洪 倩 馬增春 王增慧 韓 莉 王 青 楊 陽(yáng)

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院/解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院,徐州,221004; 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京,100850)

小兒柴桂退熱口服液是小兒外感發(fā)熱后臨床常用的退熱中藥復(fù)方制劑,由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黃芩、白芍、蟬蛻7味藥材組方制備而成,主要用于治療小兒發(fā)熱、頭身痛、流涕、口渴、咽紅、溲黃、便干等癥[1]。該藥功效確切、不良反應(yīng)較小且質(zhì)量穩(wěn)定,已被2020版《中華人民共和國(guó)藥典(一部)》成方制劑收載。

本研究擬探討小兒柴桂退熱口服液對(duì)酵母發(fā)熱模型大鼠的退熱作用,并通過(guò)檢測(cè)大鼠血清炎癥介質(zhì)以及下丘腦發(fā)熱中樞介質(zhì)的含量變化,闡明其作用機(jī)制,以期為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支撐及參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)SD大鼠70只,2～3周齡,體質(zhì)量160～180 g,購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):2008001649301。飼養(yǎng)于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)溫度24～28 ℃,相對(duì)濕度60%～80%,通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):LL-2019DW01)。

1.1.2 藥物 小兒柴桂退熱口服液(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):1810014),規(guī)格10 mL/支;右旋布洛芬口服混懸液(湖北唯森制藥有限公司,批號(hào):20180705),規(guī)格100 mL:2 g。

1.1.3 試劑與儀器 高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司,批號(hào):20181128W),5 g/袋;白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(北京晶美生物科技有限公司,批號(hào):20161223);一氧化氮(Nitric Oxide,NO)檢測(cè)試劑盒(硝酸還原酶法)(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20170227);髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)檢測(cè)試劑盒(硝酸還原酶法)(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20170802);大鼠前列腺素E2(地諾前列酮,Prostaglandin E2,PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號(hào):20161225);大鼠環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號(hào):20160915);電子體溫計(jì)[歐姆龍(大連)有限公司,型號(hào):MC-686型];電子分析天平(最大載荷220 g,分度值0.1 mg)(Sartorius公司,德國(guó),型號(hào):Quintix 224-1CN);冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):Centrfuge 5840);全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司,型號(hào):r-911);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(常州三豐儀器科技有限公司,型號(hào):BG-XM496)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱(chēng)取10 g干酵母,置于玻璃研缽,逐漸加入生理鹽水研磨成均勻混懸液,定容,配制成20%酵母混懸液,現(xiàn)配現(xiàn)用。于造模實(shí)驗(yàn)前1 d測(cè)量大鼠肛溫,將電子體溫計(jì)末端涂少量開(kāi)塞露,輕緩送入大鼠肛門(mén)約2 cm處,待溫度計(jì)穩(wěn)定發(fā)出蜂鳴聲后讀數(shù),間隔30 min后再次測(cè)量1次,取2次測(cè)量的平均值作為大鼠基礎(chǔ)體溫。通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取9只大鼠作為空白組。造模實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,其余大鼠以10 mL/kg劑量于大鼠皮下注射20%酵母混懸液,6 h后同法測(cè)量大鼠體溫,選擇體溫較基礎(chǔ)體溫升高0.6 ℃以上者為造模成功大鼠。篩選造模成功大鼠45只,通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組,分別為模型組、布洛芬組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)、柴桂低劑量組、柴桂中劑量組、柴桂高劑量組,每組9只。

1.2.2 給藥方法 分組后立即進(jìn)行給藥,空白組和模型組均給予0.75 mL/kg生理鹽水溶液灌胃,布洛芬組給予0.75 mL/kg右旋布洛芬口服混懸液灌胃,柴桂低、中、高劑量組分別以1.25 mL/kg、2.5 mL/kg、5 mL/kg小兒柴桂退熱口服液灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 于注射酵母混懸液7 h(即藥物干預(yù)后1 h)、8 h(即藥物干預(yù)后2 h)后分別同法測(cè)量并記錄各組大鼠體溫。隨后,以0.03 mL/kg劑量將10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉各組大鼠,迅速于腹主動(dòng)脈穿刺采血5 mL,靜置30 min后,置于離心機(jī)內(nèi),960×g,離心10 min,吸取上層血清,檢測(cè)IL-1β、NO、MPO含量。采血后,立即斷頭處死大鼠,于冰上迅速剝離大鼠下丘腦部位,置于-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取各組大鼠下丘腦腦組織約5 mg，精密稱(chēng)定，置于玻璃勻漿器中，定量加入生理鹽水溶液(腦組織與生理鹽水質(zhì)量比為1∶9)，研磨制成勻漿，置于離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，960×g，離心15 min，吸取上清液，檢測(cè)PGE2、cAMP含量。

2 結(jié)果

2.1 小兒柴桂退熱口服液對(duì)酵母發(fā)熱模型大鼠體溫的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,皮下注射20%酵母混懸液6 h后,各組大鼠體溫均升高(>0.6 ℃)。與模型組比較,退熱治療1 h、2 h后各給藥組大鼠體溫升高幅度均有所降低(均P<0.01),且隨著時(shí)間延長(zhǎng)體溫下降趨勢(shì)越顯著;退熱治療1 h后,柴桂各劑量組大鼠體溫均顯著高于布洛芬組(均P<0.01),退熱治療2 h后,柴桂低、中劑量組大鼠體溫仍顯著高于布洛芬組(均P<0.01),而柴桂高劑量組大鼠與布洛芬組大鼠體溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠治療前后體溫比較注:與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△△P<0.01

2.2 小兒柴桂退熱口服液對(duì)酵母發(fā)熱模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量的影響 與空白組比較,除布洛芬組大鼠血清IL-1β外,其余各給藥大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較,布洛芬組、柴桂各劑量組大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);柴桂各劑量組的效應(yīng)強(qiáng)度與劑量正相關(guān),但均弱于布洛芬組。僅柴桂高劑量組與布洛芬組大鼠血清IL-1β差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 治療后2 h各組大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量比較注:與空白組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.3 小兒柴桂退熱口服液對(duì)模型大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量的影響 與空白組比較,除布洛芬組大鼠腦組織PGE2外,其余各給藥大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較,布洛芬組、柴桂各劑量組大鼠腦組織PGE2、cAMP含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);柴桂各劑量組的效應(yīng)強(qiáng)度與劑量正相關(guān),但均弱于布洛芬組。柴桂高劑量組與布洛芬組大鼠腦組織cAMP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 治療后2 h各組大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量比較注:與空白組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△△P<0.01

3 討論

發(fā)熱是由于疾病或病原體入侵機(jī)體引起的常見(jiàn)臨床癥狀[2],其發(fā)生機(jī)制為外源性致熱源激活機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的內(nèi)源性致熱源,通過(guò)發(fā)熱中樞介質(zhì)作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,引起機(jī)體發(fā)熱[3-4]。兒童正處于身體生長(zhǎng)階段,體溫中樞系統(tǒng)發(fā)育不夠健全,調(diào)節(jié)功能比較差,加之對(duì)疾病的抵抗能力偏弱,容易受到各種疾病及炎癥等不良因素的侵襲,以致引起發(fā)熱。通常情況下,父母親會(huì)非常擔(dān)心發(fā)熱對(duì)孩子產(chǎn)生不良影響[5]。在臨床實(shí)踐中,使用解熱類(lèi)藥物治療兒童發(fā)熱性疾病較為普遍。例如,布洛芬是發(fā)熱兒童退熱最廣泛可用和最常用的非處方藥之一,可有效退熱且耐受性良好[6]。但是,解熱類(lèi)藥物容易產(chǎn)生胃腸道出血、胃灼熱、消化不良、惡心嘔吐等不良反應(yīng);也有可能增加嚴(yán)重感染的死亡率、延長(zhǎng)病毒消除時(shí)間并減弱機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)[7]。且解熱類(lèi)藥物還存在多種與藥物相關(guān)的危害,例如:布洛芬等藥物具有引起藥物不良反應(yīng)的可能[8];過(guò)量服用對(duì)乙酰氨基酚會(huì)導(dǎo)致心腎、血細(xì)胞損傷和新陳代謝紊亂,其還是引起急性肝功能衰竭最常見(jiàn)的原因[9];兒童使用阿司匹林會(huì)引發(fā)代謝性酸中毒、低血糖、嗜睡、昏迷和痙攣等,嚴(yán)重者甚至死亡。英國(guó)等國(guó)家已正式禁止使用阿司匹林治療兒童發(fā)熱[10-11]。因此,如何在兒童發(fā)熱時(shí)選擇較為安全有效的退熱藥物是兒科醫(yī)護(hù)人員及患兒父母亟待解決的重要課題。

小兒柴桂退熱口服液以《傷寒論》中柴胡桂枝湯為基礎(chǔ),加減部分性味中藥組方,處方含有柴胡、桂枝、葛根、白芍、黃芩、浮萍、蟬蛻7味藥材。柴胡性辛、苦,微寒,疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣;葛根性甘、辛,涼,解肌退熱、生津止渴、升陽(yáng)止瀉;二者同為君藥[1,18]。桂枝辛甘溫煦、溫通經(jīng)脈、解肌散寒,協(xié)同白芍味酸斂陰、益陰斂營(yíng)、緩急止痛;二者合用調(diào)和營(yíng)衛(wèi),為臣藥[12-13]。黃芩降泄燥濕、瀉火解毒、善清邪郁之熱,為佐藥[14-15]。浮萍性辛寒,祛風(fēng)行水、清熱解毒;蟬蛻性甘寒,疏散風(fēng)熱、利咽透疹;二者合用退肺熱,為使藥[15-16]。以上諸藥配伍合用,具有發(fā)汗解表、清里退熱的功效。臨床研究已證實(shí),使用小兒柴桂退熱口服液治療小兒外感發(fā)熱,可明顯解除體內(nèi)郁熱,緩解頭身痛、鼻塞、流涕等癥狀,具有退熱平穩(wěn)持續(xù)、起效快、恢復(fù)正常體溫時(shí)間短、退熱后體溫不回升、安全可靠的特點(diǎn)[17-18];治療小兒上呼吸道感染、外感高熱驚風(fēng)有效安全[15,19]。

常用的發(fā)熱動(dòng)物模型主要有酵母發(fā)熱模型、脂多糖發(fā)熱模型以及2,4-二硝基苯酚發(fā)熱模型[20-21]。酵母屬真菌類(lèi),其致熱成分是全菌體及菌體內(nèi)含的莢膜多糖和蛋白質(zhì);皮下注射可引起注射部位潰爛并引發(fā)劇烈炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱。其主要機(jī)制為破壞單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素之間的動(dòng)態(tài)平衡,誘導(dǎo)發(fā)熱,且發(fā)熱能夠持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間[22-23]。酵母發(fā)熱模型能夠較好地模擬病理狀態(tài)下的發(fā)熱癥狀,適用于解熱作用持久、藥效較為顯著的解熱類(lèi)藥物研究[20],更適合用來(lái)考察清熱藥的解熱作用[24]。

為進(jìn)一步觀察和闡明小兒柴桂退熱口服液的退熱作用和機(jī)制,本研究選擇酵母發(fā)熱模型大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中,皮下注射20%酵母后6 h,大鼠體溫顯著上升,且在隨后的2 h內(nèi)保持上升且趨于穩(wěn)定。使用小兒柴桂退熱口服液灌胃給藥后1～2 h,大鼠體溫持續(xù)降低,表明小兒柴桂退熱口服液具有較好的退熱效果,但作用較為溫和;且高劑量小兒柴桂退熱口服液的退熱效果與臨床常用解熱類(lèi)藥物布洛芬相當(dāng),故其較為適用于治療兒童發(fā)熱性疾病。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體受到外界刺激后產(chǎn)生的病理反應(yīng)。發(fā)熱現(xiàn)象則是炎癥和其他炎癥狀況的繼發(fā)性影響[25]。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)均是重要的內(nèi)源性致熱源,能夠直接或間接增加下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞PGE2、cAMP等發(fā)熱中樞介質(zhì)含量,上調(diào)體溫調(diào)定點(diǎn),導(dǎo)致體溫升高[26-27]。NO存在于多種細(xì)胞及組織中,可參與多種病理生理反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體發(fā)熱時(shí),體內(nèi)IL-1β及NO含量明顯增加[28]。MPO主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等髓系祖細(xì)胞中,能夠抵抗機(jī)體內(nèi)細(xì)菌和真菌蔓延、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),其活性高低可反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的程度及活性[29]。PGE2、cAMP均是下丘腦正向調(diào)節(jié)發(fā)熱中樞介質(zhì)。PGE2相關(guān)通路是致熱源引起發(fā)熱的必經(jīng)共同路徑,能夠通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)體溫調(diào)定,其水平升高是感染性發(fā)熱最主要的誘因之一[27]。在感染和損傷組織中IL-1β大量形成,通過(guò)增加PGE2合成從而觸發(fā)下丘腦升高體溫[30]。cAMP是接近體溫調(diào)節(jié)終末環(huán)節(jié)的發(fā)熱中樞介質(zhì)[31];PGE2可誘導(dǎo)cAMP表達(dá)量顯著增加,并相應(yīng)調(diào)高溫度設(shè)定點(diǎn)[32-33]。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酵母發(fā)熱模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO炎癥介質(zhì)以及下丘腦腦組織PGE2、cAMP的含量均顯著升高,可見(jiàn)模型大鼠血清中產(chǎn)生大量的內(nèi)源性致熱源,其腦組織中也相應(yīng)產(chǎn)生大量的發(fā)熱介質(zhì),二者皆是致熱和誘導(dǎo)發(fā)熱的重要因素。應(yīng)用小兒柴桂退熱口服液干預(yù)后,大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量顯著降低,進(jìn)而顯著下調(diào)下丘腦PGE2、cAMP水平,調(diào)低了體溫調(diào)定點(diǎn),降低了大鼠體溫,即產(chǎn)生退熱作用。

綜上所述,小兒柴桂退熱口服液能夠降低酵母發(fā)熱模型大鼠的體溫升高,其退熱機(jī)制與抑制IL-1β、NO、MOP等炎癥介質(zhì)的生成與釋放,減少下丘腦發(fā)熱中樞介質(zhì)PGE2、cAMP的合成與釋放有關(guān)。小兒柴桂退熱口服液是較為理想的治療小兒發(fā)熱的中藥復(fù)方制劑,值得臨床推廣使用。

利益沖突聲明:無(wú)。