李晨曉，艾 菊，楊梅宏，高冬麗

(云南師范大學(xué)，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)具有廣泛的種植面積和豐富的淀粉資源。淀粉由D-葡萄糖同聚物構(gòu)成，基于葡聚糖鏈中是否存在分支結(jié)構(gòu)可將淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。塊莖是馬鈴薯淀粉積累的主要器官，葉片合成的蔗糖運輸?shù)今R鈴薯塊莖內(nèi)，在蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy)等多種酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate，G6P)，葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(glucose-6-phosphate translocator，GPT)轉(zhuǎn)運G6P 進入塊莖淀粉體合成淀粉[1]。淀粉前體物質(zhì)腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG-glucose，ADPG)的形成是淀粉合成的關(guān)鍵步驟，ADPG 主要由腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)催化葡萄糖-1-磷酸(glucose 1-phosphate，G1P)形成。ADPG 經(jīng)過顆粒結(jié)合性淀粉合酶(granule-bound starch synthase Ⅰ，GBSS Ⅰ)的催化形成直鏈淀粉，通過可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(debranching enzyme，DBE)等酶的相互協(xié)同作用催化形成支鏈淀粉[2]。ATP/ADP 轉(zhuǎn)運蛋白(ATPADP translocator，NTT)也發(fā)揮著重要的作用，NTT 將ATP 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到質(zhì)體，為淀粉合成提供ATP[3]。

淀粉的積累與淀粉合成酶直接相關(guān)，而淀粉合成酶基因的表達也與蔗糖和植物激素等因素密切相關(guān)。在小麥籽粒中，脫落酸(abscisic acid，ABA)含量與淀粉含量正相關(guān)[4]。ABA 也可以影響籽粒中淀粉合成基因的表述，進而影響淀粉的生物合成。ZHU 等[5]研究表明：水稻上位小穗中的ABA 含量高于下位小穗，且上位小穗中淀粉代謝有關(guān)基因的表達高于下位小穗。小麥灌漿過程中ABA 調(diào)控SuSy2、AGPL1、AGPS1a、GBSS Ⅰ和SBE等關(guān)鍵基因的表達，進而影響直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成[6]。蔗糖是植物生長的能量來源，同時也是信號分子。蔗糖為淀粉合成提供了碳源，在紅薯中外施蔗糖可提高淀粉合成基因的表達，增加淀粉含量[7]。GEIGER 等[8]采用碳14 示蹤技術(shù)研究了添加碳14-蔗糖或碳14-葡萄糖對馬鈴薯離體塊莖代謝的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖可促進離體幼嫩塊莖淀粉含量的增加，而葡萄糖可促進呼吸作用。蔗糖和ABA 協(xié)同作用對籽粒灌漿和淀粉合成具有重要影響。外施蔗糖和ABA，可提高水稻籽粒的淀粉含量、淀粉合成相關(guān)酶活性及其基因表達，同時能夠促進籽粒灌漿，增加產(chǎn)量[9]；LI 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：ABA 或蔗糖單獨處理離體玉米胚乳，對其淀粉含量、AGPase 酶活性及基因表達均有促進作用，但其促進程度遠低于ABA和蔗糖共同處理。

淀粉的合成不僅需要多種酶參與，而且也受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在小麥、玉米和水稻等作物中已經(jīng)報道了多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控淀粉的合成[11]。在馬鈴薯中，淀粉合成基因的功能已被廣泛研究，然而淀粉合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不清楚。以馬鈴薯塊莖為材料，確定能夠促進淀粉合成基因表達的ABA 和蔗糖體系，進而通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，可為解析馬鈴薯淀粉合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供參考。VISSER 等[12]將馬鈴薯GBSS Ⅰ的啟動子連接到β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，GUS)，遺傳轉(zhuǎn)化后獲得了轉(zhuǎn)基因植株，將陽性植株的離體葉片置于高濃度蔗糖溶液中發(fā)現(xiàn)GUS活性明顯增強，說明GBSS Ⅰ的表達受蔗糖誘導(dǎo)。以上試驗檢測的是蔗糖處理下葉片中淀粉合成基因的表達，但適合于馬鈴薯塊莖的ABA 和蔗糖處理體系鮮有報道，淀粉合成基因如何響應(yīng)ABA 和蔗糖處理也知之甚少。本研究以馬鈴薯塊莖為材料，利用文獻報道的3 種體系進行ABA 和蔗糖處理，最終確定能夠誘導(dǎo)淀粉合成相關(guān)基因表達的處理體系，研究結(jié)果可為進一步探索由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的ABA 或蔗糖調(diào)控馬鈴薯淀粉合成機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將苗齡1 個月的二倍體馬鈴薯材料CIP151組培苗種植于云南師范大學(xué)校園溫室內(nèi)。植株生長約3 個月時，收獲直徑約0.5 cm 的幼嫩塊莖，將其橫切為4～5 片備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 淀粉合成基因的篩選

VAN HARSSELAAR 等[13]對馬鈴薯淀粉合成基因進行了全基因組分析，并提供了淀粉合成基因的編號。從Spud DB Potato Genomics Resource(http://spuddb.uga.edu/)下載DM 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并找到VAN HARSSELAAR 等[13]報道的淀粉合成基因在各組織每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片值 (fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM)。根據(jù)FPKM 值，篩選出在塊莖中高表達的基因，用于后續(xù)RT-qPCR分析。

1.2.2 ABA 和蔗糖處理

按照文獻報道，對馬鈴薯塊莖薄片依次進行不同方式的處理，以便最終篩選出能夠促進淀粉合成基因表達的體系。

第1 次處理是按照HUANG 等[14]的報道，略有改動。首先將塊莖薄片用10 mmol/L 嗎啉乙磺酸溶液(pH 6.5)預(yù)處理10～20 min，同時準備以下處理溶液：(1)對照處理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L甘露醇(作為滲透壓的對照)；(2)蔗糖處理：1/2 MS 溶 液+200 mmol/L 蔗 糖；(3) ABA處理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L 甘露醇+100 μmol/L ABA；(4)蔗糖+ABA 處理：1/2 MS 溶液+200 mmol/L 蔗糖+100 μmol/L ABA。將處理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入預(yù)處理后的塊莖薄片6～9 片，將三角瓶置于搖床(28 ℃，60 r/min)黑暗處理 24 h。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。

第2 次是根據(jù)GEIGER 等[8]的報道。首先將塊莖薄片在10 mmol/L 嗎啉乙磺酸溶液(pH 6.5)中預(yù)處理10～20 min，同時準備以下處理溶液：(1)對照處理：嗎啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 甘露醇；(2)蔗糖處理：10 mmol/L 嗎啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 蔗糖；(3) ABA 處理：嗎啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 甘露醇+100 μmol/L ABA；(4)蔗糖+ABA 處理：10 mmol/L 嗎啉乙磺酸溶液+200 mmol/L 蔗糖+100 μmol/L ABA。將處理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入預(yù)處理后的塊莖薄片6～9 片，將三角瓶置于搖床(22 ℃，90 r/min)黑暗處理 30 min。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。

第3 次處理是按照HU 等[15]的報道。準備以下處理溶液：(1)對照：基礎(chǔ)溶液(20 mmol/L 氯化鈣+20 mmol/L 琥珀酸鈉+10 μmol/L 氯霉素，pH 5.0)+200 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L 葡萄糖；(2)蔗糖處理：基礎(chǔ)溶液+200 mmol/L 蔗糖；(3) ABA 處理：基礎(chǔ)溶液+200 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L 葡萄糖+100 μmol/L ABA；(4)基礎(chǔ)溶液+200 mmol/L蔗糖+100 μmol/L ABA。將處理溶液各取5 mL 放置于100 mL 三角瓶中，每瓶加入預(yù)處理后的塊莖薄片6～9 片，將三角瓶置于搖床(28 ℃)黑暗靜置36 h。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。

1.2.3 RT-qPCR

為了便于分析ABA 和蔗糖處理的效果，采用RT-qPCR 技術(shù)檢測基因的表達量。將處理完的塊莖薄片用濾紙輕輕拭干水分，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以Actin為內(nèi)參基因，對12 個基因進行qRT-PCR，各基因的引物序列見表1。qRT-PCR 反應(yīng)體系為2×TB Green Premix ExTaqTMⅡ 10.0 μL，稀釋到1 000 μmol/L 的特異PCR 上、下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，稀釋5 倍的cDNA 2.0 μL，加RNase ddH2O至總體積為20.0 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。為建立 PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，待擴增反應(yīng)結(jié)束后，按95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s；并從 60 ℃ 緩慢升溫到 95 ℃。每個反應(yīng)3 次生物學(xué)重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量[16]。

表1 RT-qPCR 所用引物Tab.1 Primers used for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選的塊莖淀粉合成基因

根據(jù)淀粉合成基因的FPKM 值，篩選出12 個在塊莖中高表達的基因(表2)。這些基因的表達豐度有所差異，如SuSy4、GPT2.1、NTT2、APL3、AGPS1.1和GBSS Ⅰ的表達豐度總體上高于SBE3、SS2、SS3、SS5、ISA1.1和ISA2，且這些基因在塊莖的表達量均高于在其他組織的表達量。

表2 淀粉合成基因的FPKM 值Tab.2 FPKM value of starch synthesis-related genes

2.2 ABA 和蔗糖處理體系比較

第1 次處理的基因表達檢測結(jié)果(圖1a～c)表明：APL3的表達受ABA 和蔗糖誘導(dǎo)，但GBSS Ⅰ的表達受ABA 和蔗糖的抑制，鑒于該結(jié)果與文獻報道[12]相矛盾，故對塊莖切片進行了第2 次處理。qRT-PCR 結(jié)果(圖1d～f)表明：第2 次處理對SBE3和GBSS Ⅰ的表達影響較小。第1、2 次處理都未能有效地促進合成基因表達，故對塊莖切片進行了第3 次處理。qRT-PCR 結(jié)果(圖1g～i)表明：第3 次處理對SBE3的表達影響不大，即處理造成的表達不高于對照的2 倍，但提高了GBSS Ⅰ和APL3的表達，尤其是與對照相比，蔗糖處理使APL3的表達提高了約8 倍、使GBSSⅠ的表達提高了約9 倍，說明此次處理能夠提高淀粉合成基因的表達。

圖1 第1 次(a～c)、第2 次(d～f)和第3 次(g～i)處理的GBSS Ⅰ、SBE3 和APL3 基因表達量Fig.1 Expression levels of GBSS Ⅰ,SBE3 and APL3 under the 1st (a-c),the 2nd (d-f),and the 3rd (g-i) treatment

2.3 ABA 和蔗糖處理下淀粉合成基因的表達

確定第3 次處理為可行的處理體系后，進一步檢測了SuSy4、GPT2.1、NTT2、AGPS1.1、SS2、SS3、SS5、ISA1.1和ISA2基因在第3 次處理下的表達情況。結(jié)果(圖2)表明：與對照相比，ABA處理可誘導(dǎo)SS5、ISA1.1、AGPS1.1、GPT2.1和NTT2基因表達量升高，其中SS5基因的誘導(dǎo)表達量較高，為對照的3.5 倍；蔗糖處理可誘導(dǎo)SS3、SuSy4、ISA1.1、AGPS1.1、GPT2.1和NTT2基因表達量升高，其中GPT2.1基因誘導(dǎo)表達量最高，為對照的38 倍。以上結(jié)果說明大部分淀粉合成基因的表達都受ABA 和蔗糖誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)表達程度有較大差異。

圖2 不同處理下淀粉合成途徑相關(guān)基因的表達量Fig.2 Expression levels of starch synthesis-related genes under different treatments

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：第3 次處理使用的溶液和條件能夠誘導(dǎo)GBSS Ⅰ和APL3表達；進一步檢測SuSy4等9 個基因的表達發(fā)現(xiàn)：大部分合成基因都正向響應(yīng)蔗糖或ABA 處理，這與文獻報道[17]一致。CHEN 等[17]研究發(fā)現(xiàn)：雖然蔗糖單獨處理能誘導(dǎo)玉米胚乳淀粉合成基因的表達，但蔗糖和ABA共同處理能更有效地誘導(dǎo)基因表達。從本研究檢測的淀粉合成基因來看，ABA 和蔗糖共同處理誘導(dǎo)了大部分淀粉合成基因的表達，但除SuSy4外，兩者共同處理的誘導(dǎo)效果并不優(yōu)于ABA 或蔗糖單獨處理。轉(zhuǎn)錄水平的差異性可能是試驗所用組織和處理條件不同所致。

馬鈴薯中報道的可溶性淀粉合成酶包括SS Ⅰ、SS Ⅱ和SS Ⅲ。SS Ⅰ主要在葉片中表達，負責(zé)葉片中瞬時淀粉的合成[18]。SS Ⅲ是塊莖中主要的可溶性淀粉合成酶，在塊莖中沉默SS Ⅲ導(dǎo)致其喪失了80%的活性，從而降低了支鏈淀粉的合成，并改變了淀粉顆粒的形狀[19]。同時沉默SS Ⅱ和SS Ⅲ，其淀粉顆粒形狀的缺陷更加明顯[19-20]，說明SS Ⅱ和SS Ⅲ在功能上具有冗余性。VAN HARSSELAAR 等[13]對馬鈴薯淀粉合成基因進行了全基因組分析，找到1 個在塊莖中特異表達的SS5，其表達受ABA 和ABA+蔗糖處理的誘導(dǎo)。馬鈴薯SS5的表達特異性及誘導(dǎo)表達的特點暗示SS5 可能參與淀粉合成，其功能值得深入研究。

淀粉生物合成受到一系列酶的協(xié)同調(diào)控，淀粉合成相關(guān)酶的磷酸化以及復(fù)合體的形成等都對淀粉合成具有重要作用[21]。同時，越來越多的證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控對淀粉生物合成具有重要作用[11]。HUANG 等[14]對玉米胚乳進行了ABA、蔗糖和ABA+蔗糖處理，對處理后的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)：有57 個轉(zhuǎn)錄因子在3 種處理后共同上調(diào)或下調(diào)，其中的47 個在胚乳中表達較高；對其中的1 個AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子ZmEREB156分析發(fā)現(xiàn)該蛋白可以結(jié)合合成基因的啟動子。HU 等[15]對玉米籽粒進行葡萄糖、蔗糖、赤霉素和脫落酸處理，發(fā)現(xiàn)只有脫落酸處理能夠誘導(dǎo)SS Ⅰ表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)SS Ⅰ啟動子中的CACCG 是響應(yīng)ABA 誘導(dǎo)的核心結(jié)構(gòu)域，AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子ABI4 能夠結(jié)合CACCG，從而調(diào)控淀粉合成。大麥淀粉去分支酶基因ISA1的啟動子含有糖響應(yīng)元件SURE，且ISA1的表達受蔗糖誘導(dǎo)[22]，以甘薯中結(jié)合SURE 元件的轉(zhuǎn)錄因子同源序列為探針，在大麥胚乳cDNA 文庫中篩選出1 個WRKY 家族蛋白SUSIBA2，它能夠結(jié)合ISA1啟動子的SURE 元件，從而調(diào)控大麥籽粒淀粉合成。以上研究為闡明ABA 和蔗糖促進淀粉合成提供了理論依據(jù)。目前，馬鈴薯塊莖淀粉合成轉(zhuǎn)錄因子尚無報道，確定有效的脫落酸和蔗糖誘導(dǎo)體系有利于通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，從而為解析馬鈴薯淀粉合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供參考。

4 結(jié)論

本研究確定了第3 次處理使用的溶液(含有氯化鈣、琥珀酸鈉和氯霉素等試劑)和條件(28 ℃黑暗處理36 h)適用于馬鈴薯塊莖ABA 和蔗糖處理。在該處理體系下，大部分淀粉合成基因的表達都受到ABA 和蔗糖誘導(dǎo)。誘導(dǎo)體系的建立為進一步解析ABA 和蔗糖介導(dǎo)的馬鈴薯淀粉合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。