李鴻德 李君麗 廖延標(biāo) 陳茂

隨著人口老齡化進程加快,鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)已然成為了當(dāng)今老年人群中最常見的心臟疾病之一,5年內(nèi)患者發(fā)生心力衰竭、主動脈瓣置換或死亡的風(fēng)險高達80%,是家庭和社會的沉重負擔(dān)。臨床現(xiàn)階段依然缺乏可阻止或延緩CAVD進展的藥物,唯一行之有效的治療方式仍是主動脈瓣植入術(shù)[1]。但多種并發(fā)癥如術(shù)后永久起搏器植入、終身抗凝、再次手術(shù)等問題使得CAVD的治療仍是臨床一大挑戰(zhàn)[2]。因此,剖析CAVD的進展機制并探尋有效的早期緩解其進展的防治新靶點是該領(lǐng)域亟待解決的瓶頸問題,亦是研究重點。

CAVD以脂質(zhì)沉積、慢性炎癥調(diào)控及進展性鈣化為主要病理進程,以主動脈瓣小葉增厚、瓣環(huán)狹窄、左心室機械應(yīng)力增加為主要病理改變。CAVD發(fā)病機制復(fù)雜,目前認(rèn)為血液流體力學(xué)異常改變[3]、細胞外基質(zhì)(ECM)異常重構(gòu)[4]、瓣膜細胞主動成骨分化[5]、遺傳背景差異[6]均與CAVD進展相關(guān)。盡管CAVD與冠心病的危險因素(如高血壓、糖尿病和血脂異常)具有相似性[7-8];但他汀類藥物[9]與依折麥布[10]并不能延緩CAVD的進程,提示CAVD具有更獨特的發(fā)病機制,需要進一步尋找潛在分子靶點。近來研究顯示,鈣黏蛋白(CDH)家族中鈣黏蛋白-11與CAVD的多個進展機制密切相關(guān),如其異常高表達是體外鈣化結(jié)節(jié)形成的必要條件[11]。若誘導(dǎo)CDH-11過表達,可導(dǎo)致ECM重塑,驅(qū)動肌成纖維細胞樣表型出現(xiàn)而誘導(dǎo)主動脈瓣鈣化[12];抑制其表達則可延緩主動脈瓣小葉的增厚與鈣化[11]。CDH-11可通過多種途徑參與CAVD進展,提示其作為CAVD潛在治療靶點的可能性。本文對近年來CDH-11在CAVD中作用的研究進展進行綜述,并對其介導(dǎo)CAVD進展的分子機制進行總結(jié),以揭示其作為CAVD防治靶點的應(yīng)用前景,為后續(xù)研究及臨床治療提供參考。

一、CDH-11在主動脈瓣中的功能概述

1.主動脈瓣與CDH概述

主動脈瓣由瓣膜間質(zhì)細胞(VICs)、瓣膜內(nèi)皮細胞(VECs)與ECM構(gòu)成,解剖結(jié)構(gòu)分為3層:靠近主動脈面的膠原纖維層、中間富含糖胺聚糖的海綿層及心室面富有彈性蛋白的心室層。其中VICs在瓣葉的3層結(jié)構(gòu)中均有分布,而VECs則覆蓋在與血液接觸的瓣葉表面。VECs和VICs的結(jié)構(gòu)完整、細胞間通訊正常對主動脈瓣的組織穩(wěn)態(tài)和功能正常維持至關(guān)重要。

具有維持細胞間連接、細胞間通訊、實體組織穩(wěn)態(tài)作用的CDH-11由5個細胞外結(jié)構(gòu)域、1個單跨膜結(jié)構(gòu)域和1個細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域組成,因缺乏組氨酸-丙氨酸-纈氨酸(HAV)三肽基序和兩種保守的N末端色氨蛋白,被分類為Ⅱ型經(jīng)典CDH,亦為目前已知的唯一可介導(dǎo)細胞-細胞/細胞-基質(zhì)黏附的CDH。CDH-11最早在小鼠成骨細胞中被發(fā)現(xiàn)[13],因此亦被稱作成骨細胞CDH。相關(guān)研究在人的胎盤、腦、肺臟和心臟中檢測到CDH-11的mRNA轉(zhuǎn)錄物,但其在人體的組織分布暫無確切結(jié)論[14]。CDH-11可通過P120連環(huán)蛋白與β-連環(huán)蛋白、α-連環(huán)蛋白結(jié)合,進而與細胞骨架結(jié)合,在相鄰細胞間形成同源二聚體繼而發(fā)揮作用[15],如驅(qū)動肌成纖維細胞樣表型出現(xiàn)、促進間充質(zhì)細胞成骨分化,促進軟骨成骨。

2.CDH-11與VECs

覆蓋于瓣葉表面的VECs能夠感受血流動力學(xué)、轉(zhuǎn)導(dǎo)機械信號,通過改變趨化因子分泌影響VICs信號傳導(dǎo)。功能完好的VECs有助于維持VICs處于靜息狀態(tài),內(nèi)皮功能障礙通常是CAVD的早期跡象。主動脈瓣開放時,心室面VECs處于單向?qū)恿鞯母呒羟袘?yīng)力環(huán)境;瓣膜關(guān)閉時,主動脈面VECs則暴露于振蕩性的低剪切應(yīng)力中。持續(xù)的低振蕩流血流動力學(xué)模式極易導(dǎo)致VECs受損,使其失去抑制VICs向肌成纖維細胞分化的能力,發(fā)生瓣膜鈣化[16]。這可能是鈣化最先發(fā)生于瓣葉主動脈側(cè)的原因。

CDH-11通過連環(huán)蛋白錨定在VECs肌動蛋白細胞骨架上,具有ECM同親型結(jié)合特性,能夠維持內(nèi)皮細胞單層完整性。且在生理情況下,處于單向?qū)恿鳁l件下的心室面VECs中CDH-11表達低于處于低振蕩流模式下的主動脈面VECs。這一特點可能是鈣化起始于主動脈側(cè)的機制,Jonhson等[16]以膠原收縮試驗驗證了這一結(jié)果,與VICs-VICs共培養(yǎng)組相比,主動脈側(cè)VECs-VICs共培養(yǎng)組膠原收縮程度遠強于心室面VECs-VICs共培養(yǎng)組。Butcher等[17]亦發(fā)現(xiàn),作為機械敏感性蛋白,相較于靜態(tài),CDH-11在層流應(yīng)力中表達升高。由此可知,正常情況下CDH-11有助于維持VECs功能完整,其異常高表達則可能與CAVD進程相關(guān)。

3.CDH-11與VICs

VICs是瓣膜中的主要細胞群,靜息狀態(tài)下呈成纖維細胞樣表型,主要分泌適度的ECM維持瓣膜穩(wěn)態(tài)[18],其成為活化表型包括肌成纖維細胞樣VICs及成骨細胞樣VICs驅(qū)動了CAVD進展,并導(dǎo)致其后的瓣膜鈣化和狹窄。如前所述,CDH-11異常高表達的內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)促進了VICs肌成纖維活化程度[16]。據(jù)報道,瓣膜中CDH與整合素相互作用介導(dǎo)的細胞-細胞黏附和細胞-基質(zhì)黏附對于維持瓣膜完整性至關(guān)重要[12]。在瓣膜發(fā)育過程中,胚胎早期時CDH-11可表達于主動脈瓣的分化源頭—心室流出道心內(nèi)膜墊的間充質(zhì)細胞,但在胚胎晚期及出生后則僅表達于瓣膜內(nèi)皮細胞[19]。同樣,健康人群主動脈瓣中也僅在內(nèi)皮細胞中觀察到CDH-11表達,但在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠主動脈瓣鈣化組織和鈣化的人主動脈組織中,則可出現(xiàn)CDH-11的重新表達[19]。

綜上所述,除胚胎發(fā)育早期與CAVD病變的主動脈瓣,CDH-11僅表達于VECs而非VICs;VICs高表達CDH-11往往伴隨主動脈瓣鈣化,這一特殊現(xiàn)象提示CDH-11與CAVD的密切關(guān)聯(lián)性;CDH-11與CAVD如何相關(guān)及其是否可作為CAVD的前景性治療靶點有待進一步研究。

二、異常高表達的CDH-11介導(dǎo)CAVD發(fā)展的分子機制

1.CDH-11通過介導(dǎo)VICs出現(xiàn)肌成纖維細胞樣表型而參與CAVD進程

VICs肌成纖維細胞樣表型出現(xiàn)伴隨膠原沉積和ECM重塑,過量的膠原沉積導(dǎo)致瓣膜組織的纖維化和硬化[20],而CDH-11可介導(dǎo)ECM重塑而參與CAVD進程。Sung等[12]發(fā)現(xiàn)CDH-11過表達的10月齡小鼠主動脈瓣中即表現(xiàn)出大量的膠原沉積、廣泛的ECM重塑及顯著的瓣葉增厚,伴隨著肌成纖維細胞標(biāo)志物的表達增加,其機制為CDH-11/RhoA/Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶(ROCK)/Sox9通路軸的明顯激活;與體內(nèi)研究結(jié)果一致,他們在體外培養(yǎng)的豬主動脈VICs中亦發(fā)現(xiàn)CDH-11過表達可誘導(dǎo)其出現(xiàn)明顯的肌成纖維細胞活化表型,以細胞遷移率和膠原收縮程度增加為特點,伴隨ROCK通路活性增加[12]。甚至,即便不在VICs中上調(diào)CDH-11表達,僅將高表達的CDH-11 VECs與VICs共培養(yǎng),亦可驅(qū)動VICs出現(xiàn)肌成纖維細胞樣表型[16]。上述研究結(jié)果均表明CDH-11異常表達參與了CAVD進程。抑制其表達是否可緩解VICs肌成纖維細胞樣活化而延緩CAVD的進程尚不清楚。Hutcheson等[11]使用小干擾RNA敲低豬VICs中CDH-11后發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)幾乎完全消失。且Clark等[21]以CDH-11抗體阻斷其功能,顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的主動脈瓣增厚。同樣,Wang等[22]在豬主動脈VICs中發(fā)現(xiàn),予CDH-11抗體處理可顯著緩解VICs的肌成纖維樣細胞表型程度,但以小干擾RNA敲低CDH-11水平未得到相似結(jié)論。Bowen等[23]發(fā)現(xiàn)小鼠全身性的CDH-11敲除可抑制RhoA-GTP活性而降低β1整合素表達。Bowler等[24]發(fā)現(xiàn)小鼠CDH-11的敲除不僅可使ECM膠原沉積與炎癥標(biāo)志物(包括IL-6)的表達降低,且肌成纖維細胞及成骨樣細胞水平均減少。除中和抗體外,以U0126(一種特異性MEK1/2抑制劑,可抑制CDH-11表達)降低CDH-11表達亦可減少主動脈瓣中的膠原沉積和ECM重塑[11,24]。綜上可知,眾多研究證實CDH-11可通過介導(dǎo)VICs出現(xiàn)肌成纖維細胞樣表型而參與CAVD進程。

2.CDH-11通過介導(dǎo)VICs出現(xiàn)成骨細胞樣表型而參與CAVD進程

在因瓣膜反流或狹窄而進行外科換瓣手術(shù)的患者中,83%伴有瓣膜鈣化[25]。這與VICs在病理條件下激活時,不僅出現(xiàn)肌成纖維細胞樣表型,也分化為成骨細胞樣表型有關(guān)。CAVD患者的瓣膜中可同時鑒定出成纖維細胞樣VICs及成骨細胞樣VICs,成骨細胞樣VICs主要介導(dǎo)鈣鹽沉積。如上所述,CDH-11高表達可介導(dǎo)VICs向肌成纖維細胞分化而參與CAVD進程,CDH-11表達水平是否與CAVD進程中VICs成骨細胞樣表型有關(guān)有待探究。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),相比非鈣化瓣膜,鈣化人群瓣膜組織中CDH-11基因表達水平上調(diào)約50倍,且CDH-11陽性細胞與肌成纖維細胞和成骨樣細胞標(biāo)志物均高度共定位[11,19]。Sung等[12]研究結(jié)果表明CDH-11可通過激活RhoA信號傳導(dǎo)增加細胞對機械張力的敏感性,進而促進VICs分化為成骨樣細胞,導(dǎo)致主動脈鈣化并出現(xiàn)狹窄,可由主動脈瓣峰值流速增加、成骨標(biāo)志物上調(diào)及硝酸銀/茜素紅染色陽性而證明。Vaidya等[26]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠中CDH-11過表達可通過Rac1調(diào)節(jié)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和定位誘導(dǎo)主動脈瓣狹窄。Hutcheson等[11]報道,CDH-11主要為肌成纖維細胞的聚集和鈣化提供必要的細胞間張力,因而其高表達是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導(dǎo)VICs鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)所必需的。作者認(rèn)為,TGF-β1誘導(dǎo)活化的VICs過表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和CDH-11兩種機械轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,α-SMA的上調(diào)導(dǎo)致細胞易于收縮,同時CDH-11表達增加使細胞間連接更為緊密,二者協(xié)同導(dǎo)致細胞間產(chǎn)生力的不平衡;這種不平衡伴隨主動脈瓣正常形變而加劇,導(dǎo)致較弱細胞發(fā)生凋亡,并產(chǎn)生聚集體、起始鈣化[27]。

不僅在各種病理刺激誘導(dǎo)的CAVD模型中,在遺傳背景所致的CAVD進程中亦有CDH-11的參與。如NOTCH1基因現(xiàn)被認(rèn)為與CAVD的進展密切相關(guān),即便其單個雜合無義突變,亦可因失去對Runx2的抑制功能而導(dǎo)致患者主動脈瓣嚴(yán)重鈣化[28]。NOTCH1+/-突變導(dǎo)致鼠主動脈瓣VICs中CDH-11表達增加,提示NOTCH1基因突變背景下所致CAVD進程與CDH-11存在潛在聯(lián)系[11,29]。隨后Clark等[19]發(fā)現(xiàn)腹腔注射CDH-11的靶向阻斷抗體SYN0012可減輕NOTCH1突變所致的主動脈瓣鈣化,表現(xiàn)為6月齡時小鼠主動脈瓣Movat染色/硝酸銀染色標(biāo)識的瓣膜鈣化更少。綜上所述,高表達的CDH-11可通過介導(dǎo)VICs出現(xiàn)成骨細胞樣表型而參與CAVD進程。

三、靶向CDH-11及其下游機制的CAVD治療前景

1.其他疾病中靶向CDH-11研究進展與治療策略

CDH-11在纖維化疾病包括肺纖維化、肝纖維化、結(jié)腸炎相關(guān)纖維化與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進展中均發(fā)揮重要促進作用[30]。在心臟中,靶向CDH-11亦可抑制JNK、Smad2/3、ERK1/2信號通路激活,阻斷血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心房成纖維細胞分化為肌成纖維細胞[31]。降低CDH-11水平可有效減輕系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肺纖維化等疾病動物模型的癥狀,亦可改善心肌梗死后的結(jié)局[30]。因此,已有CDH-11相關(guān)抗體進行臨床試驗。令人遺憾的是,RG6125(一種抗CDH-11單抗)Ⅱ期臨床試驗因其對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎未顯示出優(yōu)于對照組的療效而終止[32]。

2.CAVD中靶向CDH-11的治療前景

盡管多種分子被發(fā)現(xiàn)參與CAVD進程,目前臨床仍缺乏可延緩CAVD進展的分子靶向藥物,究其原因與分子在模型中的作用穩(wěn)定性及其開發(fā)的藥物能否到達作用位點密切相關(guān)。如前所述,絕大多數(shù)文獻均報道靶向CDH-11降低其表達水平或阻斷其作用均可抑制CAVD進程,因此CDH-11已具備分子在模型中的作用穩(wěn)定性。CDH-11為單次跨膜受體,這一特性使其具有局部靶向治療潛力。如下所述,多種靶向CDH-11的動物治療策略均收效甚佳。

以抗體SYN0012阻斷CDH-11功能,可明顯緩解NOTCH1+/-突變所致主動脈瓣鈣化[21];以MEK1/2抑制劑U0126抑制CDH-11的表達,可減少主動脈瓣中的膠原沉積和ECM重塑[10,23]。除以抗體阻斷CDH-11作用外,基因水平的干預(yù)措施亦可緩解CAVD進程,如小鼠全身性CDH-11敲除降低了其主動脈瓣鈣化程度[23]。由此可見,靶向CDH-11動物治療策略的有效性提示了以其為靶點進行藥物開發(fā)的可行性,及其作為靶點藥物用于臨床試驗?zāi)酥翍?yīng)用于臨床CAVD治療的前景性。

除靶向CDH-11本身,靶向其下游機制的治療策略亦初見效果。CDH-11介導(dǎo)了RhoA、Rac1、ROCK等下游分子的激活,而上述分子的激活參與了CAVD進程[12,26]。ROCK抑制劑Y27632可于體外緩解VICs鈣化[12]。同樣,Rac1抑制劑NSC23766亦可有效阻止CDH-11介導(dǎo)的VICs鈣化,進而在早期阻止主動脈瓣鈣化的發(fā)生[26]。此外,成骨條件下以抑制劑ITX3靶向Trio(一種促進Rac1活化的CDH-11結(jié)合伴侶[33])也可有效預(yù)防CDH-11誘導(dǎo)的VICs鈣化和Runx2表達。基于此,以CDH-11下游分子為靶點同樣具有CAVD治療的前景性。

四、總結(jié)與展望

鑒于現(xiàn)今CAVD是外科主動脈瓣置換術(shù)的主要原因,且臨床缺乏可用的緩解/阻斷性治療藥物,因而潛在前景性治療靶點的開發(fā)及篩選極其重要。眾多被發(fā)掘的潛在靶點中,CDH-11因其在不同學(xué)者及操作條件下均表現(xiàn)出的穩(wěn)定作用(高表達促進主動脈瓣鈣化進程,阻斷其功能則抑制主動脈瓣鈣化進程),因此是一種卓越的藥物開發(fā)、疾病治療靶點。但塞來昔布這類抑制環(huán)氧化物酶-2的非甾體類藥物具有CDH-11的表達抑制性,反而增加豬VICs鈣化程度的現(xiàn)象引人深思[34]。盡管后續(xù)研究證明塞來昔布誘導(dǎo)豬VICs鈣化與藥物CDH-11抑制作用無關(guān),而與糖皮質(zhì)激素效應(yīng)激活MAPK信號有關(guān)[34]?？偨Y(jié)而言,靶向CHD-11治療CAVD雖然前景顯著,但合適、不良反應(yīng)更少、形式更多樣的藥物開發(fā)工作仍亟待解決,在藥物開發(fā)過程中學(xué)者們需深思以規(guī)避臨床試驗中的潛在風(fēng)險。