孫 鑫，崔正勇，李新華，楊在東，劉 穎，孫明柱，張?zhí)煊?，?鵬，宋華東

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，濟(jì)南 250100；2山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司，濟(jì)南 250100；3山東省種子管理總站，濟(jì)南 250100)

0 引言

類胡蘿卜素是指由8個異戊二烯單位組成的碳?xì)浠衔铮ê}卜素）及其氧化衍生物（葉黃素）兩大類色素的總稱[1]，在人類生長發(fā)育過程中具有重要的營養(yǎng)功能[2]。天然存在的類蘿卜素葉黃素是視網(wǎng)膜中黃斑色素的重要組成部分，可以過濾藍(lán)光，防止視網(wǎng)膜受損，預(yù)防白內(nèi)障等眼科疾病[3]。類胡蘿卜素還具有抗氧化性，不僅能有效清除氧自由基延緩衰老、預(yù)防和治療許多由于細(xì)胞或組織內(nèi)過量的氧化自由基所導(dǎo)致疾病的發(fā)生，還能預(yù)防機(jī)體衰老引發(fā)的心血管硬化、冠心病和腫瘤疾病等[4-5]。因此，近年來類胡蘿卜素特別是葉黃素作為功能性食品成分逐漸成為國際研究熱點(diǎn)之一[6-7]。類胡蘿卜素在人體自身無法合成，也很難通過化學(xué)方法合成，因此人體每天須靠攝入一定量外源類胡蘿卜素補(bǔ)充消耗的類胡蘿卜素[8-9]。

普通小麥?zhǔn)鞘澜缟戏植甲顝V、商品率最高的糧食作物，約占全球作物種植面積的17%，為人類提供了大量的碳水化合物和蛋白質(zhì)，也是人類飲食中類胡蘿卜素的重要來源[10]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活質(zhì)量提高，面粉及面制品的營養(yǎng)和外觀品質(zhì)越來越受到重視，并已成為小麥品質(zhì)改良的重要方向[11]。近些年來，全麥面粉和亮黃色面食產(chǎn)品愈發(fā)受到消費(fèi)者喜愛，而小麥面粉的黃色主要來自籽粒中類胡蘿卜素積累，因此類胡蘿卜素含量正成為小麥品種的一個重要品質(zhì)特征，也是小麥產(chǎn)品商業(yè)價值的重要因素[12]。國外有關(guān)小麥類胡蘿卜素含量的研究已有一些報道，但主要集中在一粒小麥和硬粒小麥。一粒小麥中類胡蘿卜素含量最高，為8 μg/g，是硬粒小麥的2～4 倍，普通小麥中含量較低，為0.1～4μg/g[13-15]。而中國對小麥類胡蘿卜素的定量研究還未能深入，僅停留在黃色素含量的分析階段。如果能通過常規(guī)育種的方法，選育出籽粒類胡蘿卜素含量較高的品種，將顯著提升小麥營養(yǎng)價值和商業(yè)價值。因此，開展高類胡蘿卜素含量小麥品種資源篩選及親本材料創(chuàng)新，對于選育高類胡蘿卜素含量特色品種具有重要意義。本試驗(yàn)通過測定不同材料小麥面粉中類胡蘿卜素的含量，分析類胡蘿卜素的主要組分，為培育高類胡蘿卜素含量的小麥品種提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來源于章丘龍山農(nóng)科院試驗(yàn)基地，2020—2021 年同期播種小麥：‘19Q1121’、‘濟(jì)麥22’、‘魯原502’、‘魯原309’、‘魯研128’。常規(guī)田間管理，嚴(yán)防混雜，統(tǒng)一收獲，曬干庫存。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 用Brabender Quandrmat Junior(Brabender Inc.,Duisberg，Germany)磨，按AACC 26-50(1995)方法潤麥和制粉。由于類胡蘿卜素理化性質(zhì)不穩(wěn)定，將面粉樣本儲存于暗光低溫環(huán)境。

1.2.2 樣本前處理 取出低溫保存的凍干樣本，用球磨儀研磨(30 Hz，1 min)至粉末狀；稱取50 mg 研磨后的樣本，加入適量內(nèi)標(biāo)，用含0.01% BHT(g/mL)的正己烷/丙酮/乙醇混合溶液(1:1:2，v/v/v)進(jìn)行提??；室溫下渦旋20 min，重復(fù)提取一次后離心合并上清液；將得到的提取液濃縮后用甲醇/甲基叔丁基醚混合溶液(3:1，v/v)復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，保存于棕色進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 色譜質(zhì)譜采集條件 數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS)。

1.2.4 定性定量分析原理 定量是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitoring，MRM)分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子（母離子），排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分，進(jìn)而進(jìn)行定量分析。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、250、400 μg/mL濃度的類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對應(yīng)定量信號的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)，外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 類胡蘿卜素含量的測定 將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)一步帶入計(jì)算公式計(jì)算后，最終得到實(shí)際樣本中該物質(zhì)的絕對含量數(shù)據(jù)。樣本中類胡蘿卜素含量的計(jì)算見公式(1)。

公式中各字母含義：c為樣本中積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值(μg/mL)；V為復(fù)溶時所用溶液的體積(μL)；m為稱取的樣本質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性定量結(jié)果

利用軟件Analyst1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與峰型信息，測出不同材料小麥面粉中類胡蘿卜素種類與含量（見表1），其中‘19Q1121’是法國引進(jìn)材料NSA00-0061的早熟突變系，是‘魯原309’的親本材料。由表1 可知，小麥面粉中類胡蘿卜素主要成分有葉黃素、玉米黃質(zhì)類、角黃素、葉黃素棕櫚酸酯、葉黃素二棕櫚酸酯、葉黃素油酸酯等。總類胡蘿卜素含量最高的是‘19Q1121’，其次是‘魯原309’，而類胡蘿卜素中含量最豐富的組分則是葉黃素，其次是葉黃素棕櫚酸酯，玉米黃質(zhì)和葉黃素油酸酯含量相對低。

表1 類胡蘿卜素定性定量結(jié)果 μg/g

2.2 葉黃素定量分析

由測定結(jié)果可知，葉黃素是類胡蘿卜素的主要組分。由圖1 可以看出，‘魯原309’中葉黃素的含量為7.45 μg/g，高‘濟(jì)麥22’、‘魯研128’、‘魯原502’近一倍，作為‘魯原309’親本的法國早熟突變體‘19Q1121’葉黃素含量為10.9 μg/g。由此表明，‘魯原309’葉黃素含量高這一特性來源于法國親本。

圖1 不同小麥材料中葉黃素含量

2.3 玉米黃質(zhì)定量分析

由圖2可以看出，玉米黃質(zhì)在普通小麥‘濟(jì)麥22’、‘魯研128’、‘魯原502’和‘魯原309’中的含量差異不明顯，均為0.2～0.3 μg/g。法國小麥早熟突變系‘19Q1121’玉米黃質(zhì)含量則相對豐富，在0.6 μg/g以上，是其他材料的2～3倍。

圖2 不同小麥材料中玉米黃質(zhì)含量

3 討論與結(jié)論

由本試驗(yàn)表1 結(jié)果可知，小麥面粉中類胡蘿卜素種類繁多，不同種類含量差異明顯。有研究表明[16]小麥中所有基因型的類胡蘿卜素主要是葉黃素，其次是酯類、玉米黃質(zhì)和β胡蘿卜素，而花青素和α-胡蘿卜素的含量幾乎可以忽略不計(jì)。由測定結(jié)果可知類胡蘿卜素組分中含量最多的是葉黃素，其次是葉黃素棕櫚酸酯和玉米黃質(zhì)，這與前人研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)創(chuàng)新之處是首次測定不同小麥品種的類胡蘿卜素含量，并通過分析發(fā)現(xiàn)新培育出的‘魯原309’類胡蘿卜素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通小麥品種，具有顯著的營養(yǎng)利用價值。類胡蘿卜素組分中葉黃素和玉米黃質(zhì)含量最高，這兩類組分在蒸煮和烘焙加工過程中具有更好的穩(wěn)定性、營養(yǎng)損失少[12,17]，可以滿足人們身體對葉黃素的需求，對以后小麥營養(yǎng)專用面粉開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

通過圖1、圖2 分析，類胡蘿卜素同種組分在不同小麥品種中的含量差異明顯，推測這種差異有可能是品種自身基因型不同導(dǎo)致的。利用誘變育種方法對法國小麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳改良，創(chuàng)制早熟突變系，突變材料的品質(zhì)表現(xiàn)在很大程度上決定了育種利用價值[18]。突變系‘19Q1121’是利用誘變育種方法改良法國種質(zhì)‘NSA00-0061’育成的優(yōu)異新材料，其類胡蘿卜素總含量明顯高于國內(nèi)材料，主要功能成分是普通小麥2～3倍。‘魯原309’作為‘19Q1121’后代，類胡蘿卜素含量明顯高于其他普通小麥?！斞?28’也具有法國小麥種質(zhì)的遺傳背景，其類胡蘿卜素含量相對于‘濟(jì)麥22’與‘魯原502’略高，因此用誘變改良后的法國小麥培育高類胡蘿卜素含量新品種的方法是可行的。

本試驗(yàn)測得‘魯原309’是葉黃素含量最高的品種，相對于其他材料其面粉和面制品具有大眾喜歡的亮黃色，具有良好的市場前景。法國小麥種質(zhì)大多含有麥谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基[19]，突變系‘19Q1121’還為‘魯原309’提供了麥谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基5+10，使其各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)達(dá)到中強(qiáng)筋水平。由此，可以利用誘變育種與常規(guī)育種相結(jié)合的方法改良法國小麥種質(zhì)，培育出更多優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)新品種。