鄧春菊，李 艷，楊毅娟，楊艷梅，陳 敏，李永青，胡先奇

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南省昭通市植保植檢站，云南 昭通 657500)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)作為中國主要的糧食作物，在云南省的種植面積和產(chǎn)量均居中國前4 名[1]。馬鈴薯在整個(gè)生長過程中極易受到各種有害生物的影響，包括馬鈴薯孢囊線蟲(potato cyst nematode，PCN)。PCN 是國際公認(rèn)的危險(xiǎn)性檢疫性有害生物(病原物)，最具侵入性與經(jīng)濟(jì)破壞性，如果不加以嚴(yán)格管控，一旦傳入發(fā)生為害能使產(chǎn)量損失高達(dá)80%[2-3]，其常見種類有馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.pallida)。2020 年，馬鈴薯金線蟲被中國列為植物檢疫性生物[4]。馬鈴薯受到PCN 為害后，地上部無明顯的識(shí)別癥狀[5]，但根系被損傷，使植株根系對(duì)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力降低，后續(xù)地上部表現(xiàn)為生長勢(shì)弱，出現(xiàn)矮化和黃化等癥狀，與缺水、缺肥和營養(yǎng)不良等表現(xiàn)的癥狀相似[6]。馬鈴薯孢囊線蟲起源于南美洲安第斯山脈，與馬鈴薯協(xié)同進(jìn)化[7]，在19 世紀(jì)“愛爾蘭饑荒”時(shí)期隨著抗晚疫病育種材料的引進(jìn)傳入歐洲[8]，之后被擴(kuò)散至其他地區(qū)，現(xiàn)已廣泛分布于歐洲、亞洲、非洲、大洋洲和美洲大陸以及與中國毗鄰的國家(如俄羅斯、日本和塔吉克斯坦等)[5]。由于馬鈴薯金線蟲和白線蟲在形態(tài)學(xué)上沒有太大差異，鑒定時(shí)不易區(qū)分，為了準(zhǔn)確鑒定這2 個(gè)不同的種，通常采用形態(tài)學(xué)方法鑒別和分子生物學(xué)方法輔助鑒定，如免疫酶聯(lián)法(enzyme linked immunosorbent assay，ELASA)[9]、限制性片段長度多態(tài)性擴(kuò)增(restriction fragment length polymorphism，RFLP)[10]和特征序列擴(kuò)增(sequence characterized amplified regions，SCAR)技術(shù)[11]等。

2021 年，本課題組在馬鈴薯田間有害生物調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)部分種植地的馬鈴薯植株表現(xiàn)生長勢(shì)弱，矮化、黃化和萎蔫癥狀，開花期馬鈴薯根系著生球形孢囊，為確定馬鈴薯上孢囊線蟲的種類，隨即采集罹病馬鈴薯根際土壤和根系帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離和鑒定，以期為制定馬鈴薯孢囊線蟲病的防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021 年在云南省昭通市昭陽區(qū)馬鈴薯種植地采集馬鈴薯根際土壤樣品33 份。采取土樣時(shí)，去除表土層，采集 10～15 cm 根際土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，土樣在常溫下晾干后用浮選法分離孢囊。在其中1 份土樣中分離獲得孢囊，命名為GR-1，即為供試線蟲。

LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加去離子水800 mL，用去離子水定容至1 L，備用。

LB-氨芐青霉素固體培養(yǎng)基：將 LB 液體培養(yǎng)基加入適量瓊脂，121 ℃高壓滅菌 25 min，待溫度降至50 ℃以下，加入100 mg/mL 氨芐青霉素1 000 μL，倒入培養(yǎng)皿中凝固后備用。

試劑：瓊脂糖、蛋白酶K、10×PCR Buffer(Mg2+，Plus)、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 plus DNA Marker、DL2000 DNA Marker、DNA 凝膠回收試劑盒、GoldenviewTM核酸染料和氨芐青霉素購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMDTM18-T 載體和大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。引物均由北京擎科生物科技有限公司(昆明)合成。

儀器：XTL-2 400 解剖鏡 (上海精密儀器儀表有限公司)，Axio Vert.A1 倒置顯微鏡 (德國Carl Zeiss 公 司)，DYCZ-24D 電泳儀和WD-9402A PCR 儀(北京六一儀器廠)，LG2020 型凝膠成像系統(tǒng) (杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)，ZEISS sigma 300 掃描電鏡 (德 國Carl Zeiss 公 司)，Quorum pp3010t 冷凍傳輸系統(tǒng) (英國Quorum 技術(shù)有限公司)。

1.2 形態(tài)鑒定

1.2.1 孢囊形態(tài)

將飽滿的線蟲孢囊置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡 24 h；在解剖鏡下，用毛筆尖挑取浸泡過的孢囊置于載玻片上，將泥土刷凈，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照測(cè)量；用解剖刀切下孢囊末端，用發(fā)絲針仔細(xì)清除附著在孢囊內(nèi)側(cè)的內(nèi)含物，將陰門錐的邊緣修整齊，挑到甘油中透明；將透明后的陰門錐移至載玻片上，制作永久玻片，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。形態(tài)測(cè)量方法參考SUBBOTIN 等[12]的方法。

1.2.2 2 齡幼蟲形態(tài)

將分離出的孢囊用解剖刀剖開，在體視顯微鏡下挑取孢囊中的2 齡幼蟲；將2 齡幼蟲吸至載玻片上的水滴中，熱殺死后用4%的福爾馬林(V40%甲醛∶V蒸餾水=1∶9)固定線蟲，觀察、拍照并測(cè)量。形態(tài)測(cè)量方法參考SUBBOTIN 等[12]的方法。

1.2.3 孢囊和2 齡幼蟲的超微結(jié)構(gòu)

將挑出的孢囊和2 齡幼蟲放入1 mL 離心管，加入ddH2O 500 mL 沖洗4 次；將樣品用冷凍膠水固定于樣品托上，插入溫度低于130 K (-143.15 ℃)的過冷液氮雪泥中快速冷凍固定；在真空條件下，將樣品轉(zhuǎn)移到掃描電鏡樣品艙端口制樣艙的冷臺(tái)上，進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察[13]。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 線蟲DNA 提取

單個(gè)孢囊DNA 的提取參考SUBBOTIN 等[14]的方法。將單個(gè)孢囊放入含有ddH2O 10 μL 的0.2 mL 離心管中，加入10×PCR 緩沖液7 μL 和600 ng/mL 蛋白酶K 3 μL，用液氮速凍研磨2次；將離心管置于PCR 儀器中先65 ℃恒溫1 h，再95 ℃恒溫10 min。

1.3.2 28S rDNA-D2/D3 區(qū)擴(kuò)增

引物為D2A (5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B (5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)[15]。反應(yīng)體系25.0 μL，包括ddH2O 8.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，線蟲DNA 2.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用添加核酸染料制備的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3.3 細(xì)胞色素氧化酶c 亞基Ⅰ(cox1)區(qū)擴(kuò)增

引物為JB3 (5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和JB5 (5′-AGCACCTAAACTTAAAACATAATGAAAATG-3′)[16]。反應(yīng)體系同1.3.2 節(jié)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用添加核酸染料制備的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3.4 種特異性檢測(cè)

參考EPPO PM 7/40 (5)[17]特異引物：ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和PITSr3(5′-AGCGCAGACATGCCGCAA-3′)或PITSp4 (5′-ACAACAGCAATCGTCGAG-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系同1.3.2 節(jié)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用添加核酸染料制備的1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3.5 D2/D3 區(qū)和cox1 區(qū)PCR 產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序

用DNA 凝膠回收試劑盒回收線蟲28S 序列和cox1 序列的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMDTM18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB-氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆進(jìn)行 PCR 鑒定，獲得陽性克隆后委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.6 D2/D3 區(qū)和cox1 區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測(cè)序得到的序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載相似度較高的序列。在Phylosuite 1.22軟件上進(jìn)行對(duì)比優(yōu)化，再利用Phylosuite 1.22 中的ModelFinder 進(jìn)行數(shù)據(jù)集連接，劃分最佳方案和確定DNA 進(jìn)化最佳模型(28S r DNA D2-D3 和mt DNA-cox1 區(qū)域的最佳擬合)。以鹿角唇線蟲屬的Cervidellus alutus(GenBank 登錄號(hào)：AF331911.1)和根結(jié)線蟲屬的北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla，GenBank 登錄號(hào)：KU517171.1)分別作為28S序列和cox1 序列的外群，采用貝葉斯推理法(Bayesian inference，BI)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，采樣頻率為20 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀觀察

采樣地塊馬鈴薯植株長勢(shì)較弱，呈現(xiàn)矮化和黃化等缺水癥狀，出現(xiàn)發(fā)病中心團(tuán)；開花期將馬鈴薯根系拔出后，發(fā)現(xiàn)根系上粘有肉眼可見的乳白色、金黃色和棕色球形顆粒(圖1)。

圖1 馬鈴薯金線蟲田間為害的地上部(a)和地下部(b)癥狀Fig.1 Field symptoms aboveground part (a) and underground part (b) of Globodera rostochiensis

2.2 形態(tài)鑒定

2.2.1 雌蟲及孢囊的形態(tài)特征

分離出的孢囊符合馬鈴薯孢囊線蟲的特征。雌蟲為白色，近球形，頸部突出，角質(zhì)層逐漸變成金黃色(圖2a～b)。雌成蟲死后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣饣瑘A潤，形成近似球形的孢囊，頸部突出(圖2c～d)。無終錐卵呈橢圓形，白色卵粒包裹在孢囊內(nèi)(圖2e)，每個(gè)孢囊約有200～1 000 個(gè)卵粒；陰門錐為單環(huán)膜孔型，膜孔呈圓形，肛門上方有1 個(gè)明顯的“ V ”形標(biāo)記(圖2f)；肛門開口比陰門小，位于距離最近的外陰邊緣之間。角質(zhì)層表面呈鋸齒狀突起，有明顯的褶皺。

圖2 馬鈴薯金線蟲GR-1 群體雌蟲及孢囊形狀Fig.2 Females and cysts of G.rostochiensis of GR-1 population

對(duì)GR-1 群體的30 個(gè)孢囊和陰門錐樣本進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果(表1)顯示：孢囊膜孔直徑為11.71～15.35 μm，陰門到肛門的距離為50.481～81.77 μm，Granek’s 比值 (肛門到最近的陰門橋距離/會(huì)陰區(qū)直徑)為4.31～5.33，體寬為592.74～748.36 μm，體長(含頸)為659.85～763.15 μm。

表1 GR-1 群體與國內(nèi)外報(bào)道的馬鈴薯金線蟲孢囊和陰門錐形態(tài)數(shù)據(jù)Tab.1 The cysts morphological data of GR-1 population and other domestic and foreign studies reported

2.2.2 2 齡幼蟲的形態(tài)特征

2 齡幼蟲呈蠕蟲狀(圖3a～b)，熱殺死后身體僵直；角質(zhì)層有環(huán)紋，側(cè)區(qū)有4 條明顯的側(cè)線，蟲體兩端的側(cè)線有3 條。頭部圓形，與身體稍微分離，頭部骨架化較強(qiáng)，口針粗壯，基部較桿部粗，口針基部球側(cè)部較鈍，呈球形(圖3c～d)；尾部在肛門后面逐漸變細(xì)，成為1 個(gè)精細(xì)的圓點(diǎn)，最末端有1 個(gè)透明區(qū)域(圖3e～f)。

圖3 馬鈴薯金線蟲GR-1 群體的2 齡幼蟲Fig.3 The second stage juveniles of G.rostochiensis of GR-1

對(duì)GR-1 群體的40 個(gè)2 齡幼蟲樣本進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果(表2)顯示：體長437.30～493.12 μm，尾長46.31～56.79 μm，透明尾長22.23～26.62 μm，口針長21.00～22.19 μm。

表2 GR-1 群體與國內(nèi)外報(bào)道的馬鈴薯金線蟲2 齡幼蟲形態(tài)數(shù)據(jù)Tab.2 The second stage juveniles morphological data of GR-1 population and other domestic and foreign studies reported

2.3 分子鑒定

2.3.1 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

GR-1 群體用馬鈴薯金線蟲特異引物ITS5 和PITSr3 擴(kuò)增出的片段約為430 bp，而用白線蟲特異引物ITS5 和PITSp4 擴(kuò)增后無條帶(圖4)；用線蟲通用引物D2A 和D3B、JB3 和JB5 擴(kuò)增后，片段大小約為780 和450 bp (圖5)。

圖4 GR-1 群體特征區(qū)域馬鈴薯白線蟲與馬鈴薯金線蟲特異引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR results of specific primers of G.pallida and G.rostochiensis of specific region of GR-1

圖5 GR-1 群體28S rDNA-D2/D3 區(qū)和mtDNA-cox1 區(qū)PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR results of the 28S rDNA D2/D3 and mtDNA-cox1 regions of GR-1

2.3.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序及序列分析

樣本GR-1 28S DNA-D2/D3 區(qū)序列的PCR 產(chǎn)物為784 bp，BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示：樣本的D2/D3區(qū)序列與馬鈴薯金線蟲(登錄號(hào)為MZ057600.1、MZ570260.1、MK534182.1、KJ409625.1、KJ4096-31.1 和MZ057596.1)相似，相似度為99.11%～100.00%。樣本GR-1 mtDNA-cox1 序列的產(chǎn)物為447 bp，BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示：樣本cox1 區(qū)序列與馬鈴薯金線蟲(登錄號(hào)為MF773722.1、MH399-817.1、MH399817.1、MH399815.1、MT240262.1和MN095979.1)相似，相似度為99.28%～99.33%。

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示：以28S rDNA-D2/D3區(qū)序列和mtDNA-cox1 區(qū)序列構(gòu)建的發(fā)育樹結(jié)果基本一致。GR-1 群體樣本28S rDNA-D2/D3 序列以100%的支持率與GenBank 中的馬鈴薯金線蟲(登錄號(hào)為KJ409625.1、KJ409631.1、KU297661.1和MZ570260.1)聚為1 個(gè)分支(圖6)。GR-1 群體樣本mtDNA-cox1 序列以100%的支持率與Gen-Bank 中的馬鈴薯金線蟲(登錄號(hào)為MT240262.1、MZ570875.1、MH399817.1、MN095981.1 和MF773-722.1)聚為1 個(gè)分支(圖7)。

圖6 GR-1 群體28S rDNA-D2/D3 區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 28S rDNA-D2/D3 fragment GR-1 population

圖7 GR-1 群體mtDNA-cox1 片段系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of mtDNA-cox1 fragment of GR-1 population

3 討論

根據(jù)孢囊線蟲的孢囊形狀、Granek’s 比值、2 齡幼蟲體長和口針長等，對(duì)在云南省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)部分種植地發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯孢囊線蟲種群GR-1進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將GR-1 群體的形態(tài)數(shù)據(jù)與國內(nèi)報(bào)道[18]的馬鈴薯金線蟲群體形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本研究測(cè)量的孢囊和2 齡幼蟲數(shù)據(jù)與之基本一致；將GR-1 群體的形態(tài)數(shù)據(jù)與國外孢囊形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：與塞爾比亞種群[19]相比，GR-1 群體的膜孔直徑[(13.39±1.20) μm)]小于塞爾比亞種群[(22.83±4.62) μm)]，但Granek’s比值(4.87±0.65)大于塞爾比亞種群(1.94±0.49)；與葡萄牙種群[20]相比，群體GR-1 的體寬[(659.17±39.38) μm]和體長(含頸長)[(706.16±36.21) μm]略大于葡萄牙種群[分別為(474.09±93.57) μm 和584.984 μm]，但膜孔直徑小于葡萄牙種群[(25.13±6.70) μm]；與伊朗種群[21]相比，群體GR-1 的Granek’s 比值略大于伊朗種群(3.27±0.61)，但膜孔直徑略小于伊朗種群[(15.24±1.92) μm]；其余數(shù)據(jù)僅有微小差異。群體GR-1 的2 齡幼蟲形態(tài)數(shù)據(jù)與國外報(bào)道[18-21]的形態(tài)數(shù)據(jù)大致相同。

本研究利用線蟲通用引物擴(kuò)增了線蟲28S rDNA/D2/D3 區(qū)和mtDNA-cox1 區(qū)片段，BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)2 個(gè)區(qū)域序列與GenBank 中已報(bào)道的馬鈴薯金線蟲序列相似度分別為99.11%～100.00%和99.28%～99.33%，并基于2 個(gè)區(qū)域序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：2 個(gè)序列均與GenBank 中的馬鈴薯金線蟲序列聚為1 支。根據(jù)EPPO PM 7/40 (5)[17]發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)，馬鈴薯金線蟲特異引物ITS5/PITSr3 PCR 擴(kuò)增條帶為434 bp，馬鈴薯白線蟲特異引物ITS5/PITSp4 PCR 擴(kuò)增條帶為256 bp。本研究的特異片段擴(kuò)增結(jié)果與前人報(bào)道的馬鈴薯金線蟲片段大小一致，而針對(duì)馬鈴薯白線蟲設(shè)計(jì)的引物未擴(kuò)增出片段。2022 年，國內(nèi)首次報(bào)道了在四川省和云南省出現(xiàn)馬鈴薯金線蟲[18]，暫無馬鈴薯白線蟲及混合種群的報(bào)道。

云南省馬鈴薯年均種植面積50 萬hm2，鮮薯產(chǎn)量800 萬t，種植面積和產(chǎn)量居全國第4 位，是國內(nèi)馬鈴薯種植大省[1]。馬鈴薯金線蟲為害可使馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)，但其在土壤和植株為害的癥狀不明顯，且其孢囊結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)抗逆性，給病害的發(fā)現(xiàn)和防治帶來困難。馬鈴薯金線蟲是中國重要的入境檢疫性有害生物之一[5]，該線蟲已在貴州、云南和四川等地發(fā)生[22]，應(yīng)采取嚴(yán)格的檢疫措施嚴(yán)防其擴(kuò)散和曼延，在已經(jīng)發(fā)生的種植地應(yīng)結(jié)合種植習(xí)慣、生態(tài)環(huán)境和品種等多因素開展發(fā)生為害規(guī)律及防治技術(shù)研究，為有效控制馬鈴薯金線蟲病提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究樣本符合馬鈴薯金線蟲的特征，確定在云南省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)部分種植地發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯孢囊線蟲為馬鈴薯金線蟲。該線蟲為世界性植物檢疫線蟲，應(yīng)采取嚴(yán)格的檢疫措施避免該線蟲進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。