劉 騫，沈 菁，劉 軍，陳 鑫，程運斌

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所/農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點實驗室，武漢 430064）

0 引言

咪鮮胺(Prochloraz)屬于咪唑類殺菌劑，具有內(nèi)吸性，可抑制菌體內(nèi)麥角甾醇的生物合成，破壞菌體細胞膜功能最終達到殺菌作用，具有廣譜、低毒和長效等優(yōu)點，一般用于防治瓜果蔬菜的葉斑病、炭疽病。咪鮮胺與大多數(shù)殺菌劑、殺蟲劑、除草劑混合使用后的防治病害的效果較好。咪鮮胺的最終降解產(chǎn)物2,4,6-三氯苯酚易被土壤顆粒吸附，不易被雨水沖刷，可抑制土壤中某些真菌，是環(huán)境中重要污染物之一，通過食物的攝入也會威脅人類的健康，因此，檢測咪鮮胺在蔬菜中的殘留量是保障食品安全的有效方法之一[1-5]。現(xiàn)在可用于檢測咪鮮胺及代謝物的方法包括氣相色譜檢測法[6-7]、高效液相色譜檢測法[8-9]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[10-11]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[12-15]。檢測基質(zhì)涉及水果[16-18]，飲料[19-20]，谷物[21]，食用植物油[22]，動物食品[23]。氣相色譜法(GC-ECD)可以測定咪鮮胺及含有2,4,6-三氯苯酚的代謝物之和，其他檢測方法只能檢測咪鮮胺的殘留量或者幾種特定的咪鮮胺代謝物的殘留量，并不能檢測咪鮮胺及其代謝物的總和，而在GB 2763—2021 中對咪鮮胺的殘留定義為咪鮮胺及含有2,4,6-三氯苯酚的代謝物之和[24]。因此本研究采用GC-ECD 法檢測芹菜和生姜中咪鮮胺及其代謝物殘留量的總和，首先通過規(guī)范殘留試驗得到殘留試驗中值，再對在中國農(nóng)作物上登記使用的咪鮮胺進行長期膳食攝入風險評估，其評估結(jié)果可作為制定在芹菜和生姜上安全使用咪鮮胺的規(guī)范方法的參考數(shù)據(jù)和咪鮮胺在芹菜和生姜上的最大殘留限量的試驗數(shù)據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

丙酮、濃鹽酸、二氯甲烷、吡啶鹽酸鹽、濃硫酸（均為分析純）；無水硫酸鈉（使用前在550℃下烘干4 h，在干燥器中冷卻后使用）；石油醚（沸程規(guī)格為30～60℃沸程）；正己烷（色譜純）；咪鮮胺標準品（純度98.8%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司）；6890N 氣相色譜儀，配ECD 檢測器（Agilent，美國）；SENCO?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（申生，中國）；ZNCL-DLS250ML 智能磁力攪拌器RK；以及其他常用實驗設備。

1.2 田間試驗

2017 年的芹菜田間試驗在山西省太原市小店區(qū)北格鎮(zhèn)東蒲村（大棚、含動態(tài)）、北京市通州區(qū)太湖鎮(zhèn)興武林村（大棚）、山東省濟南市高新區(qū)臨港街道大辛村（露地）、湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山街省農(nóng)科院社區(qū)（露地、含動態(tài)）、重慶市九龍坡區(qū)西彭鎮(zhèn)石塔村10 組（露地）、浙江省寧波市海曙區(qū)鄞江鎮(zhèn)梅園村（露地）進行。生姜的田間試驗于2017 年山東省濟南市高新區(qū)臨港街道大辛村、湖北省恩施市六角亭辦事處（含動態(tài)）、重慶市九龍坡區(qū)西彭鎮(zhèn)石塔村10組、浙江省杭州市余杭區(qū)倉前鎮(zhèn)、貴州省貴陽市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn)、廣東省湛江市麻章區(qū)進行。

根據(jù)農(nóng)殘試驗準則的要求設置試驗小區(qū)，每個小區(qū)的面積為15 m2，重復設置3次，以隨機的方式排列，每個小區(qū)之間設置保護帶，同時在另外的區(qū)域設置對照小區(qū)。在芹菜上的打藥方案為：45%咪鮮胺水乳劑推薦使用制劑量為135～202.5 g/hm2；以噴霧法均勻施藥，每公頃兌水量視作物生長狀況，能保證均勻噴施2遍為宜，施藥次數(shù)為3～4 次，施藥間隔為7 d。生姜上的施藥方案為：45%咪鮮胺水乳劑推薦使用制劑量為187.5～300 g/hm2，以噴霧法均勻施藥，每公頃兌水量視作物生長狀況，能保證均勻噴施2遍為宜，施藥次數(shù)為1～2次，施藥間隔為7 d。

1.2.1 消解動態(tài)試驗

（1）芹菜消解動態(tài)

按照有效成分用藥量303.75 g/hm2在芹菜生長至可上市個體一半大小時，噴霧施藥1次，于施藥后2 h、1、3、5、7、10、14、21、30 d分別采集芹菜樣品，另設清水空白對照，處理小區(qū)間設保護帶，采集空白樣品。

（2）生姜消解動態(tài)

按照有效成分用藥量450 g/hm2在姜塊形成早期，噴霧施藥1 次，于施藥后2 h、1、3、5、7、10、14、21、30 d分別采集姜植株樣品。

1.2.2 最終殘留試驗

（1）芹菜最終殘留試驗

在芹菜葉斑病發(fā)病初期，分別以有效成分用藥量202.5、303.75 g/hm2的劑量施藥3、4 次，施藥間隔7 d。距離最后一次施藥5、7、10 d 分別采集相應的芹菜樣品。每個處理小區(qū)之間設置隔離區(qū)域，同時另外設置清水空白對照區(qū)域，采集空白樣品。

（2）生姜最終殘留試驗

在姜炭疽病發(fā)病初期，分別以有效成分用藥量300、450 g/hm2的劑量施藥1、2次，施藥間隔7 d。距離最后一次施藥7、14、21 d分別采集姜的樣品。每個處理小區(qū)之間設置隔離區(qū)，同時另外設置清水空白對照區(qū)域，采集空白樣品。

1.3 樣品前處理方法

芹菜（生姜）樣品先用鹽酸-丙酮提取，在240℃加熱條件下與鹽酸吡啶鹽反應，將樣品中的咪鮮胺及其代謝物全部轉(zhuǎn)化為2,4,6-三氯苯酚，再用硫酸酸洗凈化，收集凈化后的有機相，用無水硫酸鈉對收集的有機相進行干燥，最后用石油醚洗滌有機相并將有機相濃縮至近干，再用正己烷為溶劑定容至2～5 mL（根據(jù)殘留量大小調(diào)整定容體積或者做進一步的稀釋以保證樣品溶液在上機時的濃度在標準曲線范圍內(nèi)），同時按照樣品前處理的方法制作標準曲線和處理添加回收樣品，最后一同上機檢測。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱類型為INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進樣口溫度設置為240℃；檢測器的溫度(ECD)設置為320℃；色譜柱升溫程序：初始溫度150℃保持1 min，以2℃/min 升至180℃，保持2 min，再以40℃/min 升至250℃，保持5 min。

氣體流量設置：柱流量為2 mL/min；隔墊吹掃為3 mL/min；尾吹氣流量為58 mL/min。進樣量為1.0 μL，采用不分流方式進樣。

1.5 計算方法

試樣中咪鮮胺殘留量以質(zhì)量分數(shù)ω計，單位mg/kg，按式(1)計算。

式中，A1表示標準工作溶液中咪鮮胺的峰面積；ρ表示咪鮮胺標準工作溶液的濃度，mg/L；A2表示樣品溶液中咪鮮胺的峰面積；V表示樣品溶液的定容體積，mL；m表示試樣的質(zhì)量，g。

當計算結(jié)果高于1 mg/kg時需保留3位有效數(shù)字，當結(jié)果低于1 mg/kg時需保留2位有效數(shù)字，當結(jié)果在最低檢測濃度以下時，需用“<定量限”表示。

1.6 膳食風險評估

本次試驗以芹菜和生姜2種常見蔬菜的農(nóng)藥殘留暴露途徑為基礎，根據(jù)這2 種蔬菜的規(guī)范殘留試驗數(shù)據(jù)進行慢性風險評估。長期慢性膳食暴露風險按式(2)、(3)計算。

式中NEDI表示國家估計每日攝入量[mg/(kg b.w.)]；STMRi表示第i級農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)范試驗殘留中值(STMR)(mg/kg)；Fi表示不同人群對第i級農(nóng)產(chǎn)品的膳食消費量。

式中RQ表示風險商，ADI表示每千克體重的農(nóng)藥每日允許攝入量[(mg/kg b.w.)]，GB 2763—2021 中咪鮮胺的ADI值為0.01 mg/kg b.w.。

當RQ值小于等于1時，表示其膳食攝入風險是可以接受的，RQ值越小，則其風險越小；當RQ值大于1時，表示有不可接受的膳食攝入慢性風險，RQ值越大，則其風險越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評價

據(jù)依NY/T 788—2018 農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則里農(nóng)藥殘留分析方法的要求評價本方法的有效性[25]。在濃度范圍0.2～40 mg/L內(nèi)，咪鮮胺轉(zhuǎn)化生成的2,4,6-三氯苯酚的峰面積與咪鮮胺的質(zhì)量濃度呈良好的線性關系，線性方程為Area=150682.1Amt-7118.4，相關系數(shù)為r=0.9975。咪鮮胺在芹菜和生姜中的添加回收率結(jié)果如表1所示。咪鮮胺在芹菜中的加標回收實驗的平均回收率在75%～114%之間，相對標準偏差(RSD)在3%～6%之間；咪鮮胺在生姜中的加標回收試驗的平均回收率在77%～87%之間，RSD在3%～13%之間，符合農(nóng)藥殘留分析的要求；以最低添加水平濃度為該方法在芹菜和生姜上的最小檢測濃度，在芹菜上的最小檢測濃度為0.05 mg/kg，在生姜上的最小檢測濃度為0.02 mg/kg。

表1 咪鮮胺在芹菜、絲瓜及生姜中的添加回收試驗結(jié)果

2.2 咪鮮胺在芹菜和生姜中的消解試驗

咪鮮胺在芹菜和生姜植株中的消解方程、相關系數(shù)和半衰期見表2。

表2 咪鮮胺在芹菜和生姜中的消解動態(tài)方程、半衰期及相關系數(shù)

根據(jù)咪鮮胺在芹菜中的消解試驗得到咪鮮胺在芹菜中的殘留消解數(shù)據(jù)，以湖北、山西兩地的消解試驗數(shù)據(jù)擬合的動力學方程表明，咪鮮胺在芹菜中的原始沉積量分別為2.54 mg/kg 和2.83 mg/kg，半衰期分別為6.8 d和6.1 d。消解行為呈現(xiàn)相同的規(guī)律，消解速率比較慢。

根據(jù)咪鮮胺在姜中的消解試驗得到咪鮮胺在姜植株中的殘留消解數(shù)據(jù)，由于在30 d內(nèi)，殘留量基本沒有什么變化，無法擬合為一級動力學方程。

2.3 咪鮮胺及其代謝物在芹菜和生姜中的最終殘留試驗

咪鮮胺及其代謝物在芹菜和生姜中的1年6地殘留規(guī)范試驗的最終殘留結(jié)果如表3所示。

表3 咪鮮胺及其代謝物在芹菜和生姜中的最終殘留試驗結(jié)果

在湖北武漢、山西太原、浙江杭州、北京、山東濟南、重慶，以含咪鮮胺202.5～303.75 g/hm2的量，對芹菜作物施藥3～4次，間隔5 d后，STMR為1.62 mg/kg，殘留最大值為10.4 mg/kg；間隔7 d后，STMR為2.70 mg/kg，殘留最大值為11.4 mg/kg；間隔10 d后，STMR為1.75 mg/kg，殘留最大值為8.83 mg/kg。

在山東濟南、湖北恩施、重慶、貴州貴陽、浙江杭州、廣東湛江，以含咪鮮胺300～450 g/hm2的量，對姜作物施藥1～2次，間隔7 d后，STMR為0.08 mg/kg，殘留最大值為0.41 mg/kg；間隔14 d后，STMR值為0.092 mg/kg，殘留最 大值 為0.57 mg/kg；間 隔21 d 后，STMR值為0.04 mg/kg，殘留最大值為0.25 mg/kg。

2.4 膳食攝入風險評估

咪鮮胺的ADI值為0.01 mg/kg b.w.(GB 2763—2021)。根據(jù)咪鮮胺在中國登記使用情況[26]以及居民人均膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查數(shù)據(jù)[27]，結(jié)合本試驗得到的殘留試驗中值進行膳食風險評估，遵循風險最大化原則，芹菜選取采收間隔期7 d 時咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物STMR值2.7 mg/kg，絲瓜選取采收間隔期7 d 時咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物STMR值0.03 mg/kg（STMR值通過湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所/農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點實驗室做的咪鮮胺在絲瓜上的殘留試驗得出），姜選取采收間隔期21 d時咪鮮胺及其代謝產(chǎn)物STMR值0.04 mg/kg 進行膳食風險評估，其他登記作物參考限量值取相應MRL值，首選中國相應的MRL值，如果中國沒有相應的MRL值可依次選取CAC、歐盟或日本等MRL值，咪鮮胺的膳食攝入風險評估見表4。一般人群咪鮮胺的NEDI為0.67331 mg，占日允許攝入量(0.63 mg)的106.9%，大于100%，芹菜中咪鮮胺對膳食攝入風險的貢獻為39.2%，生姜中咪鮮胺對膳食攝入風險的貢獻僅為0.13%，會對一般人群健康造成不可接受的風險。說明咪鮮胺的慢性膳食攝入風險不在安全接受范圍內(nèi)，建議減少咪鮮胺登記的作物種類，或降低咪鮮胺在某種作物上的限量值。在45%咪鮮胺水乳劑防治芹菜葉斑病時，應修改最高制劑用藥量，或減少施藥次數(shù)，重新進行安全評價。

表4 咪鮮胺的膳食攝入風險評估結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗建立了檢測咪鮮胺及其代謝物在芹菜和姜中的殘留量的分析方法，本方法的準確度和精密度都達到檢測農(nóng)藥殘留的要求，此前，檢測咪鮮胺及其代謝物在芹菜和姜中的殘留總量的分析方法未見文獻報道。已報道的檢測方法只能檢測咪鮮胺的殘留量或者幾種特定的咪鮮胺代謝物的殘留量，并不能檢測咪鮮胺及其代謝物的總和。

該試驗主體為田間試驗，作物生長狀況會受到實際天氣情況的影響、采樣環(huán)節(jié)會受到工人操作差異性因素的影響、施用農(nóng)藥環(huán)節(jié)會受到實際天氣情況和施藥工人操作差異等因素的共同影響。因此，這些因素會對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果造成一定的影響，由試驗數(shù)據(jù)得出的試驗規(guī)律可能存在一定程度的偏離。為減小這些因素的影響需要嚴格把控試驗的各個環(huán)節(jié)，剔除極端天氣下的試驗數(shù)據(jù)，必要時還可以建立數(shù)學模型來評價這些影響因素的可接受程度。

本試驗建立了檢測咪鮮胺及其代謝物在芹菜和姜中的殘留量的分析方法，2017年咪鮮胺在湖北和山西兩地的芹菜上的消解動態(tài)試驗結(jié)果顯示，咪鮮胺在芹菜中的原始沉積量分別為2.54 mg/kg和2.83 mg/kg，半衰期分別為6.8 d 和6.1 d，消解行為呈現(xiàn)相同的規(guī)律，消解速率比較慢。2017 年咪鮮胺在湖北姜上的消解動態(tài)試驗結(jié)果顯示，在30 d內(nèi)咪鮮胺在姜植株內(nèi)的殘留量基本沒有變化，無法擬合為一級動力學方程，說明咪鮮胺在姜植株內(nèi)非常穩(wěn)定，沒有明顯的降解。通過規(guī)范殘留試驗得到STMR值，并對在中國農(nóng)作物上登記使用的咪鮮胺進行長期膳食攝入風險評估，評估結(jié)果顯示，咪鮮胺對一般人群的膳食攝入風險概率為106.9%，高于100%時會有一般人群不可接受的健康風險。因此，建議在45%咪鮮胺水乳劑防治芹菜葉斑病時，應修改最高用藥制劑量，或減少施藥次數(shù)重新進行安全評價。本試驗結(jié)果為制定在芹菜和姜上合理使用咪鮮胺的操作規(guī)程和最大殘留限量標準，提供了理論基礎和試驗數(shù)據(jù)。