馮蒙蒙，林永新*，樊劍波，賀紀正

溫度和氮添加對旱地紅壤反硝化功能基因豐度的影響①

馮蒙蒙1,2，林永新1,2*，樊劍波3，賀紀正1,2

(1 濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地，福州 350007；2 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福州 350007；3 中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008)

研究旱地紅壤反硝化微生物功能基因Ⅰ和Ⅱ的豐度對溫度和氮添加的響應(yīng)，可為農(nóng)田紅壤養(yǎng)分管理和生態(tài)環(huán)境保護提供指導(dǎo)和建議。本研究以長期常規(guī)氮磷鉀施肥的旱地紅壤為研究對象，設(shè)置3個氮添加(N 0、25、50 mg/kg)處理和3個溫度處理(15、25、35 ℃)進行微宇宙培養(yǎng)試驗，在培養(yǎng)的7和30 d后破壞性采集土樣，進行土壤DNA提取，測定反硝化微生物功能基因豐度。結(jié)果表明：培養(yǎng)7 d后，Ⅰ和Ⅱ基因豐度均在25 ℃ 時最高；培養(yǎng)30 d后，Ⅰ和Ⅱ基因豐度在15 ℃ 時最高，且隨著溫度升高而下降。氮添加對反硝化微生物功能基因豐度無顯著影響。3因素方差分析表明，溫度、氮添加和培養(yǎng)時間的交互作用顯著影響反硝化微生物功能基因豐度。綜上，旱地農(nóng)田反硝化功能基因豐度受氮添加影響較小，但受溫度顯著影響，其豐度可能會呈現(xiàn)出日變化和季節(jié)變化，在土壤采樣和氧化亞氮動態(tài)監(jiān)測時應(yīng)特別注意。

紅壤；溫度；氮添加；反硝化微生物

反硝化過程是指硝態(tài)氮被逐步還原成亞硝態(tài)氮、一氧化氮、氧化亞氮(N2O)和氮氣的過程，是氮循環(huán)的重要組成部分。反硝化過程是農(nóng)田N2O產(chǎn)生的主要途徑[1]，由微生物驅(qū)動完成，其中亞硝態(tài)氮還原基因和是N2O產(chǎn)生的關(guān)鍵基因，而N2O還原基因I和Ⅱ編碼的酶是目前已知去除N2O的唯一生物途徑[2]。因此，I和Ⅱ的豐度和活性直接影響著土壤N2O的排放強度[3]，與全球氣候變化息息相關(guān)。溫度是影響微生物生長和活性的重要因素，而氮添加可為反硝化微生物提供底物，因此，研究溫度和氮添加對反硝化微生物功能基因豐度的影響可為旱地農(nóng)田紅壤養(yǎng)分管理提供指導(dǎo)和建議。

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，溫度可以通過影響土壤微環(huán)境、養(yǎng)分有效性、土壤呼吸和微生物群落結(jié)構(gòu)等，從而影響反硝化微生物功能基因和N2O排放[4-5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在濕地土壤中基因豐度主要受溫度影響，在低溫條件下豐度最高，而受溫度影響較小[6]；在黑土中，只有基因的群落結(jié)構(gòu)對溫度敏感，且基因豐度與N2O排放顯著相關(guān)[7]；在紅壤中，低溫有利于維持反硝化微生物豐度，但顯著抑制反硝化微生物活性[8]。另有研究表明，高溫顯著抑制紅壤反硝化微生物的生長和活性[9]。因此，溫度對土壤反硝化微生物豐度和活性的影響仍存在較大不確定性。此外，施用氮肥是提高土壤肥力和作物產(chǎn)量的重要田間管理措施，可為土壤微生物提供能量與基質(zhì)[10]。施用氮肥對反硝化微生物功能基因的影響已有大量報道，但結(jié)果差異較大。例如，Hallin等[11]發(fā)現(xiàn)，長期施用硫酸銨顯著降低和基因豐度；Ouyang等[12]則發(fā)現(xiàn)，施用氮肥可以提高和基因豐度。在紅壤中，施用氮肥對反硝化微生物的影響同樣存在爭議。Xiao等[13]研究指出，有機無機肥配施顯著增加紅壤和基因豐度；宛頌等[14]則發(fā)現(xiàn)，施用化肥顯著增加旱地紅壤基因豐度，但對、Ⅰ和Ⅱ基因豐度無顯著影響。然而，施用化肥也可能對紅壤所有反硝化微生物豐度無顯著影響[15]。因此，溫度和氮添加對反硝化微生物功能基因豐度的影響仍存在較大爭議，有待進一步研究。

另外，前人對基因的研究大多只關(guān)注Ⅰ，對后發(fā)現(xiàn)的Ⅱ關(guān)注較少。自2012年Ⅱ發(fā)現(xiàn)以來，截至2019 年僅有22% 的研究提到Ⅱ[16]。然而，Jones等[17]發(fā)現(xiàn)，環(huán)境樣品中Ⅱ的基因豐度與Ⅰ相當或更高，暗示著Ⅱ基因可能在N2O還原過程中起著重要作用。Xu等[18]則進一步研究表明，Ⅱ在農(nóng)田土壤中可能扮演著比Ⅰ更重要的角色。盡管Ⅱ不斷引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但農(nóng)田土壤中Ⅱ?qū)囟群偷砑拥捻憫?yīng)研究幾乎處于空白，制約著對反硝化過程的整體認識。因此，系統(tǒng)研究Ⅰ和Ⅱ基因豐度對溫度和氮添加的響應(yīng)具有重要意義。

紅壤廣泛分布于我國熱帶和亞熱帶地區(qū)，總面積達204萬km2，約占國土面積的21%[19]，是重要的農(nóng)業(yè)土壤資源。那么，紅壤中反硝化微生物功能基因Ⅰ和Ⅱ的豐度對溫度和氮添加響應(yīng)如何？基于該科學(xué)問題，本研究設(shè)計了不同溫度梯度和氮添加水平的培養(yǎng)試驗，以期深入了解旱地紅壤反硝化微生物功能基因?qū)囟群偷砑拥捻憫?yīng)，為農(nóng)田紅壤養(yǎng)分管理和生態(tài)環(huán)境保護提供指導(dǎo)和建議。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西省鷹潭市中國科學(xué)院鷹潭紅壤生態(tài)實驗站(28°15′20″N，116°55′30″E)，該區(qū)域?qū)儆谥衼啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年平均降水量1 795 mm，年平均氣溫為17.6 ℃。供試土壤為第四紀紅色黏土發(fā)育而來的典型紅壤。

試驗樣地建設(shè)于1988年4月，在1995年以前耕作方式為花生和油菜連作，之后改為夏季花生、冬季休耕的耕作方式。選取當?shù)爻Ｒ?guī)施肥處理的土壤為研究對象，設(shè)置3個重復(fù)。該處理每年施肥量為N 120 kg/hm2的尿素、P 30 kg/hm2的鈣鎂磷肥和K 90 kg/hm2的氯化鉀，每年4月10日一次性施肥，田間管理措施與當?shù)爻Ｒ?guī)田間管理措施一致。于2019年10月17日，在3個小區(qū)內(nèi)分別按照五點采樣法采集表層土壤(0 ～ 20 cm)5個，將每個小區(qū)的5個土芯混合均勻，形成1個混合樣品，放置在裝有冰袋的保溫箱中立即送回實驗室處理。在微宇宙培養(yǎng)前，用無菌鑷子除去碎石和細根等雜物后過2 mm篩。土壤基本理化性質(zhì)的測定按照文獻[20]描述的方法進行，供試土壤的基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 微宇宙培養(yǎng)試驗

稱取10 g新鮮土壤(烘干重計)于100 mL血清瓶中，分別加入相當于N 0、25、50 mg/kg的硫酸銨溶液，并添加無菌水調(diào)節(jié)土壤含水量至60% 田間持水量。每個處理設(shè)置18次重復(fù)，隨機分為3組，分別放在15、25、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱，作為溫度處理，避光培養(yǎng)30 d。在培養(yǎng)過程中，每隔2 d打開一次血清瓶進行換氣保證好氧培養(yǎng)條件，并根據(jù)重量補充培養(yǎng)過程中所損失的水分。在培養(yǎng)的7和30 d后破壞性采集土樣，隨后將采集的土壤儲存在–80 ℃下用于土壤DNA提取。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

注：表中的數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤；SOC代表土壤有機碳；DOC代表可溶性有機碳；TN代表全氮；NH4+-N代表銨態(tài)氮；NO3?-N代表硝態(tài)氮；AP代表有效磷。

1.3 土壤總DNA提取和實時熒光定量PCR

土壤總DNA提取使用FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)試劑盒，按照說明書操作步驟進行。、、I和II的基因豐度采用定量PCR(qPCR)方法利用CFX384 Optical Real-Time Detection System (Bio- Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，美國)儀器進行測定。使用的引物序列、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和標準曲線同宛頌等[14]。每個樣品重復(fù)3次，并設(shè)置3個陰性對照。根據(jù)標準曲線計算反硝化功能基因的豐度。本試驗中各反應(yīng)的熔解曲線均為單峰，擴增效率均介于90% ～ 100%，2均為0.999。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件進行。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各處理間反硝化功能基因豐度的差異。采用3因素方差分析(Three-factor ANOVA)探討溫度、氮添加和培養(yǎng)時間及其交互作用對反硝化功能基因豐度的影響。所有數(shù)據(jù)在分析之前進行同質(zhì)性和正態(tài)分布檢驗。采用鄧肯法(Duncan’s test)進行差異顯著性檢驗(=0.05)。采用OriginPro 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和氮添加對nirS和nirK基因豐度的影響

從圖1可以看出，不同處理土壤基因豐度為4.29×106～ 6.49×107copies/g。在培養(yǎng)7 d后，基因平均豐度在25 ℃ 時最高，為3.09×107copies/g；當溫度升高至35 ℃ 時，基因平均豐度顯著降低至6.22×106copies/g；而溫度降低至15 ℃ 時，基因平均豐度與25 ℃ 時差異不顯著。在培養(yǎng)30 d后，基因豐度在15 ℃ 時最高，為2.44×107～ 3.16×107copies/g。隨著培養(yǎng)溫度增加基因豐度顯著降低，在35 ℃ 時最低，為6.38×106copies/g。

對于基因，在培養(yǎng)7 d后，其平均豐度在25 ℃ 時最高，為2.76×107copies/g；35 ℃ 時顯著降低至7.28×106copies/g，而15 ℃ 時與25 ℃ 時無顯著差異。在培養(yǎng)30 d后基因豐度隨著溫度增加而降低，在15 ℃ 時最高，為2.32×107copies/g (圖1)。

此外，與無氮添加處理相比，氮添加處理對土壤和基因豐度均無顯著性影響(圖1)。通過3因素方差分析發(fā)現(xiàn)，溫度、溫度和培養(yǎng)時間、氮添加和培養(yǎng)時間、溫度與氮添加和培養(yǎng)時間的交互作用顯著影響和基因豐度(表2)。

2.2 溫度和氮添加對nosZ I和nosZ II 基因豐度的影響

由圖2可知，在培養(yǎng)7 d后，不同處理土壤中Ⅰ 基因豐度為9.60×106～ 7.80×107copies/g。在25 ℃ 時Ⅰ 基因平均豐度最高，為4.81×107copies/g，當培養(yǎng)溫度升高至35 ℃ 或者降低至15 ℃時，Ⅰ 基因豐度顯著下降。在培養(yǎng)30 d后，Ⅰ 基因豐度隨著培養(yǎng)溫度增加顯著降低，在35 ℃ 時Ⅰ 基因豐度最低為1.13×107copies/g。

對于Ⅱ基因，在培養(yǎng)7 d后，3種溫度處理對其豐度均無顯著性影響。但培養(yǎng)30 d后，Ⅱ基因豐度隨著溫度升高而顯著降低，在15 ℃ 時平均豐度最高，為5.72×107copies/g(圖2)。

此外，不同氮添加處理土壤中Ⅰ和Ⅱ的基因豐度無顯著性差異(圖2)。3因素方差分析結(jié)果表明，溫度、溫度和培養(yǎng)時間、溫度與氮添加和培養(yǎng)時間的交互作用會顯著影響Ⅰ和Ⅱ基因豐度。此外，I基因豐度還受氮添加以及溫度和氮添加的交互作用影響(表2)。

3 討論

研究表明，增溫會通過影響土壤微生物的活性，加速土壤氮素礦化，對土壤氮循環(huán)過程產(chǎn)生深遠的影響[21]。反硝化過程是氮循環(huán)的重要組成部分，調(diào)控著氮素的還原與轉(zhuǎn)化，在土壤N2O的排放中扮演重要角色。土壤反硝化微生物功能基因豐度可以一定程度上反映土壤的反硝化潛力[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)7 d后，和基因豐度在25 ℃ 時最高，表明和基因型微生物在短期內(nèi)更喜好25 ℃ 的生存環(huán)境，低溫和高溫均不利于其生長。然而，隨著時間推移，在培養(yǎng)30 d后，和基因豐度在15 ℃ 時最高，且隨著溫度升高而下降。這可能是由于和基因型微生物對15 ℃ 有更好的適應(yīng)性，能夠?qū)⒏嗟哪芰坑糜谧陨淼纳L。這與Lee和Francis[6]在舊金山灣沉積物中的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)的基因豐度在溫度最低的冬季時最高，表明這類微生物喜好低溫環(huán)境。最近的一項meta分析同樣表明，增溫分別降低陸地生態(tài)系統(tǒng)和基因豐度31% 和26%[5]。一方面，這可能是因為和基因型微生物喜好相對厭氧的環(huán)境[23]，溫度升高會促進土壤的水分蒸發(fā)，使得土壤水分含量下降，趨于干燥，從而不利于反硝化微生物的生長；另一方面，溫度升高使土壤的氮素周轉(zhuǎn)加快，反硝化微生物的底物供應(yīng)不足，從而不利于和基因型微生物的生長[24]。

(圖A、圖C為培養(yǎng)7、30 d后溫度對nirK和nirS基因豐度的影響；圖B、圖D為培養(yǎng)7、30 d后氮添加對nirK和nirS基因豐度的影響。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)；框中的橫線表示中位數(shù)，框的底部和頂部分別代表下四分位數(shù)和上四分位數(shù)，在框上方和下方延伸的線和點表示異常值；下同)

表2 溫度、氮添加和培養(yǎng)時間對反硝化功能基因豐度影響的3因素方差分析

注：*表示在<0.05水平上影響顯著，**表示在<0.01水平上影響顯著，***表示在<0.001水平上影響顯著。

(圖A、圖C為培養(yǎng)7、30 d后溫度對nosZ Ⅰ和nosZⅡ基因豐度的影響；圖B、圖D為培養(yǎng)7、30 d后氮添加對nosZ I和nosZ II基因豐度的影響)

本研究發(fā)現(xiàn)，氮添加對土壤和基因豐度沒有顯著影響，這和大多數(shù)以往的研究不同。一項針對農(nóng)田土壤的meta分析發(fā)現(xiàn)，施用氮肥分別顯著提高和基因豐度40% 和53%[12]。Yang等[25]同樣發(fā)現(xiàn)，施用氮肥會顯著影響農(nóng)田土壤和基因豐度和群落結(jié)構(gòu)。然而，Xiao等[13]認為，的基因豐度和群落結(jié)構(gòu)受有機肥的影響更大，化肥的影響相對較小。本研究中，和基因豐度不受氮添加影響，這可能是由于供試土壤是長期(32年)施肥的土壤，土壤中的反硝化微生物已經(jīng)長期適應(yīng)氮添加的環(huán)境[26]，因此，反硝化微生物豐度對氮添加響應(yīng)不強烈。Tian等[27]同樣發(fā)現(xiàn)，氮添加對土壤反硝化基因豐度沒有顯著影響。此外，Ning等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低氮添加處理會顯著增加基因豐度，而高氮添加處理會顯著降低基因豐度，因此，氮添加量會顯著影響反硝化微生物功能基因豐度對氮添加的響應(yīng)。與Ning等[28]研究相比，本研究的氮添加量介于低氮和高氮之間，這可能是和基因豐度對氮添加沒有響應(yīng)的一個因素。當然，也有可能是由于30 d的培養(yǎng)時間還不足以使供試土壤反硝化微生物豐度發(fā)生變化。

和和基因類似，Ⅰ 和Ⅱ基因豐度培養(yǎng)7 d后在25 ℃ 時最高，而在培養(yǎng)30 d后隨著溫度升高而降低。反硝化和基因是產(chǎn)生N2O的關(guān)鍵基因，而N2O是Ⅰ 和Ⅱ型微生物的底物[29]。因此，Ⅰ和Ⅱ基因豐度可能受底物影響，與和基因豐度呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。Xing等[30]同樣發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)在15 ～ 35 ℃ 溫度范圍內(nèi)受溫度顯著影響。相反，Li等[4]發(fā)現(xiàn)，基因豐度不受溫度影響。因此，Ⅰ和Ⅱ基因豐度對溫度的響應(yīng)可能受土壤理化性質(zhì)和微生物的群落結(jié)構(gòu)控制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，氮添加對土壤Ⅰ和Ⅱ基因豐度無顯著影響，一方面可能是由于Ⅰ和Ⅱ基因型微生物在土壤環(huán)境中具有較強的適應(yīng)能力，對氮添加可能有較好的適應(yīng)性[31]；另一方面可能是由于和基因豐度不受氮添加影響，導(dǎo)致Ⅰ和Ⅱ基因型微生物的底物來源不變。綜上，溫度變化顯著影響反硝化功能基因豐度，而氮添加對反硝化功能基因豐度的影響較小(圖3)。因此，土壤反硝化微生物功能基因豐度可能會呈現(xiàn)出季節(jié)性差異，也可能隨著晝夜溫差發(fā)生改變，在土壤采樣時應(yīng)特別注意。此外，不同的反硝化微生物功能基因之間對溫度和氮添加呈現(xiàn)出相似的響應(yīng)規(guī)律，表明這幾類反硝化微生物之間存在著一定的聯(lián)系。

圖3 溫度和氮添加對反硝化基因豐度影響的概念圖

4 結(jié)論

供試紅壤在微宇宙試驗中培養(yǎng)7 d后，Ⅰ和Ⅱ基因豐度均在25 ℃ 時最高；隨著時間推移，在培養(yǎng)30 d后各基因豐度在15 ℃ 時最高，且隨著溫度升高而下降。氮添加對土壤Ⅰ和Ⅱ基因豐度無顯著影響?？梢?，反硝化功能基因豐度受溫度顯著影響，而受氮添加的影響較小。

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Effects of Temperature and Nitrogen Addition on Abundance of Denitrifying Functional Genes in Upland Ultisol

FENG Mengmeng1,2, LIN Yongxin1,2*, FAN Jianbo3, HE Jizheng1,2

(1 Cultivation Base of State Key Laboratory for Subtropical Mountain Ecology, Fuzhou 350007, China; 2 School of Geographical Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

Investigating how the abundance of denitrifying functional genes,,ⅠandⅡ respond to temperature and nitrogen addition in upland Ultisol can provide guidance for agricultural nutrient management and environmental protection in this region. In this study, soils were sampled from a long-term fertilization experiment and used for a microcosm incubation experiment under the conditions of three nitrogen addition treatments: N 0, 25, and 50 mg/kg, and three temperature levels at 15, 25, and 35 °C. Soils were incubated in the dark and destructively sampled on days 7 and 30 of incubation. After sampling, soil DNA was extracted, and the abundances of denitrifying functional genes were determined by real-time quantitative PCR. Results showed that the abundances of,,ⅠandⅡ genes were the highest at 25 ℃ after 7-day incubation. However, after 30-day incubation, the abundances of,,ⅠandⅡ genes were the highest at 15 ℃ and were decreased with increasing temperature. Moreover, nitrogen addition had no significant effect on the abundances of all the denitrifying functional genes. In addition, three-way ANOVA showed that the interactions of temperature, nitrogen addition and incubation time significantly influenced the abundances of denitrifying functional genes. Overall, the abundances of denitrifying functional genes are substantially influenced by temperature but less affected by the nitrogen addition. The abundances of denitrifying functional genes may vary considerably on both a daily and seasonal basis, and this should be taken into consideration during soil sampling and nitrous oxide emission measuring.

Ultisol; Temperature; Nitrogen addition; Denitrifiers

S154.36

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.03.013

馮蒙蒙, 林永新, 樊劍波, 等. 溫度和氮添加對旱地紅壤反硝化功能基因豐度的影響. 土壤, 2023, 55(3): 562–568.

國家自然科學(xué)基金項目(41930756，42077041)和福建省自然科學(xué)基金項目(2020J01187)資助。

(yxlin@fjnu.edu.cn)

馮蒙蒙(1996—)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要研究方向為土壤氮循環(huán)微生物。E-mail: 1923005353@qq.com