNA/RNA 提取試劑盒提取核酸；172 份牛全血樣品來(lái)源于云南省怒江、德宏和臨滄等地。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 提取試劑盒購(gòu)自天隆科技(西安)有限公司；凝膠回收試劑盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T Vector Cloning Kit 載體購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)有限公司；Trans5α Chemically Competent Cell 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；HiScript Ⅱ U+One Step qRT-PCR Probe Kit (諾唯贊，貨號(hào)Q223-01)購(gòu)自諾唯贊生物科技(南京)有限公司；50×TAE 緩沖液、瓊脂糖、6×Loading buffer 和Marker Ⅰ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)合成

從NCBI GenBank 下載BVDV-1 全基因序列，使用MegAlign 軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)，分析基因序列保守區(qū)域；根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 引物與熒光探針設(shè)計(jì)原則，采用Premier 6.0 設(shè)計(jì)特異性上游引物2 條、下游引物1 條和熒光探針1 條(表1)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針信息Tab.1 Information of primer and probe

1.4 引物篩選

使用HiScript Ⅱ U+One Step qRT-PCR Probe Kit 對(duì)設(shè)計(jì)的2 對(duì)引物進(jìn)行篩選，并選擇1 對(duì)最佳引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。反應(yīng)體系為20.0 μL，包括2×One Step U+Mix 10.0 μL、One Step U+Enzyme Mix 1.0 μL、50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL、10 μmol/L 上游引物0.4 μL、10 μmol/L 下游引物0.4 μL、10 μmol/LTaqMan 探針0.2 μL、模板RNA 2.0 μL 和H2O 5.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min；94 ℃預(yù)變性10 s；92 ℃變性15 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，預(yù)擴(kuò)增5 個(gè)循環(huán)；92 ℃變性10 s，56 ℃退火、延伸1 min，采集FAM 熒光，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化

為達(dá)到最佳檢測(cè)效果，使用方陣法對(duì)引物和探針濃度進(jìn)行篩選。由于探針加入量較小，為保證試驗(yàn)的精確度，稀釋引物濃度為10 μmol/L、探針濃度為1 μmol/L。反應(yīng)總體系為20.0 μL，取上、下游引物終濃度分別為0.20、0.40、0.60 和0.80 μmol/L，探針濃度分別為0.10、0.15、0.20和0.25 μmol/L，反應(yīng)體系和程序同1.4 節(jié)。

1.6 模板質(zhì)粒的制備

經(jīng)引物篩選后，使用選定的引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為25.00 μL，包括2×One Step Mix (Dye plus) 12.50 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、10 μmol/L 上游引物1.00 μL、10 μmol/L下游引物1.00 μL、模 板RNA 2.00 μL 和H2O 7.25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后若見(jiàn)條帶與目的條帶大小相符，便將瓊脂糖凝膠中的條帶切下放入1.5 mL 離心管中稱(chēng)量(凝膠質(zhì)量100 mg，可視為100 μL)，參照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物回收。

按照pMD19-T Vector Cloning Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上一步回收的目的片段與pMD19-T 載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞中涂板培養(yǎng)。挑取單菌落于37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)3～4 h，進(jìn)行菌液PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)總體系25.0 μL，包括ExTaq12.5 μL、10 μmol/L 上游引物1.0 μL、10 μmol/L 下游引物1.0 μL、模板DNA 2.0 μL 和H2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送至上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)繁及保存；使用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)定并計(jì)算其濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 靈敏度試驗(yàn)

經(jīng)測(cè)定，1.5 節(jié)構(gòu)建的BVDV 陽(yáng)性模板質(zhì)粒質(zhì)量濃度為270 ng/μL，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)，將質(zhì)粒質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的拷貝數(shù)，其轉(zhuǎn)換公式為拷貝數(shù)=(質(zhì)量/分子量)×6.0×1023。經(jīng)計(jì)算，其分子量為955 020，拷貝數(shù)為1.70×1011。將模板質(zhì)粒按照101～1011進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，對(duì)11 個(gè)不同稀釋度的模板質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系為1.5 節(jié)中優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系，DNA 模板質(zhì)粒為1.0 μL，測(cè)定試驗(yàn)的靈敏度。

1.8 特異性試驗(yàn)

按照病毒RNA/DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取BVDV、CSFV、BTV、FMDV、VSV 和PPRV 等病毒樣本的核酸，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，以ddH2O 作為陰性對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取3 個(gè)不同稀釋梯度(1.70×104、1.70×107和1.70×108)的BVDV 模板質(zhì)粒，每個(gè)梯度樣本重復(fù)3 次實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算其變異系數(shù)并評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣本檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的BVDV-1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法，對(duì)172 份臨床樣品(血樣)進(jìn)行檢測(cè)。樣品采自2021 年云南怒江、德宏和臨滄等地具有腹瀉臨床癥狀的犢牛。

為檢驗(yàn)本研究建立BVDV-1 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)采用《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范》(GB/T 18637—2018)[11]中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，引物和探針信息見(jiàn)表2。反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；92 ℃變性15 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，預(yù)擴(kuò)增5 個(gè)循環(huán)；92 ℃變性10 s，56 ℃退火、延伸1 min，采集FAM 熒光，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。

表2 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)BVDV 的引物和探針Tab.2 Primers and probe for real-time fluorescence quantitative RT-PCR detection of BVDV in the national standard

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

由圖1 和表3 可知：引物FW1+RV1 和FW2+RV1 的熒光值均較高，但FW1+RV1 的Ct 值最小，故選其作為最佳引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 引物篩選結(jié)果Fig.1 Primer screening results

表3 引物篩選的Ct 值Tab.3 Ct value of primer screening

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

由圖2 和表4 可知：探針濃度為 0.25 μmol/L、引物濃度為0.60 μmol/L 時(shí)熒光值較高，平均Ct值最小，故選擇該引物和探針濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 引物和探針篩選試驗(yàn)Fig.2 Primer and probe concentrations screening

表4 引物和探針篩選的Ct 值Tab.4 Ct value of primer and probe screening

2.3 模板質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

對(duì)2.1 節(jié)篩選的引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，經(jīng)普通PCR 及凝膠電泳鑒定后，擴(kuò)增片段與目的片段大小相符，均為171 bp (圖3)。經(jīng)測(cè)序后與參考序列比對(duì)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)室保存的毒株基因序列與所下載參考序列同源性高，測(cè)序驗(yàn)證正確，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

圖3 菌液PCR 凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of bacterial PCR

2.4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

經(jīng)檢測(cè)，BVDV 陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)為1.70 copies/μL 時(shí)仍可檢出BVDV 陽(yáng)性(圖4 和表5)。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=-3.259 9x+40.392 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.4 Amplification curve of real-time fluorescence quantitative RT-PCR in sensitivity assay

表5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 靈敏度試驗(yàn)對(duì)應(yīng)Ct 值Tab.5 Ct value in the sensitivity assay of real-time fluorescence quantitative RT-PCR

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果

由圖5 和表6 可知：僅BVDV 可以被檢測(cè)，其余病毒核酸均無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)且無(wú)Ct 值，表明所建立的BVDV-1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法特異性良好。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specificity assay results of real-time fluorescence quantitative RT-PCR

表6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 特異性試驗(yàn)對(duì)應(yīng)Ct 值Tab.6 Ct value of the specificity assay of real-time fluorescence quantitative RT-PCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

選取3 個(gè)不同稀釋梯度(104、107和108)的BVDV 模板質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。由圖6 和表7可知：同一稀釋梯度的熒光曲線(xiàn)重復(fù)性較好，變異系數(shù)均小于1%，表明所建立的實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR 具有較好的重復(fù)性。

圖6 3 個(gè)稀釋梯度的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Repetitive assay results for three dilution gradients

表7 3 個(gè)稀釋梯度的重復(fù)性試驗(yàn)Ct 值Tab.7 Ct value for three dilution gradients in repeatability assay

2.7 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

由表8 可知：172 份臨床樣品(血樣)中，有33 份檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為19.19%。33 份樣本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證均為陽(yáng)性，與本試驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR 檢測(cè)結(jié)果完全一致。

表8 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Tab.8 Clinical sample detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR

3 討論

BVDV 已在世界各地廣泛流行和蔓延，對(duì)中國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)也造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。現(xiàn)階段，疫苗接種并未取得理想效果，因此，高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于發(fā)病牛的診斷和牛場(chǎng)生物安全防控尤為重要。本研究比對(duì)分析了近年流行的BVDV全基因序列，發(fā)現(xiàn)BVDV 的3 種基因型差異較大，無(wú)法兼顧高靈敏度及全面檢出，因此本研究針對(duì)國(guó)內(nèi)主要流行的BVDV 基因1 型毒株5′-UTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化建立BVDV-1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法具有較好的特異性，最低檢測(cè)下限為1.7 copies/μL，具有較高的敏感度，變異系數(shù)均小于1%，重復(fù)性良好。與趙成瑩等[12]開(kāi)展的BVDV RT-PCR 方法相比較，本研究所建立的方法靈敏度更高。張宇名等[13]建立了BVDV 可視化一步RT-LAMP 檢測(cè)法，可在30 min 內(nèi)完成檢測(cè)，對(duì)BVDV RNA 檢測(cè)下限最低達(dá)0.021 pg/μL。魏宇等[14]建立了BVDV 和牛冠狀病毒雙重納米R(shí)T-PCR 檢測(cè)方法，為常規(guī)RT-PCR 敏感性的10倍，最低檢出限為l fg。王以欣等[15]制備了BVDV單克隆抗體并應(yīng)用于病毒檢測(cè)。BVDV 檢測(cè)方法不斷改進(jìn)完善，一些新興技術(shù)被應(yīng)用于BVDV 的檢測(cè)，如雙重納米R(shí)T-PCR 法、RPA-LFD 技術(shù)、抗體液相芯片技術(shù)、納米抗體ELISA 和CRISPR等[16-20]。近年來(lái)開(kāi)展的BVDV 檢測(cè)方法研究為疫病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了必要的技術(shù)支持。

中國(guó)云南邊境地區(qū)與老撾、緬甸和越南等國(guó)有頻繁的出入境動(dòng)物經(jīng)濟(jì)貿(mào)易，且周邊國(guó)家獸醫(yī)防疫體系落后，導(dǎo)致進(jìn)入中國(guó)的動(dòng)物病毒帶毒風(fēng)險(xiǎn)較高，邊境地區(qū)病毒防控壓力巨大。采用本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法對(duì)云南省5個(gè)地區(qū)的172 份牛血樣進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為 33 份樣品為 BVDV 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為 19.19%，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明本研究所建立的檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性，對(duì)云南BVDV-1 的流行病學(xué)研究和防治具有重要意義。在熒光PCR反應(yīng)程序中，預(yù)變性可使引物完全變性解開(kāi)，從而保證引物為單鏈 DNA，提高了擴(kuò)增效率。1 個(gè)高效的目標(biāo)序列預(yù)擴(kuò)增步驟可以顯著提高整體檢測(cè)靈敏度，在本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)程序中增加了5 個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增程序，靈敏度顯著提高，最低可檢測(cè)1.7 copies/μL 的樣本。此外，本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-3.259 9x+40.392 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，其中y值為Ct 值，x值為拷貝數(shù)的log 值。對(duì)橫坐標(biāo)參數(shù)進(jìn)行賦值，令x值為0，即樣本中BVDV 的模板含量拷貝數(shù)為1，得到的最大Ct 值為40.392 0，約等于40。因此，Ct 值40 可作為本方法判定結(jié)果的臨界值，即Ct 值大于40 即判定為陰性，Ct 值小于40 則判定為陽(yáng)性，該方法的結(jié)果判定更加方便簡(jiǎn)單。

4 結(jié)論

本研究建立了BVDV 基因1 型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，具備良好的重復(fù)性，對(duì)牛全血樣品BVDV 檢出效果較好，能夠?yàn)锽VDV-1 的快速診斷和病毒研究提供有價(jià)值的參考。